JP2509410B2 - 組換えＩｇＡ−プロテア―ゼの製法、組換えＤＮＡ、組換えベクタ―、細胞 - Google Patents
組換えＩｇＡ−プロテア―ゼの製法、組換えＤＮＡ、組換えベクタ―、細胞Info
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- JP2509410B2 JP2509410B2 JP4002851A JP285192A JP2509410B2 JP 2509410 B2 JP2509410 B2 JP 2509410B2 JP 4002851 A JP4002851 A JP 4002851A JP 285192 A JP285192 A JP 285192A JP 2509410 B2 JP2509410 B2 JP 2509410B2
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- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｅ．コリー封入体か
ら、ＩｇＡ−プロテアーゼを製造する方法に関する。
ら、ＩｇＡ−プロテアーゼを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトの粘膜上で生長する種々の病源細菌
（例えばネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属のもの例
えばネイセリア・ゴノロエアエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｏｈ
ｏｅａｅ）及びネイセリア・メニンギチジス（Ｎ．ｍｅ
ｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）又はヘモフィルス（Ｈａｅｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ）属例えばヘモフィルス・インフルエンザ
（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）は、ヒトＩｇＡ１に関し
て特異的であり、ＩｇＡ−蛋白質と称されるプロテアー
ゼを分泌する。この免疫グロブリンＩｇＡ１は、このよ
うな病源微生物の感染に対して防護する分泌的免疫応答
の重要な要素である（概要：Ｋｏｒｎｆｅｌｄ及びＰｌ
ａｕｔによるＲｅｆ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３（１９
８１）、５２１−５３４）。このＩｇＡ−プロテアーゼ
と称される蛋白質分解酵素は、例えばポールナール（Ｐ
ｏｈｌｎｅｒ）等により記載されているように（Ｎａｔ
ｕｒｅ３２５（１９８７）、４５８−４６２）、次の認
識配列を切断する： １． Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ→Ｓｅｒ−Ｐｒｏ ２． Ｐｒｏ−Ｐｒｏ→Ｓｅｒ−Ｐｒｏ ３． Ｐｒｏ−Ｐｒｏ→Ａｌａ−Ｐｒｏ ４． Ｐｒｏ−Ｐｒｏ→Ｔｈｒ−Ｐｒｏ ここで→はそれぞれＩｇＡ−プロテアーゼによる切断位
置を意味する。
（例えばネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属のもの例
えばネイセリア・ゴノロエアエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｏｈ
ｏｅａｅ）及びネイセリア・メニンギチジス（Ｎ．ｍｅ
ｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）又はヘモフィルス（Ｈａｅｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ）属例えばヘモフィルス・インフルエンザ
（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）は、ヒトＩｇＡ１に関し
て特異的であり、ＩｇＡ−蛋白質と称されるプロテアー
ゼを分泌する。この免疫グロブリンＩｇＡ１は、このよ
うな病源微生物の感染に対して防護する分泌的免疫応答
の重要な要素である（概要：Ｋｏｒｎｆｅｌｄ及びＰｌ
ａｕｔによるＲｅｆ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３（１９
８１）、５２１−５３４）。このＩｇＡ−プロテアーゼ
と称される蛋白質分解酵素は、例えばポールナール（Ｐ
ｏｈｌｎｅｒ）等により記載されているように（Ｎａｔ
ｕｒｅ３２５（１９８７）、４５８−４６２）、次の認
識配列を切断する： １． Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ→Ｓｅｒ−Ｐｒｏ ２． Ｐｒｏ−Ｐｒｏ→Ｓｅｒ−Ｐｒｏ ３． Ｐｒｏ−Ｐｒｏ→Ａｌａ−Ｐｒｏ ４． Ｐｒｏ−Ｐｒｏ→Ｔｈｒ−Ｐｒｏ ここで→はそれぞれＩｇＡ−プロテアーゼによる切断位
置を意味する。
【０００３】前記ＩｇＡ−プロテアーゼは、周辺細胞質
内への移転のためのＮ−末端信号配列及び引続き周辺細
胞質の媒体中への分泌を可能にするＣ−末端ヘルパー蛋
白質−部分を有する分泌蛋白質である。
内への移転のためのＮ−末端信号配列及び引続き周辺細
胞質の媒体中への分泌を可能にするＣ−末端ヘルパー蛋
白質−部分を有する分泌蛋白質である。
【０００４】ネイセリアからのＩｇＡ−プロテアーゼの
Ｅ．コリー中でのクローニング及び表現は、例えばＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ ７９（１９８２）、７８８１−７８８５
及びＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４）、１５９６−１６０
１に記載されている。
Ｅ．コリー中でのクローニング及び表現は、例えばＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ ７９（１９８２）、７８８１−７８８５
及びＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４）、１５９６−１６０
１に記載されている。
【０００５】しかしながら、この公知方法によるＩｇＡ
−プロテアーゼの取得の欠点は、ＩｇＡ−プロテアーゼ
−遺伝子で形質転換されたＥ．コリー細胞の僅かな生産
性及び活力度であり、これにより、ＩｇＡ−プロテアー
ゼの非常に僅かな収量のみが生じることである。
−プロテアーゼの取得の欠点は、ＩｇＡ−プロテアーゼ
−遺伝子で形質転換されたＥ．コリー細胞の僅かな生産
性及び活力度であり、これにより、ＩｇＡ−プロテアー
ゼの非常に僅かな収量のみが生じることである。
【０００６】
【発明が解決しょうとする課題】ＩｇＡ−プロテアーゼ
は、遺伝子技術で得られた融合蛋白質の分解のための蛋
白質分解酵素として高い重要性を有する（ＷＯ ９１／
１１５２０参照）ので、従来技術の欠点を少なくとも部
分的に排除するＩｇＡ−プロテアーゼの冨化法に関する
多大の需要が存在する。
は、遺伝子技術で得られた融合蛋白質の分解のための蛋
白質分解酵素として高い重要性を有する（ＷＯ ９１／
１１５２０参照）ので、従来技術の欠点を少なくとも部
分的に排除するＩｇＡ−プロテアーゼの冨化法に関する
多大の需要が存在する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明によるこの課題
は、次の組換えＩｇＡ−プロテアーゼの製法により解決
される： （１）ＩｇＡ−プロテアーゼ−遺伝子を、ＩｇＡ−プロ
テアーゼ−遺伝子のＣ−末端ヘルパー部分に関してコー
ドしているＤＮＡ−範囲がもはや機能的に活性でないよ
うに修飾し、（２）宿主細胞を、（１）工程で修飾され
たＩｇＡ−プロテアーゼ−遺伝子又はこの修飾された遺
伝子を含有するベクターで形質転換させ、（３）この修
飾されたＩｇＡ−プロテアーゼ−遺伝子を、形質転換さ
れた宿主細胞中で表現させ、（４）封入体の形で生じる
ＩｇＡ−プロテアーゼを宿主細胞から単離し、かつ
（５）このＩｇＡ−プロテアーゼを、インビトロ（ｉｎ
ｖｉｔｒｏ）活性化により、活性蛋白質に変じる。
は、次の組換えＩｇＡ−プロテアーゼの製法により解決
される： （１）ＩｇＡ−プロテアーゼ−遺伝子を、ＩｇＡ−プロ
テアーゼ−遺伝子のＣ−末端ヘルパー部分に関してコー
ドしているＤＮＡ−範囲がもはや機能的に活性でないよ
うに修飾し、（２）宿主細胞を、（１）工程で修飾され
たＩｇＡ−プロテアーゼ−遺伝子又はこの修飾された遺
伝子を含有するベクターで形質転換させ、（３）この修
飾されたＩｇＡ−プロテアーゼ−遺伝子を、形質転換さ
れた宿主細胞中で表現させ、（４）封入体の形で生じる
ＩｇＡ−プロテアーゼを宿主細胞から単離し、かつ
（５）このＩｇＡ−プロテアーゼを、インビトロ（ｉｎ
ｖｉｔｒｏ）活性化により、活性蛋白質に変じる。
【０００８】意外にも、機能的に活性でないヘルパー部
分を有する（従って、宿主細胞から媒体中へ分泌されな
い）ＩｇＡ−プロテアーゼが、宿主細胞中で、不活性封
入体の中で生じ、この不活性封入体の活性化の後に非常
に高いＩｇＡ−プロテアーゼ収量が得られることが判明
した。次いでこの不活性封入体は、常法で、細胞から単
離でき、引続きインビトロ活性化により活性形に換える
ことができる。
分を有する（従って、宿主細胞から媒体中へ分泌されな
い）ＩｇＡ−プロテアーゼが、宿主細胞中で、不活性封
入体の中で生じ、この不活性封入体の活性化の後に非常
に高いＩｇＡ−プロテアーゼ収量が得られることが判明
した。次いでこの不活性封入体は、常法で、細胞から単
離でき、引続きインビトロ活性化により活性形に換える
ことができる。
【０００９】本発明方法にとって、ＩｇＡ−プロテアー
ゼのＣ−末端ヘルパー部分に関してコードしているＤＮ
Ａ−範囲は、もはや機能的活性ではないことが重要であ
る。このことは、例えば、ヘルパー部分に関してコード
しているＤＮＡ−範囲の部分的又は完全な欠失により実
施することができる。ＤＮＡ−フラグメントのこの欠失
は、当業者に公知の方法で、例えば二本鎖又は一本鎖の
ＤＮＡのインビトロ突然変異生成によるか又は適当な制
限酵素を用いる切断及びヘルパー部分の範囲からの制限
酵素の除去により行なうことができる。ＩｇＡ−プロテ
アーゼ−遺伝子のこのような修飾のもう１つの可能性
は、ヘルパー部分に関してコードしているＤＮＡ範囲内
でのインビトロ突然変異生成の実施であり、これによ
り、ここで、ＩｇＡ−プロテアーゼ−遺伝子の表現時
に、ヘルパー部分の完全な翻訳を阻止する翻訳停止コド
ン１個以上が導入される。
ゼのＣ−末端ヘルパー部分に関してコードしているＤＮ
Ａ−範囲は、もはや機能的活性ではないことが重要であ
る。このことは、例えば、ヘルパー部分に関してコード
しているＤＮＡ−範囲の部分的又は完全な欠失により実
施することができる。ＤＮＡ−フラグメントのこの欠失
は、当業者に公知の方法で、例えば二本鎖又は一本鎖の
ＤＮＡのインビトロ突然変異生成によるか又は適当な制
限酵素を用いる切断及びヘルパー部分の範囲からの制限
酵素の除去により行なうことができる。ＩｇＡ−プロテ
アーゼ−遺伝子のこのような修飾のもう１つの可能性
は、ヘルパー部分に関してコードしているＤＮＡ範囲内
でのインビトロ突然変異生成の実施であり、これによ
り、ここで、ＩｇＡ−プロテアーゼ−遺伝子の表現時
に、ヘルパー部分の完全な翻訳を阻止する翻訳停止コド
ン１個以上が導入される。
【００１０】本発明方法では、ＩｇＡ−プロテアーゼ−
遺伝子を、修飾された遺伝子によりコードされたＩｇＡ
−プロテアーゼにおけるこのヘルパー部分は、完全に欠
失されているように修飾するのが有利である。このこと
は、例えば、翻訳停止コドン１個以上をＩｇＡ−プロテ
アーゼ−遺伝子内に、直接、Ｃ−末端ヘルパー部分の開
始個所で導入することにより達成できる。このヘルパー
部分の欠失のもう１つの可能性は、例えば例１に記載の
ような適当なプライマーの使用下でのＩｇＡ−プロテア
ーゼｃＤＮＡの所でのＰＣＲ−反応である。
遺伝子を、修飾された遺伝子によりコードされたＩｇＡ
−プロテアーゼにおけるこのヘルパー部分は、完全に欠
失されているように修飾するのが有利である。このこと
は、例えば、翻訳停止コドン１個以上をＩｇＡ−プロテ
アーゼ−遺伝子内に、直接、Ｃ−末端ヘルパー部分の開
始個所で導入することにより達成できる。このヘルパー
部分の欠失のもう１つの可能性は、例えば例１に記載の
ような適当なプライマーの使用下でのＩｇＡ−プロテア
ーゼｃＤＮＡの所でのＰＣＲ−反応である。
【００１１】更に、本発明方法にとっては、このＩｇＡ
−プロテアーゼ−遺伝子を付加的に、ＩｇＡ−プロテア
ーゼのＮ−末端信号部分に関してコードしているＤＮＡ
−範囲はもはや機能的に活性でないように修飾するのも
有利である。このようにして、ＩｇＡ−プロテアーゼの
周辺細胞質内への移行も阻止され、形質転換された宿主
細胞の細胞質ゾル中に不活性封入体が生じる。
−プロテアーゼ−遺伝子を付加的に、ＩｇＡ−プロテア
ーゼのＮ−末端信号部分に関してコードしているＤＮＡ
−範囲はもはや機能的に活性でないように修飾するのも
有利である。このようにして、ＩｇＡ−プロテアーゼの
周辺細胞質内への移行も阻止され、形質転換された宿主
細胞の細胞質ゾル中に不活性封入体が生じる。
【００１２】この信号部分の不活性化は、相応するＤＮ
Ａ−範囲を常法で完全に欠失させることにより行なうの
が有利である。引続き、成熟蛋白質に関してコードして
いるＤＮＡ−範囲から場合により失なわれたＤＮＡ−配
列を、合成オリゴヌクレオチドの遺伝子技術的導入によ
り再び充填させることができる。しかしながらこの信号
部分の欠失は、例えば例１に記載のような適当なプライ
マーの使用下でのＰＣＲ−反応によって行なうこともで
きる。
Ａ−範囲を常法で完全に欠失させることにより行なうの
が有利である。引続き、成熟蛋白質に関してコードして
いるＤＮＡ−範囲から場合により失なわれたＤＮＡ−配
列を、合成オリゴヌクレオチドの遺伝子技術的導入によ
り再び充填させることができる。しかしながらこの信号
部分の欠失は、例えば例１に記載のような適当なプライ
マーの使用下でのＰＣＲ−反応によって行なうこともで
きる。
【００１３】本発明方法のための宿主細胞としては、真
核細胞有利にＥ．コリー細胞を使用するのが有利であ
る。更に、宿主細胞を誘導可能なプロモータのコントロ
ール下に存在するＩｇＡ−プロテアーゼに関してコード
しているＤＮＡ−配列で形質転換させるのが有利であ
る。好適な誘導可能なプロモータの例は、ｔａｃ、ｌａ
ｃ又はｔｒｐ−プロモータ又は他の類似のプロモーター
であり、これらは、分子生物学の分野の当業者に公知で
ある。
核細胞有利にＥ．コリー細胞を使用するのが有利であ
る。更に、宿主細胞を誘導可能なプロモータのコントロ
ール下に存在するＩｇＡ−プロテアーゼに関してコード
しているＤＮＡ−配列で形質転換させるのが有利であ
る。好適な誘導可能なプロモータの例は、ｔａｃ、ｌａ
ｃ又はｔｒｐ−プロモータ又は他の類似のプロモーター
であり、これらは、分子生物学の分野の当業者に公知で
ある。
【００１４】本発明方法で製造されたＩｇＡ−プロテア
ーゼは、宿主細胞中に封入体の形で生じる。この封入体
の単離及びインビトロ活性化による活性蛋白質内へのそ
の導入は、任意の、当業者に公知の方法で行なうことが
できる。このような方法の例は、例えば欧州特許（ＥＰ
−Ａ）第３６１４７５号、西ドイツ特許（ＤＥ−Ａ）第
３６１１８１７号、同第３５３７７０８号、国際公開
（ＷＯ）８７／Ｄ２６７３号、イエニケ（Ｊａｅｎｉｃ
ｋｅ，Ｒ）及びルドルフ（Ｒｕｄｏｌｐｈ．Ｒ）（１９
８９）のプロティン・ストラクチャー・ア・プラクティ
カル・アプローチ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｒ
ｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙＰｒｅｓｓ），１９１，ルドルフ・Ｒ（１９９
０）のモダン・メソッズ・イン・プロティン・アンド・
ヌクレイック・アシド・アナリシス（Ｍｏｄｅｒｎ ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃ
ｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ；Ｔｓｃｈｅｓ
ｃｈ．Ｈ．ＷａｌｔｅｒｄｅＧｒｕｙｔｅｒ Ｖｅｒｌ
ａｇ）１４９−１７１；イエニケ Ｒ．（１９８７）、
のＰｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．
４９，１１７に記載されている。
ーゼは、宿主細胞中に封入体の形で生じる。この封入体
の単離及びインビトロ活性化による活性蛋白質内へのそ
の導入は、任意の、当業者に公知の方法で行なうことが
できる。このような方法の例は、例えば欧州特許（ＥＰ
−Ａ）第３６１４７５号、西ドイツ特許（ＤＥ−Ａ）第
３６１１８１７号、同第３５３７７０８号、国際公開
（ＷＯ）８７／Ｄ２６７３号、イエニケ（Ｊａｅｎｉｃ
ｋｅ，Ｒ）及びルドルフ（Ｒｕｄｏｌｐｈ．Ｒ）（１９
８９）のプロティン・ストラクチャー・ア・プラクティ
カル・アプローチ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｒ
ｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙＰｒｅｓｓ），１９１，ルドルフ・Ｒ（１９９
０）のモダン・メソッズ・イン・プロティン・アンド・
ヌクレイック・アシド・アナリシス（Ｍｏｄｅｒｎ ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃ
ｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ；Ｔｓｃｈｅｓ
ｃｈ．Ｈ．ＷａｌｔｅｒｄｅＧｒｕｙｔｅｒ Ｖｅｒｌ
ａｇ）１４９−１７１；イエニケ Ｒ．（１９８７）、
のＰｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．
４９，１１７に記載されている。
【００１５】ＩｇＡ−プロテアーゼのインビトロ活性化
は、可溶化工程及びネイチアリング工程を包含する。こ
のネイチュアリング工程は、この変性された蛋白質をネ
イチュアリング緩衝液中への連続的又は断続的導入によ
り行なうことができる。この場合に、このネイチュアリ
ング工程は、断続的パルスネイチャリング（Ｐｕｌｓｎ
ａｔｕｒｉｅｒｕｎｇ）の形で実施するのが有利であ
る。
は、可溶化工程及びネイチアリング工程を包含する。こ
のネイチュアリング工程は、この変性された蛋白質をネ
イチュアリング緩衝液中への連続的又は断続的導入によ
り行なうことができる。この場合に、このネイチュアリ
ング工程は、断続的パルスネイチャリング（Ｐｕｌｓｎ
ａｔｕｒｉｅｒｕｎｇ）の形で実施するのが有利であ
る。
【００１６】特に、アルギニン０．２〜１モル／ｌ、特
に有利にはアルギニン０．４〜０．８モル／ｌの存在
で、ＩｇＡ−プロテアーゼの活性化のためにこのネイチ
ャリング工程を実施するのが有利である。更に、ｐＨ５
〜９殊に有利に６〜８で再活性化を実施するのが有利で
ある。
に有利にはアルギニン０．４〜０．８モル／ｌの存在
で、ＩｇＡ−プロテアーゼの活性化のためにこのネイチ
ャリング工程を実施するのが有利である。更に、ｐＨ５
〜９殊に有利に６〜８で再活性化を実施するのが有利で
ある。
【００１７】不活性封入体からのＩｇＡ−プロテアーゼ
の再生（Ｒｅｎａｔｕｒｉｅｒｕｎｇ）の際に、活性の
可溶性蛋白質が出発物質及び再生法に応じて、約１０％
から約３０％以上にまで達する収率で生じる。この再生
収率が定量的でないとしても、本発明の方法では、慣用
方法におけるよりも著しく高い活性ＩｇＡ−プロテアー
ゼの収率が得られる。
の再生（Ｒｅｎａｔｕｒｉｅｒｕｎｇ）の際に、活性の
可溶性蛋白質が出発物質及び再生法に応じて、約１０％
から約３０％以上にまで達する収率で生じる。この再生
収率が定量的でないとしても、本発明の方法では、慣用
方法におけるよりも著しく高い活性ＩｇＡ−プロテアー
ゼの収率が得られる。
【００１８】更に、本発明の方法即ち封入体からの活性
化により製造されたＩｇＡ−プロテアーゼも本発明の目
的物である。
化により製造されたＩｇＡ−プロテアーゼも本発明の目
的物である。
【００１９】更に、本発明は、ＩｇＡ−プロテアーゼに
関してコードしていて、組換えＤＮＡの表現の際に、そ
のＣ−末端ヘルパー部分がもはや機能的活性ではなく、
むしろ完全に欠失しているＩｇＡ−プロテアーゼが生じ
るように修飾されている組換えＤＮＡに関する。本発明
の組換えＤＮＡは、付加的に、この組換えＤＮＡの表現
の際に、そのＣ−末端信号部分がもはや機能的に活性で
なく、特に完全に欠失しているＩｇＡ−プロテアーゼが
生じるように修飾されているのが有利である。所望の結
果をもたらすＤＮＡ−範囲の修飾もしくは欠失のための
遺伝子技術的方法は、既に挙げたかもしくは、分子生物
学の分野に通じている当業者には詳細に説明する必要は
ない程度に良く知られている。
関してコードしていて、組換えＤＮＡの表現の際に、そ
のＣ−末端ヘルパー部分がもはや機能的活性ではなく、
むしろ完全に欠失しているＩｇＡ−プロテアーゼが生じ
るように修飾されている組換えＤＮＡに関する。本発明
の組換えＤＮＡは、付加的に、この組換えＤＮＡの表現
の際に、そのＣ−末端信号部分がもはや機能的に活性で
なく、特に完全に欠失しているＩｇＡ−プロテアーゼが
生じるように修飾されているのが有利である。所望の結
果をもたらすＤＮＡ−範囲の修飾もしくは欠失のための
遺伝子技術的方法は、既に挙げたかもしくは、分子生物
学の分野に通じている当業者には詳細に説明する必要は
ない程度に良く知られている。
【００２０】更に、本発明の目的物は、本発明による組
換えＤＮＡのコピー少なくとも１個を有する組換えベク
ターでもある。本発明による組換えＤＮＡは、誘導可能
なプロモーターのコントロール下にこのベクター上に存
在するのが有利である。本発明のベクターは、宿主細胞
の染色体の外に存在していてよい（例えばプラスミド）
か又は宿主細胞のゲノム中に組込まれていてよい（例え
ばＥ．コリー細胞中のバクテリオファージ入）。ベクタ
ーはプラスミドであるのが有利である。
換えＤＮＡのコピー少なくとも１個を有する組換えベク
ターでもある。本発明による組換えＤＮＡは、誘導可能
なプロモーターのコントロール下にこのベクター上に存
在するのが有利である。本発明のベクターは、宿主細胞
の染色体の外に存在していてよい（例えばプラスミド）
か又は宿主細胞のゲノム中に組込まれていてよい（例え
ばＥ．コリー細胞中のバクテリオファージ入）。ベクタ
ーはプラスミドであるのが有利である。
【００２１】更に、本発明は、本発明による組換えＤＮ
Ａ又は本発明による組換えベクターで形質転換されてい
る細胞に関する。この細胞は、真核細胞であり、特に
Ｅ．コリー細胞が有利である。
Ａ又は本発明による組換えベクターで形質転換されてい
る細胞に関する。この細胞は、真核細胞であり、特に
Ｅ．コリー細胞が有利である。
【００２２】
【実施例】次に、配列情報と組み合せた実施例により本
発明を詳説する。
発明を詳説する。
【００２３】ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１は、例１で使用さ
れているプライマーＡを示している。
れているプライマーＡを示している。
【００２４】ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２は、プライマーＢ
を示している。
を示している。
【００２５】ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３は、プライマーＣ
を示している。
を示している。
【００２６】ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．４は、プライマーＤ
を示している。
を示している。
【００２７】プラスミドｐＭＡＣ１をドイツチェ・ザン
ムルング・フュア・ミクロオルガニスメン（Ｄｅｕｓｃ
ｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍｅｎ，ＧｒｉｅｓｅｂａｃｈｓｔｒａＢｅ
８，Ｄ−３４００ Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）（ＤＳＭ）
に、ＤＳＭ６２４１として寄託した。
ムルング・フュア・ミクロオルガニスメン（Ｄｅｕｓｃ
ｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍｅｎ，ＧｒｉｅｓｅｂａｃｈｓｔｒａＢｅ
８，Ｄ−３４００ Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）（ＤＳＭ）
に、ＤＳＭ６２４１として寄託した。
【００２８】例１ 封入体の形のＩｇＡ−プロテアーゼの表現のためのプラ
スミド−構造の製造 封入体としてのＩｇＡ−プロテアーゼの表現のために、
信号配列及びヘルパー配列を有しない蛋白質のコード領
域を次の記載におけるように、強力なプロモーターの後
でクローニングする（Ａｍｉｎｏｓａｅｕｒｅ Ｐｏｓ
ｉｔｉｏｎ ＋１ ｂｉｓ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ９５９，
ＰｏｈｌｎｅｒＪ．ＨａｌｔｅｒＲ．，Ｂｅｙｒｅｕｔ
ｈｅｒ Ｋ，Ｍｅｙｅｒ Ｔ．Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ ３２
５，（１９８７）、４５８−４６２）。
スミド−構造の製造 封入体としてのＩｇＡ−プロテアーゼの表現のために、
信号配列及びヘルパー配列を有しない蛋白質のコード領
域を次の記載におけるように、強力なプロモーターの後
でクローニングする（Ａｍｉｎｏｓａｅｕｒｅ Ｐｏｓ
ｉｔｉｏｎ ＋１ ｂｉｓ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ９５９，
ＰｏｈｌｎｅｒＪ．ＨａｌｔｅｒＲ．，Ｂｅｙｒｅｕｔ
ｈｅｒ Ｋ，Ｍｅｙｅｒ Ｔ．Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ ３２
５，（１９８７）、４５８−４６２）。
【００２９】このために、Ｎ．ゴノロエアエ（Ｎ．ｇｏ
ｎｏｒｒｈｏｅａｅ）からの染色体ＤＮＡ（例えばＭＳ
１１）を単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法、欧
州特許（ＥＰ−Ａ）第０２００３６２号、同第０２０１
１８４号参照）の実施のために使用する。次のプライマ
ーをこのＰＣＲのために使用する：プライマーＡ（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１） ：
ｎｏｒｒｈｏｅａｅ）からの染色体ＤＮＡ（例えばＭＳ
１１）を単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法、欧
州特許（ＥＰ−Ａ）第０２００３６２号、同第０２０１
１８４号参照）の実施のために使用する。次のプライマ
ーをこのＰＣＲのために使用する：プライマーＡ（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１） ：
【００３０】
【化１】
【００３１】プライマーＢ（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．
２）：
２）：
【００３２】
【化２】
【００３３】ＡＴＧ−開始コドン並びにＥｃｏＲＩ−認
識配列（ＧＡＡＴＴＣ）を有するプライマーＡを得るた
めに、Ｅ．コリー中での有効表現のためのＩｇＡ−プロ
テアーゼの最初の５コドンをアミノ酸配列を換えること
なく、最適化させた。
識配列（ＧＡＡＴＴＣ）を有するプライマーＡを得るた
めに、Ｅ．コリー中での有効表現のためのＩｇＡ−プロ
テアーゼの最初の５コドンをアミノ酸配列を換えること
なく、最適化させた。
【００３４】プライマーＢは、ＩｇＡ−プロテアーゼの
Ｂｇｌ II認識配列に対して側生している（ｆｌａｎｋ
ｉｅｒｔ）配列を有する（約アミノ酸位置５５３−５６
１）。こうして得られたＰＣＲ−フラグメント（Ａ／Ｂ
＝約１６５０ｂｐ、ＩｇＡ−プロテアーゼ−遺伝子の
５′−末端領域）を精製し、酵素ＥｃｏＲＩ／Ｂｇｌ I
Iで後切断する。
Ｂｇｌ II認識配列に対して側生している（ｆｌａｎｋ
ｉｅｒｔ）配列を有する（約アミノ酸位置５５３−５６
１）。こうして得られたＰＣＲ−フラグメント（Ａ／Ｂ
＝約１６５０ｂｐ、ＩｇＡ−プロテアーゼ−遺伝子の
５′−末端領域）を精製し、酵素ＥｃｏＲＩ／Ｂｇｌ I
Iで後切断する。
【００３５】ＩｇＡ−プロテアーゼー遺伝子の３′−領
域の供給のために、次のプライマーを用いて第２のＰＣ
Ｒを実施する。
域の供給のために、次のプライマーを用いて第２のＰＣ
Ｒを実施する。
【００３６】プライマーＣ（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．
３）：
３）：
【００３７】
【化３】
【００３８】プライマーＤ（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．
４）：
４）：
【００３９】
【化４】
【００４０】プライマーＣは、プライマーＢのコード領
域（Ｂｇ１ II−切断位置）に相当し、プライマーＤ
は、アミノ酸位置９５２−９５９の配列を、引続く停止
コドン及びＳａＬ Ｉ−認識配列と共に有する。こうし
て得られたＰＣＲ−フラグメント（Ｃ／Ｄ＝１２００ｂ
ｐ）を単離し、酵素Ｂｇｌ II／ＳａＬ Ｉで後切断す
る。
域（Ｂｇ１ II−切断位置）に相当し、プライマーＤ
は、アミノ酸位置９５２−９５９の配列を、引続く停止
コドン及びＳａＬ Ｉ−認識配列と共に有する。こうし
て得られたＰＣＲ−フラグメント（Ｃ／Ｄ＝１２００ｂ
ｐ）を単離し、酵素Ｂｇｌ II／ＳａＬ Ｉで後切断す
る。
【００４１】引続き、フラグメントＡ／Ｂ、フラグメン
トＣ／Ｄ及びベクターｐＫＫ２２３−３（ＤＳＭ３６９
４Ｐ）（これは、予め、酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａＬ Ｉ
で消化し、精製した）を用いて、三−フラグメント−リ
ゲーション（ｄｒｅｉ−Ｆｒａｇｍｅｎｔ−Ｌｉｇｅｔ
ｉｏｎ）を実施する。こうして得られたベクターをＩｇ
Ａ−Ｐｒｏｔ IIIと称し、Ｅ．コリーＫ１２中に導入す
る。
トＣ／Ｄ及びベクターｐＫＫ２２３−３（ＤＳＭ３６９
４Ｐ）（これは、予め、酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａＬ Ｉ
で消化し、精製した）を用いて、三−フラグメント−リ
ゲーション（ｄｒｅｉ−Ｆｒａｇｍｅｎｔ−Ｌｉｇｅｔ
ｉｏｎ）を実施する。こうして得られたベクターをＩｇ
Ａ−Ｐｒｏｔ IIIと称し、Ｅ．コリーＫ１２中に導入す
る。
【００４２】例２（比較例） 慣用法による可溶性ＩｇＡ−プロテアーゼの冨化 ａ）１ ｌ振動培養液からの冨化 出発物質として、プラスミドｐＭＡＣ１（８８７８ｂ
ｐ）で形質転されたＥ．コリーＫ１２−細胞を使用し
た。このプラスミド上には、λ−プロモーターのコント
ロール下にＩｇＡ−プロテアーゼに関して完全にコード
している領域が存在する。このプラスミドは、アンピシ
リン耐性を有する。
ｐ）で形質転されたＥ．コリーＫ１２−細胞を使用し
た。このプラスミド上には、λ−プロモーターのコント
ロール下にＩｇＡ−プロテアーゼに関して完全にコード
している領域が存在する。このプラスミドは、アンピシ
リン耐性を有する。
【００４３】この細胞をＬＢ−培地中、２８℃で１晩培
養し、引続き、ＬＢ−培地で１：１００に稀釈した。次
いで、この培養物を、更に、３７℃で４時間恒温保持し
た。細胞を、遠心分離工程で分離した。培養上澄みを酢
酸セルロース−フィルタを通して滅菌し、トリス／ＨＣ
ｌ ２０ｍモル／ｌ、ｐＨ７．５、ＥＤＴＡ１０ｍモル
／ｌ、１０％グリセリン（緩衝剤Ａ）に対して透析さ
せ、ＳＡＬＶＩＡ毛細管−透析器Ｅ−１５Ｕを用いて、
１／１０の量まで濃縮させた。
養し、引続き、ＬＢ−培地で１：１００に稀釈した。次
いで、この培養物を、更に、３７℃で４時間恒温保持し
た。細胞を、遠心分離工程で分離した。培養上澄みを酢
酸セルロース−フィルタを通して滅菌し、トリス／ＨＣ
ｌ ２０ｍモル／ｌ、ｐＨ７．５、ＥＤＴＡ１０ｍモル
／ｌ、１０％グリセリン（緩衝剤Ａ）に対して透析さ
せ、ＳＡＬＶＩＡ毛細管−透析器Ｅ−１５Ｕを用いて、
１／１０の量まで濃縮させた。
【００４４】第１の精製工程として、トリス／ＨＣｌ
２０ｍモル／ｌ、ｐＨ７．５、ＥＤＴＡ１０ｍモル／ｌ
及び１０％グリセリン中のＤＥＡＥ−セファデックスＡ
−５０でのネガチブ溶離（Ｎｅｇａｔｉｖｅｌｕｔｉｏ
ｎ）を実施した。カラム負荷率（Ｓａｅｕｌｅｎｂｅｌ
ａｄｕｎｇ）は、ゲルマトリックス１ｍｌ当り、蛋白質
０．５ｍｇであった。この分離の際にＩｇＡ−プロテア
ーゼは、流離液中に存在し、大抵のＥ．コリー蛋白質
は、担体に結合される。緩衝液Ａ＋ＮａＣｌ １モル／
ｌを用いるカラムマトリックスの後洗浄により、ＩｇＡ
−プロテアーゼの１０％以下がカラム物質に結合してい
ることが判った。
２０ｍモル／ｌ、ｐＨ７．５、ＥＤＴＡ１０ｍモル／ｌ
及び１０％グリセリン中のＤＥＡＥ−セファデックスＡ
−５０でのネガチブ溶離（Ｎｅｇａｔｉｖｅｌｕｔｉｏ
ｎ）を実施した。カラム負荷率（Ｓａｅｕｌｅｎｂｅｌ
ａｄｕｎｇ）は、ゲルマトリックス１ｍｌ当り、蛋白質
０．５ｍｇであった。この分離の際にＩｇＡ−プロテア
ーゼは、流離液中に存在し、大抵のＥ．コリー蛋白質
は、担体に結合される。緩衝液Ａ＋ＮａＣｌ １モル／
ｌを用いるカラムマトリックスの後洗浄により、ＩｇＡ
−プロテアーゼの１０％以下がカラム物質に結合してい
ることが判った。
【００４５】最後に、カチオン交換体（フラクトゲルＥ
ＭＤ−ＳＯ3 -−６５０Ｍ：登録商標）を通す精製を行な
う。この蛋白質の結合は、トリス／ＨＣｌ ２０ｍモル
／ｌ、ＥＤＴＡ１０ｍモル／ｌ、１０％グリセリン、ｐ
Ｈ７．０中で起こる。次いでｐＨ８．０までの緩衝変更
（Ｕｍｐｕｆｆｅｒｎ）を行なうことができる。
ＭＤ−ＳＯ3 -−６５０Ｍ：登録商標）を通す精製を行な
う。この蛋白質の結合は、トリス／ＨＣｌ ２０ｍモル
／ｌ、ＥＤＴＡ１０ｍモル／ｌ、１０％グリセリン、ｐ
Ｈ７．０中で起こる。次いでｐＨ８．０までの緩衝変更
（Ｕｍｐｕｆｆｅｒｎ）を行なうことができる。
【００４６】溶離は、直線状に上昇性のＮａＣｌ−勾配
液を用いて行ない、この際、ＩｇＡ−プロテアーゼをｐ
Ｈ８．０の緩衝の場合にはＮａＣｌ ０．１モル／ｌの
塩濃度を用い、ｐＨ７．０の緩衝の場合にはＮａＣｌ
０．２モル／ｌを用いて溶離させる。
液を用いて行ない、この際、ＩｇＡ−プロテアーゼをｐ
Ｈ８．０の緩衝の場合にはＮａＣｌ ０．１モル／ｌの
塩濃度を用い、ｐＨ７．０の緩衝の場合にはＮａＣｌ
０．２モル／ｌを用いて溶離させる。
【００４７】バランス： DEAE−セファデックス前の濃縮液 プロテアーゼ３．５
ｍｇ（純度７０％） DEAE−セファデックス後の溶離液 プロテアーゼ２．４
ｍｇ（純度９０％） フラクトゲル−ＥＭＤ−ＳＯ3 -−６５０Ｍの後の溶離液
プロテアーゼ１ｍｇ（純度≧９５％） ｂ）１０ ｌ−醗酵器からのＩｇＡ−プロテアーゼの冨
化出発物質及び精製は例２ａと同様であった。
ｍｇ（純度７０％） DEAE−セファデックス後の溶離液 プロテアーゼ２．４
ｍｇ（純度９０％） フラクトゲル−ＥＭＤ−ＳＯ3 -−６５０Ｍの後の溶離液
プロテアーゼ１ｍｇ（純度≧９５％） ｂ）１０ ｌ−醗酵器からのＩｇＡ−プロテアーゼの冨
化出発物質及び精製は例２ａと同様であった。
【００４８】バランス： ＤＥＡＥ−セファデックス前の濃縮物 ＩｇＡ−プロテ
アーゼ５０ｍｇ（純度５０％） ＤＥＡＥ−セファデックス後の溶離液 ＩｇＡ−プロテ
アーゼ３０ｍｇ（純度６０％） フラクトゲル−ＥＭＤ−ＳＯ3 -−６５０Ｍの後の溶離液
ＩｇＡ−プロテアーゼ１２ｍｇ（純度≧９５％） 例３ 封入体からのＩｇＡ−プロテアーゼの冨化（本発明の方
法） 出発物質は、付加的に、Ｌａｃ−リプレッサーの表現の
ためのＬａｃＩｑ−プラスミドを含有するＥ．コリー細
胞ＤＳＭ３６８９中の構造ＩｇＡ−ＰｒｏｔIII（例
１）であった。
アーゼ５０ｍｇ（純度５０％） ＤＥＡＥ−セファデックス後の溶離液 ＩｇＡ−プロテ
アーゼ３０ｍｇ（純度６０％） フラクトゲル−ＥＭＤ−ＳＯ3 -−６５０Ｍの後の溶離液
ＩｇＡ−プロテアーゼ１２ｍｇ（純度≧９５％） 例３ 封入体からのＩｇＡ−プロテアーゼの冨化（本発明の方
法） 出発物質は、付加的に、Ｌａｃ−リプレッサーの表現の
ためのＬａｃＩｑ−プラスミドを含有するＥ．コリー細
胞ＤＳＭ３６８９中の構造ＩｇＡ−ＰｒｏｔIII（例
１）であった。
【００４９】１ ｌ培養液の培養のために、ＬＢ−培地
５００ｍｌにカナマイシン及びアンピシリン各々５０μ
ｇ／ｍｌを添加した。この培地に、１晩培養物７．５ｍ
ｌを接種すると、ＯＤ550〜０．１が生じた。次いで、
振動（１５０Ｕｐｍ）下に、３７℃で３４時間恒温保持
を行なった。この細胞をＯＤ550〜０．８で、ＩＰＴＧ
５ｍモル／ｌで誘導した。振動（１５０Ｕｐｍ）下に３
７℃で４時間恒温保持の後に、細胞を収獲した。
５００ｍｌにカナマイシン及びアンピシリン各々５０μ
ｇ／ｍｌを添加した。この培地に、１晩培養物７．５ｍ
ｌを接種すると、ＯＤ550〜０．１が生じた。次いで、
振動（１５０Ｕｐｍ）下に、３７℃で３４時間恒温保持
を行なった。この細胞をＯＤ550〜０．８で、ＩＰＴＧ
５ｍモル／ｌで誘導した。振動（１５０Ｕｐｍ）下に３
７℃で４時間恒温保持の後に、細胞を収獲した。
【００５０】ＩＢ−調製：細胞を、遠心分離により収獲
し、トリス−マグネシウム緩衝液（トリス１０ｍモル／
ｌ、ｐＨ８．０、ＭｇＣｌ2１ｍモル／ｌ）１０ｍｌ中
に入れ、リソチーム（０．３ｍｇ／ｍｌ）を用いて溶解
させる。
し、トリス−マグネシウム緩衝液（トリス１０ｍモル／
ｌ、ｐＨ８．０、ＭｇＣｌ2１ｍモル／ｌ）１０ｍｌ中
に入れ、リソチーム（０．３ｍｇ／ｍｌ）を用いて溶解
させる。
【００５１】これを３７℃で１５分間恒温保持し、フレ
ンチ−プレス−通過（１２００ｐｓｉ）を実施する。引
続き、ＤＮＡｓｅ−消化（ＤＮＡｓｅＩ １ｍｇ）を３
７℃で３０分間行なう。
ンチ−プレス−通過（１２００ｐｓｉ）を実施する。引
続き、ＤＮＡｓｅ−消化（ＤＮＡｓｅＩ １ｍｇ）を３
７℃で３０分間行なう。
【００５２】ＮａＣｌ ０．５モル／ｌ ２０ｍｌ、ＥＤ
ＴＡ２０ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０及び２０％トリトンＸ
１００ ３ｍｌを添加し、室温で１０分間恒温保持す
る。
ＴＡ２０ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０及び２０％トリトンＸ
１００ ３ｍｌを添加し、室温で１０分間恒温保持す
る。
【００５３】懸濁液を１５０００ｒｐｍ及び４℃で１０
分間遠心分離する。ペレットをトリス５０ｍモル／ｌ、
ｐＨ８．０、ＥＤＴＡ５０ｍモル／ｌ及び０．５％トリ
トンＸ１００ ３０ｍｌ中に入れ、超音波処理をする。
再び遠心し、再懸濁させかつ超音波処理をする。この操
作を更に２回繰り返す。引続き、遠心分離し、得られた
ペレットをＩＢとして、例３中で使用する。
分間遠心分離する。ペレットをトリス５０ｍモル／ｌ、
ｐＨ８．０、ＥＤＴＡ５０ｍモル／ｌ及び０．５％トリ
トンＸ１００ ３０ｍｌ中に入れ、超音波処理をする。
再び遠心し、再懸濁させかつ超音波処理をする。この操
作を更に２回繰り返す。引続き、遠心分離し、得られた
ペレットをＩＢとして、例３中で使用する。
【００５４】第１表に、１ l−振動培養液中及び１０
ｌ醗酵器中での醗酵に関する結果を明らかにする。
ｌ醗酵器中での醗酵に関する結果を明らかにする。
【００５５】 第 １ 表 醗酵 Ｅ．コリー ＩＢ−物質からの ＩｇＡ−プロテアーゼ 菌株 全蛋白質（ｇ） （％） （ｇ） １ l ＨＢ101 0.125 50-70 0.06-0.09 １０ ｌ Ｋ12Ｃ600 20.8 30-50 6.2-10.4 第１表から、１ ｌ振動培養液からプロテアーゼ６０−
９０ｍｇが封入体（ＩＢ）物質として得られることが明
らかである。これは、約１０％の再生収率で、活性Ｉｇ
Ａ−プロテアーゼ６〜９ｍｇを生じる（慣用方法による
３．５ｍｇに比べる）。
９０ｍｇが封入体（ＩＢ）物質として得られることが明
らかである。これは、約１０％の再生収率で、活性Ｉｇ
Ａ−プロテアーゼ６〜９ｍｇを生じる（慣用方法による
３．５ｍｇに比べる）。
【００５６】１０ ｌ醗酵器から、プロテアーゼ６．２
〜１０．４ｇがＩＢ物質として得られる。１０％再生率
で、これはＩｇＡ−プロテアーゼ６２０〜１０４０ｍｇ
を生じる（慣用の方法でプロテアーゼ５０ｍｇに比べ
る）。
〜１０．４ｇがＩＢ物質として得られる。１０％再生率
で、これはＩｇＡ−プロテアーゼ６２０〜１０４０ｍｇ
を生じる（慣用の方法でプロテアーゼ５０ｍｇに比べ
る）。
【００５７】この結果から、本発明方法により、収率の
上昇が少なくとも２〜３倍（１ ｌ培養液）もしくは２
０〜３０倍（１０ ｌ醗酵器）であることが明白であ
る。
上昇が少なくとも２〜３倍（１ ｌ培養液）もしくは２
０〜３０倍（１０ ｌ醗酵器）であることが明白であ
る。
【００５８】例４ 封入体からのＩｇＡ−プロテアーゼの再生（１ ｌ醗酵
器） 封入体をまず可溶化し、次いで透析させ次いで、その都
度の緩衝液中でネイチャリングした。
器） 封入体をまず可溶化し、次いで透析させ次いで、その都
度の緩衝液中でネイチャリングした。
【００５９】ＩＢ−物質の可溶化： グァニジン／ＨＣｌ（ｐＨ８．５） ６モル／ｌ トリス １ｍモル／ｌ ＥＤＴＡ １ｍモル／ｌ ジチオエリスレイトール（ＤＴＥ） ０．１モル／ｌ 恒温保持：室温で２時間 容量：１０ｍｌ 蛋白質濃度：１０ｍｇ／ｍｌ 可溶化物の透析： グァニジン／ＨＣｌ（ｐＨ３） ６モル／ｌ ＥＤＴＡ １ｍモル／ｌ 時間：１０ ｌ緩衝液に対し室温で１２時間 ネイチャリング緩衝液： １）トリス１００ｍモル／ｌ、ＥＤＴＡ１ｍモル／ｌ、
ＤＴＥ１ｍモル／ｌ、ｐＨ８．５ ２）トリス１００ｍモル／ｌ、ＥＤＴＡ１ｍモル／ｌ、
ＤＴＥ１ｍモル／ｌ、ｐＨ７．５ ３）トリス２０ｍモル／ｌ、ＥＤＴＡ１ｍモル／ｌ、Ｄ
ＴＥ１ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０ ４）Ａｒｇ／ＨＣｌ ０．６モル／ｌ、ＥＤＴＡ１ｍモ
ル／ｌ、ＤＴＥ１ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０ ５）Ａｒｇ／ＨＣｌ ０．６モル／１、ＥＤＴＡ１ｍモ
ル／ｌ、還元グルタチオン（ＧＳＨ）５ｍモル／ｌ／酸
化グルタチオン（ＧＳＳＧ）０．５ｍモル／１、ｐＨ８ パルスネイチャリング： 変性された蛋白質を５つに分け、再生緩衝液中に加え、
この際、個々の添加の間の時間間隔を３０分とし、１パ
ルス当りバッチ中の蛋白質濃度を２０μｇ／ｍｌだけ高
めた。蛋白質最終濃度は最後は１００μｇ／ｍｌであっ
た。
ＤＴＥ１ｍモル／ｌ、ｐＨ８．５ ２）トリス１００ｍモル／ｌ、ＥＤＴＡ１ｍモル／ｌ、
ＤＴＥ１ｍモル／ｌ、ｐＨ７．５ ３）トリス２０ｍモル／ｌ、ＥＤＴＡ１ｍモル／ｌ、Ｄ
ＴＥ１ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０ ４）Ａｒｇ／ＨＣｌ ０．６モル／ｌ、ＥＤＴＡ１ｍモ
ル／ｌ、ＤＴＥ１ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０ ５）Ａｒｇ／ＨＣｌ ０．６モル／１、ＥＤＴＡ１ｍモ
ル／ｌ、還元グルタチオン（ＧＳＨ）５ｍモル／ｌ／酸
化グルタチオン（ＧＳＳＧ）０．５ｍモル／１、ｐＨ８ パルスネイチャリング： 変性された蛋白質を５つに分け、再生緩衝液中に加え、
この際、個々の添加の間の時間間隔を３０分とし、１パ
ルス当りバッチ中の蛋白質濃度を２０μｇ／ｍｌだけ高
めた。蛋白質最終濃度は最後は１００μｇ／ｍｌであっ
た。
【００６０】再生されたＩｇＡ−プロテアーゼの活性測
定のために、分解緩衝液（トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８）５
０ｍモル／ｌ、ＣａＣｌ２１ｍモル／ｌ）中での透析を
行なう。分解基質として、ヒトＩｇＡを使用した。第２
表に、前記ネイチャリング緩衝液（１〜５）の使用によ
り得られる再生物の分解実験（恒温保持：３７℃で６時
間）の結果を示した。
定のために、分解緩衝液（トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８）５
０ｍモル／ｌ、ＣａＣｌ２１ｍモル／ｌ）中での透析を
行なう。分解基質として、ヒトＩｇＡを使用した。第２
表に、前記ネイチャリング緩衝液（１〜５）の使用によ
り得られる再生物の分解実験（恒温保持：３７℃で６時
間）の結果を示した。
【００６１】第２表 本発明の例で単離されたＩｇＡ−プロテアーゼを用いる
ヒトＩｇＡの分解（恒温保持：３７℃で６時間）。透析
の後に得られた単離物は、約５０％までのＩｇＡ−プロ
テアーゼを含有する。
ヒトＩｇＡの分解（恒温保持：３７℃で６時間）。透析
の後に得られた単離物は、約５０％までのＩｇＡ−プロ
テアーゼを含有する。
【００６２】 この第２表から、ＩｇＡ−プロテアーゼは、全ての緩衝
液中で再生できることが明らかである。しかしながら、
アルギニン（Ａｒｇ）−緩衝液中の収率は、アルギニン
なしの場合より１０〜１００倍高い。比較のために、基
質を、精製された可溶化ＩｇＡ−プロテアーゼ（例１）
で、プロテアーゼ：基質の比１：５００で１００％まで
分解した。これから、緩衝液４及び５では、約５０％の
再生収率を測定できる。
液中で再生できることが明らかである。しかしながら、
アルギニン（Ａｒｇ）−緩衝液中の収率は、アルギニン
なしの場合より１０〜１００倍高い。比較のために、基
質を、精製された可溶化ＩｇＡ−プロテアーゼ（例１）
で、プロテアーゼ：基質の比１：５００で１００％まで
分解した。これから、緩衝液４及び５では、約５０％の
再生収率を測定できる。
【００６３】例５ 封入体からのＩｇＡ−プロテアーゼ−再生の最適化とｐ
Ｈ値及びアルギニン濃度との関係 可溶化及び透析は例４と同様。
Ｈ値及びアルギニン濃度との関係 可溶化及び透析は例４と同様。
【００６４】パルスネイチャリング：蛋白質添加を例４
の記載と同様に行なった。
の記載と同様に行なった。
【００６５】１）ｐＨ−値の変動下におけるネイチャリ
ング収率の測定。
ング収率の測定。
【００６６】Ａｒｇ／ＨＣｌ ０．６モル／ｌ ＥＤＴＡ １ｍモル／ｌ ｐＨ４、６、８ ２）アルギニン濃度の変動下におけるネイチャリングＥ
ＤＴＡ １ｍモル／ｌ、ｐＨ８ ＤＴＡ １ｍモル／ｌ Ａｒｇ／ＨＣｌ：０．２、０．４、０．６及び０．８モ
ル／ｌ 引続き、分解緩衝液（トリス／ＨＣｌ ５０ｍモル／
ｌ、ｐＨ８、ＣａＣｌ２１ｍモル／ｌ）の１００倍量に
対する透析を室温で行なった。
ＤＴＡ １ｍモル／ｌ、ｐＨ８ ＤＴＡ １ｍモル／ｌ Ａｒｇ／ＨＣｌ：０．２、０．４、０．６及び０．８モ
ル／ｌ 引続き、分解緩衝液（トリス／ＨＣｌ ５０ｍモル／
ｌ、ｐＨ８、ＣａＣｌ２１ｍモル／ｌ）の１００倍量に
対する透析を室温で行なった。
【００６７】第３表 本発明の例で得られたＩｇＡ−プロテアーゼを用いるヒ
トＩｇＡの分解。透析物は、ＩｇＡ−プロテアーゼ約５
０〜７０％を含有する。分解バッチ内で、基質５０μｇ
を、再生ＩｇＡ−プロテアーゼ１μｇと共に３７℃で６
時間恒温保持した。
トＩｇＡの分解。透析物は、ＩｇＡ−プロテアーゼ約５
０〜７０％を含有する。分解バッチ内で、基質５０μｇ
を、再生ＩｇＡ−プロテアーゼ１μｇと共に３７℃で６
時間恒温保持した。
【００６８】 ｐＨ６〜８及びアルギニン濃度０．６〜０．８モル／ｌ
で、ＩｇＡ−プロテアーゼの最適再生が行なわれる。
で、ＩｇＡ−プロテアーゼの最適再生が行なわれる。
【図１】プライマーＡの配列を示す図。
【図２】プライマーＢの配列を示す図。
【図３】プライマーＣの配列を示す図。
【図４】プライマーＤの配列を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カローラ ドニー ドイツ連邦共和国 シュタルンベルク ヴァルトシュミットシュトラーセ 15 (72)発明者 ライナー ルードルフ ドイツ連邦共和国 ヴァイルハイム フ ェルバーガッセ17 (56)参考文献 ＮＡＴＵＲＥ，325（1987）Ｐ．458− 462
Claims (13)
- 【請求項１】 組換えＩｇＡ−プロテアーゼを製造する
方法において、 （１）ＩｇＡ−プロテアーゼー遺伝子を、ＩｇＡ−プロ
テアーゼ−遺伝子のＣ−末端ヘルパー部分に関してコー
ドするＤＮＡ−範囲がもはや機能的に活性でないように
修飾し、 （２）宿主細胞を、（１）工程で修飾されたＩｇＡ−プ
ロテアーゼ遺伝子又はこの修飾された遺伝子を含有する
ベクターで形質転換させ、 （３）修飾された宿主細胞内でこの形質転換されたＩｇ
Ａ−プロテアーゼ遺伝子を表現させ、 （４）封入体の形で生じるＩｇＡ−プロテアーゼをこの
宿主細胞から単離し、 （５）このＩｇＡ−プロテアーゼを、インビトロ活性化
により、活性蛋白質に変じることを特徴とする、組換え
ＩｇＡ−プロテアーゼの製法。 - 【請求項２】 ＩｇＡ−プロテアーゼを、修飾された遺
伝子の表現により生じるＩｇＡ−プロテアーゼのＣ−末
端ヘルパー部分を完全に欠失しているように修飾する、
請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 ヘルパー部分に関してコードするＤＮＡ
−範囲内に１個以上の翻訳停止コドンを導入するか又
は、ヘルパー部分に関してコードするＤＮＡ−範囲を部
分的又は完全に欠失させる、請求項１又は２記載の方
法。 - 【請求項４】 ＩｇＡ−プロテアーゼ−遺伝子を、付加
的に、ＩｇＡ−プロテアーゼ−遺伝子のＮ−末端信号部
分に関してコードするＤＮＡ−範囲がもはや機能的に活
性でないように修飾する、請求項１から３までのいずれ
か１項記載の方法。 - 【請求項５】 ＩｇＡ−プロテアーゼ−遺伝子を、修飾
された遺伝子の表現により生じるＩｇＡ−プロテアーゼ
のＮ−末端信号部分を完全に欠失させるように修飾す
る、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 宿主細胞として、Ｅ．コリー細胞を使用
する、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】 アルギニン０．１〜１モル／１の存在
で、このネイチャリング工程を実施する、請求項１から
６までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】 組換えＤＮＡの表現時に、そのＣ−末端
ヘルパー部分がもはや機能的に活性でないＩｇＡ−プロ
テアーゼが生じるように修飾されており、付加的に、組
換えＤＮＡの表現時にそのＮ−末端信号部分がもはや機
能的に活性でないＩｇＡ−プロテアーゼを生じるように
修飾されていることを特徴とする、ＩｇＡ−プロテアー
ゼをコードする組換えＤＮＡ。 - 【請求項９】 組換えＤＮＡの表現時に、そのヘルパー
部分を完全に欠失しているＩｇＡ−プロテアーゼを生じ
る、請求項８記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項１０】 組換えＤＮＡの表現時に、その信号部
分を完全に欠失しているＩｇＡ−プロテアーゼを生じ
る、請求項８記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項１１】 請求項８から１０までのいずれかに記
載のＤＮＡのコピー少なくとも１個を含有することを特
徴とする、組換えベクター。 - 【請求項１２】 請求項８から１０までのいずれかに記
載の組換えＤＮＡ又は請求項１１記載の組換えベクター
で形質転換されていることを特徴とする、細胞。 - 【請求項１３】 Ｅ．コリー細胞である、請求項１２記
載の細胞。
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