CN116286903A - 一种核酸酶的基因序列及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种核酸酶的基因序列，该序列为SEQ ID NO.1。本发明还提供了一种标签修饰的信号肽，该序列为SEQ ID NO.2，基因序列为SEQ ID NO.3。在SEQ ID NO.1的N端添加SEQ ID NO.3并构建重组载体，该重组载体转化X33酵母得到高表达的核酸酶。该方法提高了全能核酸酶的产量，简化了纯化工艺，降低了生产成本，对核酸内切酶消化宿主细胞核酸残留提供了技术支持。

Description

一种核酸酶的基因序列及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种全能核酸酶分子的制备方法。
背景技术
核酸残留是生物样本制备中常遇到的问题。生物制品中的重组蛋白药、抗体药、疫苗等产品都是用连续传代的动物细胞株表达生产，虽然经过严格的纯化工艺，但产品中仍有可能残余宿主细胞的DNA片段，这会带来传染性或致癌性风险，如可能携带HIV病毒或Ras癌基因的残留核酸片段。同时，分布在哺乳动物细胞基因组的LINE-1序列可能发挥逆转录转座子作用，从而导致癌基因的激活/抑制。此外，由于微生物来源的基因组DNA富含CpG和非甲基化序列，也增加了重组蛋白药物在体内的免疫源性风险[1-3]。
在核酸残留去除工作中，难点是由于DNA带有大量的电荷易与其他生物大分子结合从而产生聚集(吸附)、包裹作用而难以完全除去。传统的方法均存在低含量核酸残留去除不净、工作量大耗时长的缺陷。
广谱核酸内切酶是一种非特异性核酸内切酶。来源于一种致病菌灵杆菌又称粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，因此只能采用基因工程生产。该酶可降解双链、单链、线状、环状的DNA和RNA，完全将核酸降解成3-5个碱基长度的5'-单磷酸寡核苷酸。因其能高效降解任何形式的DNA和RNA，又被称为“全能核酸酶”。全能核酸酶切效率远高于其他核酸酶，其活性是牛胰DNase I的34倍，葡萄糖球菌核酸酶的6倍。
广谱核酸内切酶在国外被广泛用于新型疫苗和蛋白药物研发和生产，用于下游纯化工艺中去除核酸残留。但商品化的核酸内切酶国内外均是采用大肠杆菌生产，其缺点是产量低，纯化方法复杂，内毒素去除不易，因此价格很高。毕赤酵母作为一个真核单细胞生物，自开发用于重组蛋白表达以来，被广泛用于高密度发酵生产胞外分泌蛋白，有些蛋白产量能达到10g/L。只要找到合适的信号肽，灵杆菌核酸酶将能在毕赤酵母中大量表达并分泌到细胞外而不会对宿主细胞本身产生毒害。
信号肽大多位于初生蛋白N端，也有少量存在于蛋白内部或者C端，长度从15个氨基酸到50个氨基酸不等。信号肽是蛋白胞外分泌表达必不可少的元件，现已有许多研究结果表明，适当改造信号肽能显著提高外源蛋白的分泌表达效率。研究表明，多种外源基因连接上信号肽后，在原核表达系统，如大肠杆菌、L型细菌、芽孢杆菌和乳酸杆菌中等都得到了分泌表达；信号肽也广泛应用于真核表达系统如毕赤酵母和昆虫杆状病毒表达系统中。
[1]Wang Lan,Wang Jun-zhi.Issues on quality control of residual DNAinbiological products.Chinese Journal of New Drugs 2011；20(8)：678-683.
[2]Peden K,Sheng L,Pal A,et al.Biological activity of residual cell-substrate DNA.[J].Developments in Biologicals,2006,123:45-53；discussion 55-73.
[3]Li Sheng-Fowler,Andrew M.Lewis,Keith Peden.Issues associated withresidual cell-substrate DNAin viral vaccines[J].Biologicals,2009,37(3):190-195.
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种核酸酶的基因序列，该序列为SEQ IDNO.1。本发明还提供了一种标签修饰的信号肽，该序列为SEQ ID NO.2，基因序列为SEQ IDNO.3。在SEQ ID NO.1的N端添加SEQ ID NO.3并构建重组载体，该重组载体转化X33酵母得到高表达的核酸酶。
一方面本发明提供了一种核酸酶的基因序列，该序列为SEQ ID NO.1或与该序列具有90％以上同一性的序列。
具体地，根据GeneBank获得全能核酸酶smNuc基因序列(M19495.1)，去掉其信号肽序列，用软件优化其编码密码子获得SEQ ID NO.1。
另一方面，本发明提供了一种标签修饰的信号肽，该序列为SEQ ID NO.2。
具体地，所述的标签为His标签。
又一方面，本发明提供了编码前述的信号肽的基因序列。
具体地，该基因序列为SEQ ID NO.3或与该序列具有90％以上同一性的序列。
所述的具有90％以上同一性的序列指由于一个氨基酸由一个以上的三联体密码编码即密码子的简并性，导致不同的基因序列编码同一种氨基酸的现象。认为与基因SEQID NO.3具有90％以上同一性的序列是可以编码同一种氨基酸的。
又一方面，本发明提供了一种包括核酸酶基因序列的重组载体。
具体地，该重组载体还包括信号肽的基因序列。
所述的载体可以是：质粒、噬菌体、病毒；优选为质粒；进一步优选为pPICZA质粒。
所述的载体的构建方法为：将pPICZA质粒酶切、纯化，与核酸酶基因连接。
又一方面，本发明提供了包括核酸酶基因序列的重组载体的制备方法。
具体地，所述的制备方法中包括：
在核酸酶的基因序列的N端添加信号肽的基因序列获得SEQ ID NO.4；
对SEQ ID NO.4进行PCR扩增得到PCR产物；
PCR产物与质粒构建载体，并将该载体转化到大肠杆菌；
筛选阳性质粒，并测序确认。
进一步具体地，所述的重组载体的构建方法为：质粒载体进行酶切并纯化；将质粒载体的酶切片段与前述的总基因序列连接。
优选地，所述的质粒载体为pPICZA质粒载体。
所述的转化的操作为：取大肠杆菌感受态细胞加入适量前述的重组载体，通过冰浴、热激、冰浴后于培养液中培养。
优选地，所述的重组载体的加入量为：体积不超过5μL。
所述的阳性质粒的筛选方法为：取前述的培养液涂在含有抗生素的固体培养基上过夜培养获得阳性质粒。
优选地，所述的抗生素为博来霉素。
又一方面，本发明提供了一种重组载体的细胞。
所述的细胞可以是用于表达蛋白的基因工程细胞，包括但不限于：植物细胞、动物细胞、细菌、酵母。
优选地，所述的细胞为工程菌。
进一步优选地，所述的工程菌为大肠杆菌或酵母菌。
又一方面，本发明提供了基因序列SEQ ID NO.1在制备降解核酸的酶中的应用。
具体地，所述的核酸为DNA或RNA。
所述的应用通过基因序列SEQ ID NO.1构建重组载体并转化毕赤酵母，在毕赤酵母中高效表达核酸酶实现。
又一方面，本发明提供了一种核酸酶的制备方法。
具体地，所述的制备方法中包括：用基因序列SEQ ID NO.1构建重组载体；
将重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌，诱导核酸酶的表达；回收核酸酶并纯化。
优选地，所述的宿主细胞为毕赤酵母菌株X33。
进一步具体地，所述的转化方法中包括：制备毕赤酵母菌株X33感受态细胞；将重组载体加入X33毕赤酵母感受态细胞中，冰浴、电击、复苏；涂布含抗生素的固体培养基培养得到重组菌株。
所述的核酸酶纯化方法为：层析柱的制备、上样、洗脱、洗脱液透析过夜。
优选地，所述的层析柱为Ni-Sepharose亲和层析柱。
所述的上样样品为重组菌培养液离心后的上清液。
本发明所取得的的技术效果：
本发明提供了一种核酸酶的基因序列，该序列为SEQ ID NO.1。本发明还提供了一种标签修饰的信号肽，该序列为SEQ ID NO.2，基因序列为SEQ ID NO.3。在SEQ ID NO.1的N端添加SEQ ID NO.3并构建重组载体，该重组载体转化X33酵母得到高表达的核酸酶。该方法提高了全能核酸酶的产量，简化了纯化工艺，降低了生产成本，对核酸内切酶消化宿主细胞核酸残留提供了技术支持。
附图说明
图1为12％ SDS-PAGE检测smNuc蛋白酶的分泌表达图。
图1中，M：彩虹245广谱蛋白Marker(PR1920，Solarbio)；1-12：挑取的12个不同的单克隆菌落诱导表达的蛋白上清液样品。
图2为1％琼脂糖电泳检测smNuc蛋白酶分泌上清降解质粒图。
图2中，M：DL2000 marker；1-11:11个不同的单克隆菌落诱导表达的蛋白上清液样品；NC：没有加分泌上清液的负对照质粒样品。
图3为不同洗脱液对smNuc蛋白酶的洗脱情况。
图3中，M：蛋白质标准分子量；1：smNuc蛋白酶上样原液；2：smNuc蛋白酶上样流穿液；3：smNuc蛋白酶上样40mM咪唑冲洗液；4：smNuc蛋白酶上样100mM咪唑冲洗液；5：smNuc蛋白酶上样200mM咪唑洗脱液。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1重组表达质粒pPIC-smNuc的构建
1.1化学合成含有信号肽的全能核酸酶smNuc基因
(1)化学合成全能核酸酶smNuc蛋白的DNA编码序列，根据GeneBank获得全能核酸酶smNuc基因序列(M19495.1)，去掉其信号肽序列，用软件优化其编码密码子获得优化的基因序列SEQ ID NO.1。
(2)在信号肽序列上设计His标签得到SEQ ID NO.2，其编码序列为SEQ ID NO.3；在SEQ ID NO.1的N端添加SEQ ID NO.3，得到的基因序列为SEQ ID NO.4。
(3)化学合成含有信号肽的全能核酸酶smNuc基因SEQ ID NO.4，其氨基酸序列为SEQ ID NO.5。
1.2 PCR扩增化学合成的smNuc基因
扩增引物序：SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.7。
PCR反应体系(50μL)依次加入，如下表所示：
组分 加入体积(μL)
2×高GC的PCR预混合液 25
F引物(50μM) 1
R引物(50μM) 1
smNuc DNA模板(10ng/μL) 1
超纯水 22
PCR扩增程序的设置如下表所示：
Figure BDA0004134581980000051
Figure BDA0004134581980000061
1.3PCR产物的纯化回收
(1)制备1％琼脂糖凝胶(含染料)，将PCR产物样品加入加样孔，100V恒压进行电泳15min；
(2)将目的DNA条带在切胶仪上切下来，放入干净的EP管，根据天根生化科技的通用型DNA纯化回收剂盒(货号DP214-03)纯化回收DNA片段。
1.4质粒载体的构建
将pPICZA质粒载体用EcoR I+Not I酶切，酶切体系(50μL)如下表所示：
组分 加入体积(μL)
pPICZA质粒(100ng/μL) 40
EcoR I(10U/μL) 2
Not I(10u/μL) 2
超纯水 6
37℃酶切3小时，然后加入6×DNA上样缓冲液，进行1％琼脂糖凝胶电泳(含染料)，100V恒压进行电泳15min，然后纯化回收DNA片段，纯化方法如1.3。
通过EasyGeno快速重组克隆试剂盒连接，连接体系如下表所示：
组分 加入体积(μL)
2×易组装混合液 5
smNuc DNA片段 2.5
pPICZA载体酶切片段 2.5
50℃温育15min，然后放置冰上，转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中。转化步骤如下：
取50μL大肠杆菌感受态细胞，加入适量连接产物(体积不得超过5μL)冰浴30min后，42℃热激90s，马上放回冰上，冰浴2min；加400μL LB培养基，于37℃摇床慢摇振荡培养45-60min；取50-100μL涂在含有博来霉素(25μg/mL)的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
1.5筛选阳性质粒pPIC-smNuc
从1.4中的培养皿上挑起若干个单菌落到5mL LB培养基中过夜培养，通过质粒提取试剂盒提取质粒，然后酶切进行鉴定，最后送测序公司测序确认序列正确。
实施例2smNuc蛋白酶的制备
2.1X33酵母感受态细胞的制备及转化
酵母感受态细胞的制备及转化步骤如下：
(1)取一支-80℃管保存的甘油X33酵母菌种于冰盒上，用接种环蘸取少许菌，然后划线培养于YPD固体培养皿上，28℃培养至单克隆菌落形成；
(2)挑取宿主菌接种于20mL无抗YPD培养基中于100mL摇瓶中，28℃，220rpm摇床培养过夜。第二天早上取20mL过夜培养的菌液，接种至用80mL YPD培养基中，28℃，220rpm摇床培养3h后，测定OD600在直至OD600＝1-2(1OD600相当于5×107cell/mL)；
(3)4000rpm离心收集菌体，收集的菌体，8×108个细胞用8mL新鲜配制的LDS缓冲液悬浮，然后室温放置30分钟；
(4)然后4℃，3000g离心2分钟，去上清，加入10mL冰冷的1M山梨醇，重悬菌体(此步骤重复操作3次)，最后将菌体用适量体积的冰冷的1M山梨醇重悬使最终菌密度达到109细胞/mL，将感受态细胞分装至1.5mL无菌EP管中，每管100μL；
(5)将1μg酶切的pPIC-smNuc线性化片段加入到X33毕赤酵母感受态细胞中，轻轻混匀，用移液枪吸出转移到电转杯中底部，立即盖上盖子并冰上放置5分钟。1500v，25μF，200Ω，1mm电击，电击后立即加入1M山梨醇28℃复苏1h，涂布到含有50μg/mL和100μg/mL的博来霉素YPD平板，28℃放置3-4天直至单克隆形成。
2.2检测诱导蛋白表达
挑取单克隆菌落到BMGY培养基中，28℃，220rpm振荡培养36h左右，每天加入1％甲醇诱导培养，连续诱导培养72h，同时取1mL菌液离心收集上清，取20μL上清进行SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况，如图1。结果表明诱导24h后在35kd附近出现明显的目的条带。
2.3诱导smNuc表达的上清液的DNA降解活性检测
取不同单克隆诱导表达的上清2μL，加入3μg质粒，37℃放置5min，琼脂糖凝胶电泳检测质粒降解情况，如图2所示。结果显示有核酸酶表达的菌液上清能完全将质粒消化，说明分泌表达的核酸酶有切割质粒的活性。。
2.4纯化
料液准备：
将200mL甲醇诱导培养72h的菌液，12000rpm，4℃离心10min，收集上清液，用1MNaOH调节pH至7.0，再经0.22μm过滤器过滤。
准备镍离子亲和层析柱：
(1)Ni-Sepharose亲和层析柱准备；
(2)将10mL的Ni-Sepharose亲和层析填料加入1.2cm×30cm的层析柱中；
(3)利用低压层析系统，上清溶液以5mL/min流速上样至Binding-Buffer(20mMTris-HCl，100mM NaCl，5mM咪唑，pH8.0)预平衡的Ni-Sepharose亲和层析柱；
(4)用Binding-Buffer(20mM Tris-HCl，100mM NaCl，5mM咪唑，pH8.0)以5mL/min流速冲洗3个柱体积，至流出液OD280值到达基线；
(5)用Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，50mM咪唑，100mM NaCl，pH8.0)以5mL/min流速冲洗3个柱体积，至流出液OD280值到达基线；
(6)用Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，200mM咪唑，100mM NaCl，pH8.0)以5mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；
(7)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用(20mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH8.0)进行透析过夜。
结果如图3所示通过一步镍柱纯化获得了纯度较高的核酸酶。
实施例3smNuc蛋白酶酶活检测
3.1试剂和设备
鲑鱼精DNA(10mg/mL)，1mL(索莱宝，H1060)；1M Tris-HCl，pH8.0，1mL(索莱宝，T8060)；1M MgCl2，1mL(上海生工，A610328-0500)；0.5M高氯酸，1mL(伟业计量，BWB2340-2016)；水浴锅(欧莱博，HH-2)；紫外分光光度计(上海仪电，L5S)。
酶反应体系(500μL)如下表：
组分 加入体积(μL)
鲑鱼精DNA(10mg/mL) 50
1M Tris-HCl(pH8.0) 25
1M MgCl2 5
无菌去离子水 420
3.2实验步骤
(1)准备好500μL酶反应体系，加入适量酶溶液，37℃水浴锅放置30min；
(2)然后加入0.5mL 0.5M高氯酸溶液，混匀，然后冰上放置30min；
(3)4℃，12000rpm离心10min；
(4)将上清溶液转移到一个新的1.5mL EP管中，检测上清液的A260吸光值。
酶活定义为：在37℃，pH8.0反应条件下，0.5mL反应体系中，在30min内是A260吸光值变化1.0所用的酶量定义为一个活性单位(U)。
经过检测，纯化的smNuc蛋白酶溶液浓度为0.4mg/mL，测定的比酶活为1.1×106U/mg。

Claims (15)

1.一种核酸酶的基因序列，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有90％以上同一性的序列。
2.一种标签修饰的信号肽，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.2。
3.编码权利要求2所述的信号肽的基因序列。
4.根据权利要求3所述的基因序列，其特征在于，该基因序列为SEQ ID NO.3或与SEQID NO.3具有90％以上同一性的序列。
5.一种包括权利要求1所述的核酸酶的基因序列的重组载体。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，还包括权利要求4所述的信号肽的基因序列。
7.一种重组载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在权利要求1所述的核酸酶的基因序列的N端添加权利要求4所述信号肽的基因序列获得SEQ ID NO.4；
(2)对步骤(1)中的SEQ ID NO.4进行PCR扩增得到PCR产物；
(3)PCR产物与质粒构建载体，并将该载体转化到大肠杆菌；
(4)筛选阳性质粒。
8.包括权利要求5-6任一项所述重组载体的细胞。
9.如权利要求8所述的细胞，其特征在于，为工程菌。
10.如权利要求9所述的细胞，其特征在于，为大肠杆菌或酵母菌。
11.权利要求1所述的基因序列在制备降解核酸的酶中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述的核酸为DNA或RNA。
13.一种核酸酶的制备方法，其特质在于，包括以下步骤：
(1)用权利要求5-6任一项所述的的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
(2)培养重组菌，诱导核酸酶的表达；
(3)回收并纯化。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母菌。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母菌株X33。
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CN117384881A (zh) * 2023-09-01 2024-01-12 广州达博生物制品有限公司 一种全能核酸酶及其制备方法

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