CN117384881A - 一种全能核酸酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全能核酸酶及其制备方法，涉及生物技术领域。本发明提供的全能核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明还提供了编码全能核酸酶的核酸序列，如SEQ ID NO:2所示。本发明还提供了全能核酸酶的制备方法，包括(1)构建重组表达质粒；(2)转化酵母菌株，筛选阳性转化子；(3)酵母重组表达菌株发酵；(4)分离纯化发酵液中的全能核酸酶。本发明通过优化核酸酶基因序列和全能核酸酶的制备方法，获得了高纯度、活性强的全能核酸酶，能够满足疫苗等生物制品行业的需求。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种全能核酸酶及其制备方法。
背景技术
全能核酸酶又称为非特异性核酸酶(Nonspecific nuclease，NU)，是一种非特异性核酸内切酶，全能核酸酶是由两条相同的单肽链组成的同源二聚体，能够降解大多数形式的核苷酸，包括单链、双链、线性、环状的DNA和RNA分子，生成3-5个碱基长度的5’-单磷酸寡核苷酸。全能核酸酶来源广泛，在动物、植物、细菌和病毒中均有发现。
生物制品中的残留宿主核酸可能携带病毒或者存在致瘤风险，各国对生物制品的残留核酸量都有严格的控制，目前，已有物理法、层析法等多种方法对核酸进行降解，但是物理法和层析法利用的仪器和设备较多，成本较高，在实际的生产应用中，通常使用全能核酸酶来去除宿主核酸。
中国专利CN110468116A公布了一种全能核酸内切酶的表达纯化方法，包括以下步骤：(1)表达步骤：含目的基因的大肠杆菌在基础培养基生长，并加入诱导剂异丙基-P-D-硫代半乳糖对目的蛋白进行诱导表达；所述目的基因含全能核酸酶序列，且全能核酸酶序列的前端具有编码6xHis标签；所述目的蛋白为包涵体；(2)包涵体变复性：所述步骤(1)得到的包涵体通过稀释变复性获得可溶的有活性的目的蛋白；(3)纯化步骤：目的蛋白通过亲和层析纯化、酶切、反挂，得到高纯度的全能核酸酶。但是该专利中得到的核酸酶的纯度较低，无法满足工业生产的要求。
中国专利CN115322978A中公开了一种全能核酸酶的高密度发酵表达及分离纯化的方法，所述的纯化方法包括以下步骤：S1、菌体构建，构建含全能核酸酶目的基因的质粒，所述的目的基因含全能核酸酶序列，且在该序列的前端具有编码6xHis标签和SUMO标签的序列；S2、发酵表达，将在抗性平板上挑选的单克隆菌株接种至摇瓶培养基生长，待菌浓达到移种要求接种至发酵罐，发酵培养生长，待菌量达到合适浓度，加入诱导剂异丙基-P-D-硫代半乳糖进行诱导表达，且表达的蛋白为可溶表达，待发酵表达结束，收获菌液，离心，收集菌体；S3、发酵菌体预处理，将步骤二得到的菌体在合适的重悬液中重悬，对其进行菌体破碎，确保所处理菌体均已破碎，然后将破碎液离心，去掉沉淀，收集含目的蛋白的上清液；S4、层析纯化，将含目的蛋白的上清液通过亲和层析纯化，SUMO蛋白酶酶切，然后再次通过亲和层析，收取流穿液，既得到的全能核酸酶。
目前，制备的全能核酸酶的纯度较低，为此，本发明提供了一种纯度较高的全能核酸酶及其制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种全能核酸酶及其制备方法，并提供了全能核酸酶的氨基酸序列，本发明的全能核酸酶具有纯度高、活性强的优点，解决了现有技术中全能核酸酶纯度低的问题。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种全能核酸酶，所述的全能核酸酶的氨基酸序列如SEQID NO:3所示。
又一方面，本发明提供了一种核酸，所述的核酸编码上述的全能核酸酶。
优选地，所述的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
又一方面，本发明提供了一种重组表达载体，所述的重组表达载体包含如SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列。
优选地，所述的载体选自pPICZαA、pET-28a、pEZZ18、pTA1529、pINIII-ompA、pPICZ、pE194、pUCX05-bgaB、pHT304、pMK3、pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1、pYAM75P、PNZ8149-usp45中的一种。
进一步优选地，所述的载体为pPICZαA。
又一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞包括上述的重组载体。
优选地，所述的宿主细胞为真核细胞或原核细胞。
进一步优选地，所述的宿主细胞选自大肠杆菌、酵母、HEK293细胞、CHO细胞中的一种。
再进一步优选地，所述的宿主细胞为酵母。
又一方面，本发明提供了一种全能核酸酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建重组表达质粒；
(2)转化酵母菌株，筛选阳性转化子；
(3)酵母重组表达菌株发酵；
(4)分离纯化发酵液中的全能核酸酶。
进一步优选地，步骤(1)中所述的重组表达质粒的构建方法包括以下步骤：
1)以SEQ ID NO:2所示的序列为模板进行PCR扩增，获得目的片段；
2)将目的条带用EcoR I和Sal I双酶切，把酶切产物与载体相连接；
3)把连接产物全部转入到大肠杆菌中，获得重组表达质粒。
进一步优选地，所述的重组表达质粒的构建还包括纯化目的片段的步骤，具体为：将鉴定正确的重组表达质粒进行线性化酶切，通过乙醇沉淀法纯化目的片段。
再进一步优选地，所述的酶切体系包括载体20μg、10×buffer 25μL、Sac I 5μL，加水至250μL。
再进一步优选地，乙醇沉淀法纯化目的片段包括以下步骤：
1)酶切体系加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的pH5.2 NaAc，混匀；
2)-80℃，20分钟沉淀；
3)13200rpm，20min，离心后弃上清；
4)75％乙醇轻轻洗，离心5min弃上清；
5)65度烘箱至无乙醇气味；
6)20μL ddH2O重溶。
进一步优选地，步骤(2)中所述的转化酵母菌株的方法包括电击转化和化学转化。
再进一步优选地，所述的电击转化是指对构建所得的重组表达质粒进行线性化，以电压1.5kV、电容25μF、电阻200Ω电击转化酵母菌株感受态细胞；通过菌落PCR筛选阳性转化子。
更进一步优选地，所述的酵母菌株为毕赤酵母。
进一步优选地，步骤(3)中酵母重组菌株发酵的方法为发酵罐发酵，具体包括以下步骤：
1)菌种活化：将重组工程菌加入到种子活化培养基中，培养；
2)菌种扩大培养：将活化的菌株接种到种子培养基中，培养20-30h；
3)发酵：设置发酵罐温度为28-35℃，起始通气量调为10L/min，搅拌转速设定为300rpm，待温度稳定在28-35℃，溶氧稳定后校正为100％，调节发酵培养基pH至6.0±0.2，将菌种导入罐内，发酵至菌液OD600达到100+后加入甲醇，诱导4-8天后，将发酵液离心，收集菌体沉淀。
再进一步优选地，步骤1)和步骤2)中所述的培养的条件为28℃、220rpm。
再进一步优选地，步骤2)中的接种量为1-5％；更进一步优选地，接种量为2％。
再进一步优选地，步骤3)中所述的发酵罐的温度为28℃。
再进一步优选地，步骤3)中所述的加入甲醇的终浓度为1-5％；更进一步优选地，加入甲醇的终浓度为1％。
再进一步优选地，步骤3)中诱导的时间为4天。
再进一步优选地，步骤3)中离心的条件为常温、4000rpm条件，离心60min。
进一步优选地，步骤(4)中分离纯化发酵液中的全能核酸酶包括以下步骤：
1)溶解菌体：在菌体沉淀中加溶菌缓冲液，混匀，过滤；
2)高压破菌：将过滤后的菌液倒入破碎仪，将泵头内压力提升至1100-1300bar，停止加压，接收破碎后的菌液，将破碎菌液离心，取上清液、弃沉淀；
3)离子交换层析：平衡QFF层析柱，层析系统的A1管道放入样品瓶，软件设置AotuUVzero，设置Injecttion Mack，开始进样，温度为2-8℃；当UV280的数值大于100mAU后，用干净容器收集进样流穿，进样结束后，将A1管道放入阴离子交换缓冲液A瓶中，继续运行层析系统，当UV280的数值降低至500mAU后，停止收集流穿；
4)亲和层析：平衡层析NI柱，层析系统中的A1管道放入样品瓶，软件设置AotuUVzero，设置Injecttion Mack，开始进样，温度2-8℃，进样结束后，A1管道放入亲和缓冲液A瓶中，运行2倍柱体积，设置梯度20％，运行3倍柱体积，设置梯度60％，运行后，观察UV280的数值，收集洗脱峰；
5)透析：将亲和层析洗脱样品加入透析袋，搅拌透析至少4小时，进行过滤，收集核酸酶原液。
再进一步优选地，步骤1)中菌体质量：溶菌缓冲液体积为1:20。
再进一步优选地，步骤2)中离心的条件为10000rpm，4℃离心30分钟。
再进一步优选地，步骤2)中泵头内压力提升至1200bar。
本发明的有益效果为：
本发明通过优化核酸酶基因序列，利用酵母表达系统，成功表达全能核酸酶，经过离子交换层析、亲和层析，获得了高纯度(＞95％)、活性强(比活力＞1.1×106)的全能核酸酶，能够满足疫苗等生物制品行业的需求。经过鲑精DNA消化实验验证，获得的核酸酶能够高效的去除DNA。
附图说明
图1为电泳结果图。
图2为基因优化后与未优化表达结果对比图；
泳道1：蛋白marker；泳道2：未优化单克隆1培养后发酵液上清；泳道3：未优化单克隆1培养后菌体破碎结果；泳道4：泳道3样品重复；泳道5：优化单克隆1培养后发酵液上清；泳道6：优化单克隆1培养后菌体破碎结果；泳道7：泳道6样品重复；8：未优化单克隆2培养后发酵液上清；泳道9：未优化单克隆2培养后菌体破碎结果；泳道10：泳道9样品重复；泳道11：优化单克隆2培养后发酵液上清；泳道12：优化单克隆2培养后菌体破碎结果；泳道13：泳道12样品重复。
图3为QFF和NI纯化结果图。
图4为核酸酶纯化结果图。
图5为核酸酶消化活性验证结果图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。
实施例1
将核酸酶原始基因序列(SEQ ID NO:1)和优化后的基因序列(SEQ ID NO:2)按照以下方式进行构建，获得表达质粒。
重组质粒的构建包括以下步骤：
1、PCR扩增目的序列：
表1.
| 试剂 | 加入量 |
| primerF：(SEQ ID NO:4)/R：(SEQ ID NO:5) | 1μL/1μL |
| Template(核酸酶质粒) | 0.5μL |
| dNTP mix | 5μL |
| MgSO4 | 3μL |
| 10x primer star buffer | 5μL |
| polymerase | 1μL |
| ddH2O | 33.5μL |
PCR循环体系如下：
表2.
扩增完成后进行电泳检测，用1％琼脂糖胶，按照120V，30min电泳条件，8μL样+2μL6x loading的加样量进行电泳。
电泳结果如图1所示。
2、目的条带切胶回收后，用EcoR I和Sal I进行酶切。
10μL酶切体系如下：
表3.
| 试剂 | 加入量 |
| template | 5μL |
| 10x H buffer | 1μL |
| EcoRI/SalI | 0.5μL/0.5μL |
| ddH2O | 3μL |
酶切后放65℃烘箱中灭活20min，然后把酶切产物与pPICZαA载体相连。
10μL连接体系如下：
表4.
| 试剂 | 加入量 |
| 酶切片段 | 4μL |
| 载体 | 1μL |
| 10×buffer | 1μL |
| T4连接酶 | 0.5μL |
| ddH2O | 3.5μL |
16℃水浴锅中连接2h，之后把10μL连接产物全部转入到DH5α中，然后提质粒送测序，进行鉴定，对鉴定正确的质粒进行线性化酶切。
酶切体系如下：
表5.
| 试剂 | 加入量 |
| 载体 | 20μg |
| 10x buffer | 25μL |
| SacⅠ | 5μL |
| ddH2O | X |
| Total | 250μL |
3、通过乙醇沉淀法纯化目的片段：
(1)酶切体系加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的pH5.2 NaAc，混匀；
(2)-80℃，20分钟沉淀；
(3)13200rpm，20min，离心后弃上清；
(4)75％乙醇轻轻洗，13200rpm，离心5min弃上清；
(5)65度烘箱放置5分钟左右，至无乙醇气味；
(6)20μL ddH2O重溶。
4、酵母电转：
取10ug线性化质粒与100ul酵母感受态混匀冰浴，转移至电转杯中，设定电压1.5kV；电容25μF，电阻200Ω。
5、酵母菌落PCR鉴定：
提取酵母基因组，按照上述PCR方式验证构建是否成功，选取阳性克隆送测序进一步确定。
实施例2核酸酶表达结果比较
1、活化
将经过基因优化的核酸酶与未优化的核酸酶按照以下方式同时进行活化：
10mLBMGY+10μL Zeocin，使Zeocin终浓度为100μg/mL，28℃，220rpm进行活化18h。
2、诱导
2％接种量接种到100mL BMMY培养基中进行培养，28℃，220rpm摇菌，每24h添加甲醇至终浓度1％，诱导72h。
3、收集菌体
8000rpm，30min离心后收集菌体。
4、破碎菌体，确定蛋白表达情况
利用高压破碎仪破碎菌体，然后电泳检测基因优化后与未优化的蛋白表达情况。结果如图2所示，从图2中可以看出，序列经过优化，目的蛋白明显表达。
实施例3发酵罐规模化表达全能核酸酶
1、菌种活化
从核酸酶工作种子库取出1支重组菌株，37℃水浴锅融化，融化后将重组菌株加入BMMY培养基中，28℃、220rpm培养。
2、菌种扩大培养
将活化的菌株按照2％的接种量，接种到BMMY培养基中(培养体积按照发酵体积5-10％计算)，28℃、220rpm培养20h以上。
取样用紫外可见分光光度计检测菌液OD600值，待菌液OD600值到15附近可上罐接种。
3、发酵控制
设置发酵罐温度为28℃，起始通气量调为10L/min，搅拌转速设定为300rpm，待温度稳定在28℃，溶氧稳定后校正为100％。
设置pH为6.0，将pH关联氨水蠕动泵，调节发酵培养基pH至6.0±0.2。
接种环中添加无水乙醇，点燃接种环，拧下接种口盖，盖子保持在火焰附近，防止污染，将菌种瓶口在火焰上打开并烧一会，然后迅速将培养好的菌种(上罐按发酵培养基体积的10％进行接种培养，接种时种子液OD600值在15附近)倒入罐内，马上盖回接种口，拧紧后熄灭接种环火焰。
按照下表设定参数：
表6.
注：时间并不固定，以菌的生长状态定，生长阶段保持转速300rpm即可，定时补加补料生长培养基，直至OD到100+，饥饿处理两小时后，补加甲醇诱导培养基。
在主界面点击“开始发酵”，开始发酵。
诱导：
发酵至菌液OD600达到100+后加入甲醇至终浓度为1％，每24h补加一次甲醇。
下罐：
加入诱导剂诱导4天后，即可下罐。将发酵液在常温、4000rpm条件，离心60min，收集菌体沉淀。
4、溶解菌体
4.1将发酵菌倒入干净烧杯中，再用适量溶菌缓冲液(500mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH 7.5，10％甘油)冲洗存放菌体的容器内壁，将黏着的菌体全部冲刷至烧杯内。
4.2往上述烧杯内以最终质量体积比为1：20(菌体质量：溶菌缓冲液体积，如50±5克菌体加入1升溶菌缓冲液)补加溶菌缓冲液，然后使用搅拌器(300-400rpm)进行充分搅拌，至从烧杯外壁目视内容物无可见大颗粒后，可以停止搅拌。
4.3使用破碎仪自带的不锈钢筛网对上述搅拌溶解产物进行过滤，滤后物置于干净烧杯中备用。
5、高压破菌
5.1确认冷却水机的温度已达到4℃附近，则可以开始破菌。
5.2将过滤后的菌液倒入破碎仪的不锈钢漏斗中，将管道出口挂入漏斗，启动泵头，让菌液在不锈钢漏斗和管道内循环，此步骤目的为排出管道内空气。
5.3待菌液充满管道后，顺时针缓慢旋转加压手阀，期间注意观察泵头的压力表数值，将泵头内压力提升至1200bar左右，停止加压。
5.4加压结束后，将管道出口小心转移至干净烧杯内，接收破碎后的菌液。菌液全部通过高压破碎程序为1次破碎，每批次菌液共需要进行4次高压破碎。
高压破碎完毕后，将破碎菌液倒入干净离心杯中，在电子天平上进行配平(误差≤0.1克)，10000rpm，4℃离心30分钟，取上清液、弃沉淀。
6、离子交换层析(QFF柱)
将层析系统的A1管道和B1管道放入注射用水瓶中，运行流速200ml/min，梯度50％，入口设置A1和B1，柱位bypass，P2压力报警上限0.3MPa，出口Outlet1，运行程序，冲洗系统管道1min排除气泡。
6.1平衡QFF层析柱
连接层析柱和层析系统的柱位阀，操作过程注意避免引入气泡。A1管道和B1管道都放入阴离子交换缓冲液B瓶中，运行2倍柱体积。A1管道放入阴离子交换缓冲液A瓶中，软件设置梯度0％B，运行2倍柱体积。
6.2进样与收集
A1管道放入样品瓶，软件设置Aotu UVzero，设置Injecttion Mack，开始进样，上样在层析冷柜内进行，温度为2-8℃。观察UV280的数值变化，当UV280的数值大于100mAU后，用干净容器收集进样流穿，在层析冷柜内收集，温度为2-8℃。进样结束后，将A1管道放入阴离子交换缓冲液A瓶中，继续运行层析系统，持续观察UV280的数值变化，当UV280的数值降低至500mAU后，停止收集流穿。将收集到的流穿样品密封，做好标记，暂存于层析冷柜内持续搅拌备用。
7、亲和层析(NI柱)
将层析系统的A1管道和B1管道放入注射用水瓶中，运行流速200ml/min，梯度50％，入口设置A1和B1，柱位bypass，P2压力报警上限0.3MPa，出口F1，运行程序，冲洗系统管道1min排除气泡。
7.1平衡层析NI柱
软件设置Air sensor 1为在线，连接亲和层析柱和层析系统，操作过程注意避免引入气泡。A1管道和B1管道放入亲和缓冲液B瓶中，设置梯度50％，运行3倍柱体积。A1管道放入亲和缓冲液A瓶中，设置梯度0％，运行3倍柱体积。
7.2进样与洗杂
A1管道放入样品瓶，软件设置Aotu UVzero，设置Injecttion Mack，开始进样，在层析冷柜内进样，温度2-8℃。进样结束后，A1管道放入亲和缓冲液A瓶中，运行2倍柱体积。设置梯度20％，运行3倍柱体积。
7.3洗脱与收集
设置梯度60％，运行后，观察UV280的数值，收集洗脱峰，摇匀后密封并做好标记，暂存于层析冷柜内，纯化结果见图3。
8、透析与保存
在超净工作台内，用移液管将亲和层析洗脱样品加入透析袋，并用透析夹夹紧透析袋上端，悬挂浸没在保存液中(样品体积：保存液体积≈1：20)。将保存液瓶放入层析冷柜中的磁力搅拌器上，搅拌透析，至少4小时后更换保存液，继续搅拌透析至少4小时。透析结束后，将透析袋取出，在超净工作台内打开上端透析夹，用移液管将透析袋内的样品转移至干净容器，使用0.22μm过滤器进行除菌过滤，收集至无菌玻璃瓶内，摇匀后按规定留样并做好标记。留样完毕后立即进入稀配步骤，从冰箱内取出稀配液，在超净工作台内按照体积比1：1加入样品瓶内，并吹打搅拌混匀，直到目视无两相交融观，呈现均一无色透明溶液状态，即为核酸酶原液，检测纯度，并于-20℃冰箱保存，见图4，从图4中可以看出，核酸酶纯度较高，经凝胶成像仪分析，纯度达95％以上。
实施例4核酸酶活力验证
取2μg鲑精DNA，在50μL反应体系(50mM Tris-HCl，0.1mg/mL BSA，1mM MgCl2)中分别加入不同含量的核酸酶(5U、3U、1U、0.5U、0.2U)，室温下反应30min，1％琼脂糖胶检测结果，结果如图5所示，从图5中可以看出，核酸酶对DNA具有较强的消化能力。按照以下方法测定核酸酶比活力，比活＞1.1×106。
1、溶液配制
1.1溶液A
根据所需的体积，按照配方称取试剂，加入配置体积90％的超纯水，调节pH 8.0，定容至目标体积，装入无菌的容器中。
表7.
| 名称 | 每升用量 |
| 1mM MgCl2 | 0.2033g |
| 0.1mg/mL BSA | 100mg |
| 50mM Tris-HCl | 6.057g |
1.2溶液B
用溶液A将初始浓度为10mg/mL的鲑精DNA溶液稀释为1mg/mL(十倍稀释：1mL10mg/mL+9mL溶液A)。
1.3高氯酸溶液(4％)
取5.63mL 70-72％的高氯酸溶液用灭菌超纯水稀释到100mL。
1.4酶溶液
根据估算将待测样品用溶液A稀释为万分之一U/μL。(例如成品，取1.6μL待测样品加入10mL溶液A中，充分混匀，再从其中取1mL加入4mL溶液A中，混匀，待测样品即稀释了31250倍)。
2、实验步骤
溶液A、溶液B、4％高氯酸溶液需提前预冷。
2.1样品制备待测溶液：0.5mL溶液B+0.025mL酶溶液，混合均匀；
空白溶液：0.5mL溶液B+0.025mL溶液A，混合均匀。
2.2反应
(1)将样品混合均匀后，37℃水浴加热30min。
(2)加入0.5mL高氯酸溶液(4％)，混合均匀，冰浴30min。
(3)4℃、14000rpm离心6min，取上清用紫外分光光度计检测260nm处的吸光度值，每份样品重复检测3次取平均值。
3、酶活计算
式中：ΔA＝吸光度的变化值；T＝37℃孵育的时间30min；V＝37℃孵育的体积；2＝检测时的稀释系数；F＝待测样品稀释倍数；t＝冰浴时间30min；
v＝样品体积0.025mL；1000＝mL和μL单位换算。
以稀释了31250倍的待测样品为例，
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种全能核酸酶，其特征在于，所述的全能核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.一种核酸，其特征在于，所述的核酸编码权利要求1所述的全能核酸酶。
3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的载体选自pPICZαA、pET-28a、pEZZ18、pTA1529、pINIII-ompA、pUB110、pE194、pUCX05-bgaB、pHT304、pMK3、pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1、pYAM75P、PNZ8149-usp45中的一种。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述的载体为pPICZαA。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求4-6任一项所述的重组表达载体。
8.根据权利要求1所述的全能核酸酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建重组表达质粒；
(2)转化酵母菌株，筛选阳性转化子；
(3)酵母重组表达菌株发酵；
(4)分离纯化发酵液中的全能核酸酶。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的重组表达质粒的构建方法包括以下步骤：
1)以SEQ ID NO:2所示的序列为模板进行PCR扩增，获得目的片段；
2)将目的条带用EcoR I和Sal I双酶切，把酶切产物与载体相连接；
3)把连接产物全部转入到大肠杆菌中，获得重组表达质粒。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的转化酵母菌株的方法为对构建所得的重组表达质粒进行线性化，以电压1.5kV、电容25μF、电阻200Ω电击转化酵母菌株感受态细胞。
11.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中酵母重组菌株发酵的方法为发酵罐发酵，具体包括以下步骤：
1)菌种活化：将重组工程菌加入到种子活化培养基中，培养；
2)菌种扩大培养：将活化的菌株接种到种子培养基中，培养20-30h；
3)发酵：设置发酵罐温度为28-35℃，起始通气量调为10L/min，搅拌转速设定为300rpm，待温度稳定在28-35℃，溶氧稳定后校正为100％，调节发酵培养基pH至6.0±0.2，将菌种导入罐内，发酵至菌液OD600达到100+后加入甲醇，诱导4-8天后，将发酵液离心，收集菌体沉淀。
12.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中分离纯化发酵液中的全能核酸酶包括以下步骤：
1)溶解菌体：在菌体沉淀中加溶菌缓冲液，混匀，过滤；
2)高压破菌：将过滤后的菌液倒入破碎仪，将泵头内压力提升至1100-1300bar，停止加压，接收破碎后的菌液，将破碎菌液离心，取上清液；
3)离子交换层析：平衡QFF层析柱，层析系统的A1管道放入样品瓶，软件设置AotuUVzero，设置Injecttion Mack，开始进样，温度为2-8℃；当UV280的数值大于100mAU后，用干净容器收集进样流穿，进样结束后，将A1管道放入阴离子交换缓冲液A瓶中，继续运行层析系统，当UV280的数值降低至500mAU后，停止收集流穿；
4)亲和层析：平衡层析NI柱，层析系统中的A1管道放入样品瓶，软件设置Aotu UVzero，设置Injecttion Mack，开始进样，温度2-8℃，进样结束后，A1管道放入亲和缓冲液A瓶中，运行2倍柱体积，设置梯度20％，运行3倍柱体积，设置梯度60％，运行后，观察UV280的数值，收集洗脱峰；
5)透析：将亲和层析洗脱样品加入透析袋，搅拌透析4-6小时，进行过滤，收集核酸酶原液。
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