CN117487675A - 一株稳定表达人乳铁蛋白的里氏木霉菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
一株稳定表达人乳铁蛋白的里氏木霉菌株及其应用，属于微生物及发酵工程技术领域。本发明通过在里氏木霉不同的宿主菌中表达人乳铁蛋白基因，筛选表达产物稳定的重组菌。进一步通过诱变育种获得生长速度快同时产物稳定的菌株，其中编号为CJ2095的菌株的生长速度正常而表达产物的稳定性明显高于其它菌株。该菌株命名为Trichoderma sp.CJ2095，中文名为里氏木霉CJ2095，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 20231481。该菌株发酵获得的重组人乳铁蛋白在发酵液中能较长时间的保持稳定，在大规模发酵制备重组人乳铁蛋白时能减轻企业后提取工作压力、降低后提取成本，有效减少了后提取工段的设备投资。
Description
技术领域
本发明涉及一株稳定表达人乳铁蛋白的里氏木霉菌株及其应用，属于微生物学与发酵工程技术领域。
背景技术
人乳铁蛋白是一种天然存在于母乳中的含铁蛋白，具有铁转运调节等功能。研究发现，乳铁蛋白还具有抗菌、抗氧化以及复杂的免疫调节功能，是一种潜力巨大的食品添加剂，也是有广阔应用前景的药品开发的原料。采用微生物异源表达是大量获取廉价的蛋白质类型产物的有效途径。乳铁蛋白是一种胞外蛋白，在外分泌过程中经历了糖基化等修饰过程，是一种糖基化蛋白。
里氏木霉作为一种常用的真核表达系统，一方面具有蛋白表达量高，发酵成本低的优势，同时又具有糖基化修饰能力，能获得糖基化蛋白。与酵母表达系统相比，里氏木霉表达系统能在一定程度上避免过度糖基化的问题，获得的重组蛋白与母乳中的乳铁蛋白更为接近。
现代发酵工业中，微生物发酵往往在大型发酵罐中进行，一次获得大量的发酵产物。乳铁蛋白作为一种主要用于婴儿食品的添加剂，其发酵产物必须进行提取和精制，因此发酵后需要经过比较复杂的提取过程。这一过程非但本身时间较长而且由于提取设备的限制，发酵液往往需要分批处理。由于真菌均具有丰富的胞外蛋白酶，这些蛋白酶一方面在发酵过程中具有分解外源蛋白的能力，更麻烦的是在发酵液等待处理的过程中也能逐步分解目标蛋白，造成产物的损失。
本发明在前期工作中，开发了几种表达人乳铁蛋白的里氏木霉，发现里氏木霉可以有效表达人乳铁蛋白，但表达产物很容易被分解，尤其是发酵结束后如果发酵液不能及时处理则其中的重组乳铁蛋白往往会很快被分解，因此乳铁蛋白生产的成功与否高度依赖于提取工段的处理速度，这给生产过程中后提取阶段的工作带来极大的压力。
敲除蛋白酶基因是提高产物稳定性方法之一，但前期工作发现，产人乳铁蛋白的重组菌在敲除了蛋白酶基因后菌体生长速度显著下降，发酵周期延长，极大的增加了发酵染菌的风险。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一株稳定表达人乳铁蛋白的里氏木霉菌株及其应用。该菌株发酵获得的重组人乳铁蛋白在发酵液中能较长时间的保持稳定，减轻企业后提取工作压力，降低后提取成本，特别是为减少后提取工段的设备投资提供了有效的解决方案。
本发明的技术方案，一株稳定表达人乳铁蛋白的里氏木霉菌株CJ2095，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，武汉大学，其分类命名为木霉CJ2095Trichoderma sp.CJ2095，保藏日期为2023年8月14日，保藏编号为CCTCC NO：M 20231481。
所述菌株，选择来源于腐烂环境的野生型里氏木霉菌株作为底盘细胞，采用重组质粒经农杆菌转化实现人乳铁蛋白的稳定表达，再经过诱变育种和筛选后，最终获得稳定表达人乳铁蛋白的里氏木霉菌株CJ2095。
进一步地，所述重组质粒具体为pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP-Pcbh1-lftM-Tcbh1，简称为pCAM-Pcbh1-lftM-Tcbh1。
进一步地，所述质粒中两个KpnI识别位点之间的片段称为Pcbh1-lftM-Tcbh1，是以纤维二糖酶表达原件控制人乳铁蛋白编码基因表达的表达框。
进一步地，将表达人乳铁蛋白基因的重组质粒pCAM-Pcbh1-lftM-Tcbh1转化根癌农杆菌构建重组菌，筛选后，再次将重组质粒pCAM-Pcbh1-lftM-Tcbh1转化根癌农杆菌后进一步转化筛选获得的菌株，最后诱变育种筛选。
本发明所述重组菌里氏木霉CJ2095的构建方法如下：
(1)表达人乳铁蛋白的表达框与重组表达载体的构建：
以纤维素酶高产菌里氏木霉C015菌株的染色体DNA为模板，用Pcbh1P01和Pcbh1P02为引物，扩增里氏木霉纤维二糖酶基因的启动子及纤维二糖酶信号肽编码区，PCR获得一1.5kb左右的片段，命名为Pcbh1，具体序列如SEQ ID NO:3所示。
以Pltf01和Pltf02为引物进行PCR扩增人乳铁蛋白成熟肽编码区，获得一2.1kb左右的PCR产物，命名为lftM，序列如SEQ ID NO:6所示。
以里氏木霉C019染色体DNA为模板，以Pcbh1T01和Pcbh1T02为引物，扩增里氏木霉纤维二糖酶基因末端及转录终止相关区域，PCR产物全长约0.6kb，命名为Tcbh1，具体序列如SEQ ID NO:9所示。
将上述三个片段以及经KpnI酶切的pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP混合后进行无缝连接，连接物转化大肠杆菌JM109，得到重组质粒，重组质粒中插入片段序列具体如SEQ ID NO:10所示。为便于叙述上述重组质粒命名为：pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP-Pcbh1-lftM-Tcbh1，简称为pCAM-Pcbh1-lftM-Tcbh1。
所述引物具体如下：
Pcbh1P01，即SEQ ID NO:1，5’-CGAAT TGAGC TCGGT ACCGT TGTGA AGTCG GTA-3’；
Pcbh1P02，即SEQ ID NO:2，5’-CACTC CTCCT ACGGC CAGCA CGAGC TGTGG CC-3’；
Pltf01，即SEQ ID NO:4，5’-GGCCG TAGGA GGAGT G-3’；
Pltf02，即SEQ ID NO:5，5’-TTACT TCCTG AGGAA-3’；
Pcbh1T01，即SEQ ID NO:7，5’-TTCCT CAGGA AGTAA AACCC TTACT ACTCT-3’；
Pcbh1T02，即SEQ ID NO:8，5’-GCTAG CAACG TTTGG TACCG TCCTC GGCTA CGTT-3’。
(2)表达人乳铁蛋白的里氏木霉重组菌H155的构建：将步骤(1)制备的表达人乳铁蛋白基因的重组质粒pCAM-Pcbh1-lftM-Tcbh1转化根癌农杆菌后进一步转化高产纤维素的里氏木霉菌株C015。经多次转化和筛选后选择编号为H155的菌株用于后续实验。
(3)里氏木霉菌株的筛选：以前期获得的高产纤维素酶的里氏木霉菌株C015为参照，选择菌落形态与C015相近的可能的里氏木霉的菌株共计约1200株，ITS基因测序比对鉴定获得里氏木霉679株，编号为HTR001～HTR679。
(4)产物稳定的宿主菌的初步筛选：将重组里氏木霉H155进行发酵，获得表达了人乳铁蛋白的发酵液。同时将上述679株野生型里氏木霉菌株按同样方法分别培养后获得发酵液。将H155的发酵液与9倍体积的野生型里氏木霉的发酵液混合后常温放置。间隔2小时检测混合液中人乳铁蛋白的含量。检测结果显示H155发酵液与其中71株野生菌的发酵液混合后人乳铁蛋白的降解速度明显慢于H155发酵液中的人乳铁蛋白的降解速度。
(5)表达人乳铁蛋白的里氏木霉重组菌的构建：将表达人乳铁蛋白基因的重组质粒pCAM-Pcbh1-lftM-Tcbh1转化根癌农杆菌后进一步转化上述71株野生型里氏木霉。经多次转化、筛选、发酵、分析，最终选取HTR285-1#和HTR556-3#的菌株。
(6)诱变育种及重组人乳铁蛋白的稳定性进一步提高的重组里氏木霉的筛选：上述重组菌HTR285-1#和HTR556-3#各自涂布于固体高氏培养基上，30℃培养14天，大量形成孢子后用无菌水将孢子冲洗下来，收集在一个5mL的离心管中。将每一株菌的孢子用10mL生理盐水悬浮在试管中。将悬浮的孢子进行Co60照射，照射剂量控制在0.5±0.1kGy；将上述经过诱变的孢子悬液转入20mL普通PDA液体培养基中，30℃摇瓶培养12小时。取菌液稀释后涂布PDA平板，培养48hr获得单菌落。取单菌落于装有15％甘油的菌种保藏管中，在-70℃保藏。每株菌大约保藏3000个菌落。上述保藏的菌株分别进行摇瓶发酵，发酵液检测乳铁蛋白含量，再室温保藏4小时和6小时后再检测乳铁蛋白含量。结果显示，部分菌株发酵液中乳铁蛋白的稳定性显著高于诱变前的出发菌。各取3株稳定性最高的菌株用于后续实验。结果显示其中由HTR285-1#菌株来源的一株突变体CJ2095其发酵液稳定性显著高于其它菌株，其发酵液在常温放置8小时后其乳铁蛋白含量保持在发酵刚结束时的初始量的74％，发酵液表现出高度的稳定性。
上述发酵液高度稳定的重组菌CJ2095命名为Trichoderma sp.CJ2095，中文名为里氏木霉CJ2095，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M20231481。
本发明的有益效果：本发明通过筛选不同的里氏木霉宿主菌并进一步诱变育种的方法获得了一株新型重组里氏木霉，该菌株发酵获得的重组人乳铁蛋白在发酵液中能较长时间的保持稳定，在大规模发酵制备重组人乳铁蛋白时能减轻企业后提取工作压力、降低后提取成本，有效减少了后提取工段的专用设备投资。
生物材料样品保藏
一株稳定表达人乳铁蛋白的里氏木霉菌株CJ2095，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，武汉大学，其分类命名为木霉CJ2095 Trichodermasp.CJ2095，保藏日期为2023年8月14日，保藏编号为CCTCC NO：M 20231481。
纤维素酶高产菌，里氏木霉C015菌株，购自江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心(http://www.cicim-cu.jiangnan.edu.cn)，其编号为CICIM F7137
里氏木霉C019已保藏在江南大学中国高校工业微生物资源信息中心，保藏编号CICIM7138。
以里氏木霉C015为宿主菌构建的产人乳铁蛋白的重组菌株里氏木霉C015/pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP H155，简称里氏木霉H155，已保藏在江南大学中国高校工业微生物资源信息中心，保藏编号CICIM7140。
附图说明
图1不同重组菌发酵液中乳铁蛋白稳定性比较。
具体实施方式
以下实施例中所采用的材料和方法如下。
菌株与质粒：根癌农杆菌Agrobaeterium tumefaciena AGL1(方浩.里氏木霉纤维二糖酶基因的克隆与表达.浙江大学博士学位论文,2014:52-54.)由江南大学中国高校工业微生物资源信息中心提供。质粒pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP购自丰晖生物科技有限公司，质粒信息见文献(何锦豪,韦吴迪,王刚.马尔尼菲篮状菌绿色荧光蛋白标记菌株的构建及应用.热带医学杂志,2022,22(4):513-517)。
试剂：用于液相检测的酪醇标样为Sigma公司产品。其他试剂均购自国药集团化学试剂公司。分子生物学操作试剂均为大连宝生物工程有限公司产品。无缝克隆连接试剂盒为宝日医公司产品(ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit)，无缝连接实验按说明书操作。质粒提取试剂盒、PCR产物纯化及胶回收试剂盒等均为爱思进生物技术有限公司产品。除非另外提及，PCR操作使用标准方法和PCR反应数据进行，可参见(Sambrook等1989分子克隆实验手册)。PCR反应使用DNA聚合酶为大连宝生物工程有限公司产品的PrimerStar，反应条件参考产品说明书。除非提及，DNA操作和转化按照标准的分子生物学方法进行(Sambrook等1989分子克隆实验手册)。
培养基：根癌农杆菌前期培养的培养基均同文献(何锦豪,韦吴迪,王刚等.马尔尼菲篮状菌绿色荧光蛋白标记菌株的构建及应用.热带医学杂志,2022,22(4):513-517.)。
里氏木霉的平板、斜面培养均采用PDA培养基并按说明添加抗菌素。
里氏木霉摇瓶种子培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨7g/L，玉米浆干粉3g/L，
(NH4)2S04 1g/L，KH2P04 2g/L，MgS04.7H20 0.1g/L，CaCl2 0.2g/L，FeS04.7H20
0.002g/L，MnS04.H20 0.001g/L，ZnS04.7H20 0.001g/L，CoCl2.6H20 0.001g/L，麸皮3g/L。
摇瓶发酵培养基：参考文献(夏颖,赵杰,夏黎明.一种新型内切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组表达.高校化学工程学报,2016,30(3):626-632)基础上增加麸皮和微晶纤维素，具体配方如下：乳糖20g/L，蛋白胨5g/L，(NH4)2S042.8g/L，KH2P04 4g/L，MgS04.7H20 0.6g/L，CaCl2 0.6g/L，FeS04.7H20 0.005g/L，MnS04.H20 0.0016g/L，ZnS04.7H200.0014g/L，CoCl2.6H20 0.0037g/L，微晶纤维素20g/L，麸皮10g/L。
摇瓶发酵培养基2：乳糖:50g/L，蛋白胨5g/L，玉米浆干粉3g/L，(NH4)2S042.8g/L，KH2P04 4g/L，MgS04.7H20 0.6g/L，CaCl2 0.6g/L，FeS04.7H20 0.005g/L，MnS04.H20 0.0016g/L，ZnS04.7H20 0.0014g/L，CoCl2.6H20 0.0037g/L，阿拉伯半乳聚糖4g/L。
方法1根癌农杆菌的转化：首先按基因工程的一般方法在大肠杆菌宿主菌中构建重组质粒，获得重组菌大肠杆菌JM109/pCAM-Pcbh1-lftM-Tcbh1，大量提取质粒。将大量提取的质粒转化根癌农杆菌AGL-1。转化及转化子的鉴定等均按文献报道的一般方法进行(方浩.里氏木霉纤维二糖酶基因的克隆与表达.浙江大学博士学位论文,2014:52-54.)。转化按上述文献中“4.2.7.1根癌农杆菌AGL-1”的方法进行。农杆菌质粒提取按上述文献中“4.2.7.2根癌农杆菌转化子质粒的提取”进行。转化后转化子采用PCR方法鉴定，以所提取的质粒为模板，以鉴定引物Ptst01和Ptst02为引物进行PCR，如能得到一1kb的扩增产物则认定模板为重组质粒，所取转化子为含有重组质粒的根癌农杆菌，该农杆菌命名为根癌农杆菌AGL-1/pCAM-Pcbh1-lftM-Tcbh1。鉴定引物Ptst01和Ptst02见实施例2。
方法2里氏木霉的侵染转化：获得重组菌质粒JM109/pCAM-Pcbh1-lftM-Tcbh1的根癌农杆菌对表达宿主菌里氏木霉进行侵染转化。采用里氏木霉的孢子进行转化，转化方法等均同文献(方浩.里氏木霉纤维二糖酶基因的克隆与表达.浙江大学博士学位论文,2014:52-54.)。侵染转化按上述文献中“4.2.7.4根癌农杆菌介导的转化”的方法进行。获得在潮霉素平板上生长的里氏木霉转化子后进一步进行转化子的复筛，方法同上述文献中的“4.2.8.1里氏木霉转化子的复筛”，其中复筛平板配方中添加乳糖至10g/L，其余不变。在复筛平板上初步认定的转化子提取染色体DNA后进行PCR鉴定，鉴定方法同上述文献，按文献中“4.2.8.2重组里氏木霉基因组的提取”和“4.2.8.3里氏木霉转化子的PCR鉴定”所述方法进行。其中鉴定引物同方法1，PCR后如能得到一1kb的扩增产物则认定所取转化子为含有人乳铁蛋白表达框的里氏木霉。
方法3重组菌发酵实验：将方法2实验获得的重组菌及出发菌接种于PDA试管斜面培养基上，培养10天-15天，以形成大量绿色孢子为准。取少量种子培养基液体于上述试管斜面上，用接种环搅动将孢子洗下来获得孢子悬液，孢子悬液接种种子培养基，控制种子培养基中孢子浓度在2×107左右。30℃摇瓶培养2天，按10％接种量接种发酵培养基，摇瓶培养4-10天，一般是第4天开始每间隔1天取样检测发酵上清液中人乳铁蛋白含量。人乳铁蛋白检测采用人转铁蛋白(TF)ELISA试剂盒，为上海生工生物工程股份有限公司产品，产品编号为：D711075-0096，检测方法见试剂盒说明书。检测以不含乳铁蛋白的里氏木霉菌株发酵液为阴性对照，为保证检测的准确性，试验前期在所使用的里氏木霉出发菌中任选了10株野生菌进行发酵检测，检测结果显示其发酵液中乳铁蛋白含量均为0。检测发酵菌体量时由于发酵培养基中含有大量固形物而难以检测，所以改用不含固形物的发酵培养基2进行摇瓶发酵。
实施例1表达人乳铁蛋白的表达框与重组表达载体的构建
(1)以实验室收藏的纤维素酶高产菌里氏木霉C015菌株的染色体DNA为模板，用Pcbh1P01(SEQ ID NO:1)和Pcbh1P02(SEQ ID NO:2)为引物，扩增里氏木霉纤维二糖酶基因的启动子及纤维二糖酶信号肽编码区，PCR获得一1.5kb左右的片段，与预测的纤维二糖酶基因上游调控区应有大小一致，该片段命名为Pcbh1。对该PCR产物进行测序，测序结果如序列SEQ ID NO:3所示。
该序列的前端由引物Pcbh1P01带入一段18bp的片段，与载体pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP中KpnI酶切位点及上游序列一致，用于基因片段与该载体进行无缝连接。该序列的后端由引物Pcbh1P02带入一段16bp的片段，与所要表达的人乳铁蛋白基因成熟肽编码区5’-端一致，用于和该片段进行无缝连接。
(2)根据美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的人乳铁蛋白基因序列及该序列中对基因编码区的注解，设计人乳铁蛋白成熟肽编码基因，设计后提交苏州金唯智生物技术公司进行全基因合成。获得合成产物后，以所合成的产物为模板，以Pltf01(SEQ ID NO:4)和Pltf02(SEQ ID NO:5)为引物进行PCR，获得一2.1kb左右的PCR产物，与人乳铁蛋白成熟肽编码区一致，该片段命名为lftM。对该PCR产物进行测序，测序结果如序列SEQ ID NO:6所示。
该片段的上游有一段16bp的片段，序列与片段Pcbh1基因的PCR产物的的末端一致，用于和该片段进行无缝连接。该片段的下游有一段16bp的片段，与片段Tcbh1的上游一致，用于和该片段进行无缝链接。
(3)以实验室收藏的另一株里氏木霉C019染色体DNA为模板，以Pcbh1T01(SEQ IDNO:7)和Pcbh1T02(SEQ ID NO:8)为引物，扩增里氏木霉纤维二糖酶基因末端及转录终止相关区域，PCR产物全长约0.6kb，与预测的纤维二糖酶基因下游转录终止相关区域一致，该片段命名为Tcbh1。对上述PCR产物进行测序，测序结果如序列SEQ ID NO:9所示。
该序列的前端由引物Pcbh1T01带入一段15bp的片段，序列与人乳铁蛋白编码区的扩增产物的5’-端一致，用于和该片段进行无缝连接。该序列的末端有一段由19bp组成的小片段，序列与载体pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP中KpnI识别位点及下游序列一致，用于和载体的无缝连接。
(4)将上述三个片段以及经KpnI酶切的pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP混合后进行无缝连接。连接物转化大肠杆菌JM109，取4个转化子划线分离后送上海生工生物技术有限公司进行测序，结果显示4个转化子中的质粒均为在pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP的KpnI位点中插入Pcbh1、lftM、Tcbh1三个片段后得到的重组质粒，序列完全一致。上述插入片段的测序结果如序列SEQ ID NO:10所示。
为便于叙述上述重组质粒命名为：pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP-Pcbh1-lftM-Tcbh1，简称为pCAM-Pcbh1-lftM-Tcbh1，质粒中两个KpnI识别位点之间的片段称为Pcbh1-lftM-Tcbh1，是以纤维二糖酶表达原件控制人乳铁蛋白编码基因表达的表达框。在该质粒中，人乳铁蛋白的编码基因置于里氏木霉纤维二糖酶启动子下游的纤维二糖酶信号肽的下游，适合在里氏木霉中分泌表达人乳铁蛋白。
实施例2表达人乳铁蛋白的里氏木霉重组菌H155的构建
按照材料方法2所述，将表达人乳铁蛋白基因的重组质粒pCAM-Pcbh1-lftM-Tcbh1转化根癌农杆菌后进一步转化高产纤维素酶的里氏木霉菌株C015。经多次转化，获得转化子菌株21个。将上述21个转化子全部按方法3进行摇瓶发酵。结果显示，这21个菌株中有15株的发酵液中都有明显的人乳铁蛋白，而且发酵水平都比较接近。
进一步提取染色体后用鉴定引物进行PCR鉴定。结果显示，15株能表达出人乳铁蛋白的里氏木霉菌株的染色体作为模板进行PCR，引物为Ptst01(SEQ ID NO:11)和Ptst02(SEQ ID NO:12)。上述引物中Ptst01与表达框中里氏木霉信号肽编码区上游一致，而Ptst02与表达框中人乳铁蛋白编码区的大约950bp处的序列互补，两者间隔约1kb，这是表达框导入里氏木霉宿主菌的特征片段，结果显示上述15株菌都能够得到一条1kb左右的PCR条带。另外5株发酵液检测不到人乳铁蛋白的菌株在PCR后得不到上述1kb左右的特征条带。
取其中一株发酵水平相对较高的编号为H155的菌株用于后续实验。将上述H155菌株摇瓶发酵获得的发酵液离心后取上清液，上清液在20℃放置，间隔2小时检测其中的乳铁蛋白的量。结果显示，发酵液在放置2-4小时后其中的乳铁蛋白的量下降到初始值的50％以下，这与本发明前期研究的结果一致，以里氏木霉表达人乳铁蛋白时一般都能够在发酵液中得到目标产物，但目标产物在发酵液中高度不稳定。
Ptst01(SEQ ID NO:11)具体序列为：5’-atgtatcggaagttg-3’；
Ptst02(SEQ ID NO:12)具体序列为：5’-ggtacagcccagaatc-3’。
实施例3里氏木霉菌株的筛选
本发明前期工作中，在全国各地的自然保护区的森林中收集各种腐烂的木头和树枝，适当稀释后在PDA固体培养基上划线分离，以本发明前期获得的高产纤维素酶的里氏木霉菌株C015为参照，选择菌落形态与C015相近的菌株，进一步镜检，保藏镜检初步判断可能是里氏木霉的菌株共计约1200株。全部进行ITS基因序列分析，将测序结果与美国国家生物技术信息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的里氏木霉的ITS基因序列(NR_120297.1)进行比较，以序列同源性为98.5％为标准用于下一步实验。
其中ITS基因序列分析的方法首先按文献(Chen Y,Prior B A,Shi G,etal.Arapid PCR-Based Approach for Molecular Identification of FilamentousFungi.The Journal of Microbiology,2011,49(4):675-679.)获取菌株的ITS基因的PCR产物，PCR产物送上海生工生物技术服务公司测序，获得序列后再按上述文献的方法进行序列同源性分析。根据上述标准，共计鉴定获得里氏木霉679株，编号为HTR001～HTR679。上述679株菌株全部保藏在合作企业无锡先秦生物科技有限公司的菌种库中。
实施例4产物稳定的宿主菌的初步筛选
按材料方法中方法3所述，将重组里氏木霉H155进行发酵，获得表达了人乳铁蛋白的发酵液。同时将上述679株野生型里氏木霉菌株按同样方法分别培养后获得发酵液。将H155的发酵液与9倍体积的野生型里氏木霉的发酵液混合后常温放置。间隔2小时检测混合液中人乳铁蛋白的含量。检测结果显示H155发酵液与其中71株野生菌的发酵液混合后人乳铁蛋白的降解速度明显慢于H155发酵液中的人乳铁蛋白的降解速度。
实施例5表达人乳铁蛋白的里氏木霉重组菌的构建
按照材料方法2所述，将表达人乳铁蛋白基因的重组质粒pCAM-Pcbh1-lftM-Tcbh1转化根癌农杆菌后进一步转化上述71株野生型里氏木霉。经多次转化，其中有51株菌获得了转化子。获得转化子的菌株各取4个转化子按照按材料方法中方法1所述，进行发酵。检测发酵液中的人乳铁蛋白。结果显示，其中有31株菌的合计103个转化子发酵液中检测到了人乳铁蛋白。将上述103个转化子摇瓶发酵获得的转化子离心后取上清液，上清液在20℃放置，间隔2小时检测其中的乳铁蛋白的量。
结果显示，其中大部分转化子的发酵液在放置2-4小时后其中的乳铁蛋白的量下降到初始值的50％以下，与重组菌H155在同样条件下获得的发酵液差异不显著。在上述转化子中有6株菌的发酵液在常温保藏6小时后其中乳铁蛋白的含量在初始值的50％以上，其稳定性显著高于H155的发酵液。
进一步对上述6株菌的发酵过程进行分析，结果显示，其中代号为HTR285-1#和HTR556-3#的菌株具有较高的菌体量，菌体量大约与H155相当。HTR285-1#和HTR556-3#的发酵周期为6天，最终发酵液中乳铁蛋白含量在4mg/L左右，发酵周期和发酵水平均与H155相当。其余菌株的发酵周期均为8天，最终发酵液中乳铁蛋白含量均在2mg/L以下，且菌体量不足H155的60％。
实施例6诱变育种及重组人乳铁蛋白的稳定性进一步提高的重组里氏木霉的筛选
上述重组菌HTR285-1#和HTR556-3#各自涂布于固体高氏培养基上，30℃培养14天，大量形成孢子后用无菌水将孢子冲洗下来，收集在一个5mL的离心管中。将每一株菌的孢子用10mL生理盐水悬浮在试管中。将悬浮的孢子进行Co60照射，照射剂量控制在0.5±0.1kGy；将上述经过诱变的孢子悬液转入20mL普通PDA液体培养基中，30℃摇瓶培养12小时。取菌液稀释后涂布PDA平板，培养48hr获得单菌落。取单菌落于装有15％甘油的菌种保藏管中，在-70℃保藏。每株菌大约保藏3000个菌落。上述保藏的菌株分别进行摇瓶发酵，发酵液检测乳铁蛋白含量，再室温保藏4小时和6小时后再检测乳铁蛋白含量。
结果显示，部分菌株发酵液中乳铁蛋白的稳定性显著高于诱变前的出发菌。各取3株稳定性最高的菌株用于后续实验。结果显示其中由HTR285-1#菌株来源的一株突变体CJ2095其发酵液稳定性显著高于其它菌株，其发酵液在常温放置8小时后其乳铁蛋白含量保持在发酵刚结束时的初始量的74％，发酵液表现出高度的稳定性。
上述发酵液高度稳定的重组菌CJ2095命名为Trichoderma sp.CJ2095，中文名为里氏木霉CJ2095，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M20231481。
应用实施例1重组里氏木霉发酵液中人乳铁蛋白稳定性的比较
将重组大肠杆菌按材料方法中方法3进行摇瓶发酵，发酵结束后发酵液离心，取上清液。上清液在室温下放置，间隔2小时检测发酵液中乳铁蛋白的残留量。结果如图1所示。
由图1可见，以纤维素酶高产株为宿主菌构建的重组菌H155发酵液中乳铁蛋白高度不稳定，放置4小时后乳铁蛋白残留量不足初始量的50％。本专利工作中筛选得到的两株产物稳定性提高的重组菌HTR285-1和HTR556-3发酵得到的发酵液中产物的稳定性有明显的提高。突变株CJ2095的稳定性则进一步大幅度提高，发酵上清液放置8小时后乳铁蛋白残留量依然在75％以上。
在发酵工业中，发酵结束后一般采用板框过滤的方法除去发酵液中的菌体等固形物以获得上清液。里氏木霉菌体粗大，发酵液可以直接进行板框过滤，而板框又是发酵工业中最常用的设备，设备投资少，因此板框过滤往往可以在发酵后在短时间内完成。乳铁蛋白在板框过滤后进一步精制需要采用价格高昂的专用设备，因此设备投资很高。CJ2095菌株在发酵清液中具有显著较高的稳定性，因此当精制设备容量不足时发酵清液可以分批处理，这显然有利于降低专用设备的投资。
Claims (10)
1.一株稳定表达人乳铁蛋白的里氏木霉菌株CJ2095，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，武汉大学，其分类命名为木霉CJ2095 Trichodermasp.CJ2095，保藏日期为2023年8月14日，保藏编号为CCTCC NO：M 20231481。
2.如权利要求1所述菌株，其特征是：以野生型里氏木霉菌株作为底盘细胞，采用重组质粒经根癌农杆菌转化上述野生型里氏木霉，优选有利于乳铁蛋白表达及产物温度的宿主菌及重组菌，优选的重组菌经过诱变育种和筛选后，最终获得稳定表达人乳铁蛋白的里氏木霉菌株CJ2095。
3.如权利要求2所述菌株，其特征是：所述重组质粒具体为pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP-Pcbh1-lftM-Tcbh1，简称为pCAM-Pcbh1-lftM-Tcbh1。
4.如权利要求3所述菌株，其特征是：所述质粒中两个KpnI识别位点之间的片段称为Pcbh1-lftM-Tcbh1，是以纤维二糖酶表达原件控制人乳铁蛋白编码基因表达的表达框。
5.如权利要求3所述重组质粒的构建过程，其特征是步骤如下：
(1)以纤维素酶高产菌里氏木霉C015菌株的染色体DNA为模板，用Pcbh1P01和Pcbh1P02为引物，扩增里氏木霉纤维二糖酶基因的启动子及纤维二糖酶信号肽编码区，PCR获得一1.5kb左右的片段，命名为Pcbh1，具体序列如SEQ ID NO:3所示；
(2)以Pltf01和Pltf02为引物进行PCR，获得一2.1kb左右的人乳铁蛋白成熟肽编码基因的PCR产物，命名为lftM，序列如SEQ ID NO:6所示；
(3)以里氏木霉C019染色体DNA为模板，以Pcbh1T01和Pcbh1T02为引物，扩增里氏木霉纤维二糖酶基因末端及转录终止相关区域，PCR产物全长约0.6kb，命名为Tcbh1，具体序列如SEQ ID NO:9所示；
(4)将上述三个片段以及经KpnI酶切的pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP混合后进行无缝连接，连接物转化大肠杆菌JM109，得到重组质粒，重组质粒中插入片段序列具体如SEQ ID NO:10所示。
6.如权利要求5所述重组质粒的构建过程，其特征是所述引物具体如下：
Pcbh1P01，即SEQ ID NO:1，5’-CGAAT TGAGC TCGGT ACCGT TGTGA AGTCG GTA-3’；
Pcbh1P02，即SEQ ID NO:2，5’-CACTC CTCCT ACGGC CAGCA CGAGC TGTGG CC-3’；
Pltf01，即SEQ ID NO:4，5’-GGCCG TAGGA GGAGT G-3’；
Pltf02，即SEQ ID NO:5，5’-TTACT TCCTG AGGAA-3’；
Pcbh1T01，即SEQ ID NO:7，5’-TTCCT CAGGA AGTAA AACCC TTACT ACTCT-3’；
Pcbh1T02，即SEQ ID NO:8，5’-GCTAG CAACG TTTGG TACCG TCCTC GGCTA CGTT-3’。
7.如权利要求3所述菌株，其特征是：将表达人乳铁蛋白基因的重组质粒pCAM-Pcbh1-lftM-Tcbh1转化经根癌农杆菌转化野生型里氏木霉构建重组菌，筛选后再诱变育种进一步筛选。
8.权利要求1所述菌株的应用，其特征是：能够获得表达产物稳定的人乳铁蛋白发酵液。
9.权利要求8所述菌株的应用，其特征是：在人乳铁蛋白发酵结束后将发酵液常温放置8小时，产物损失不超过25％。
10.权利要求8所述菌株的应用，其特征是：基于人乳铁蛋白表达的稳定性，实现对发酵清液的分批处理。
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