CN114854719A - 一种制备高效核酸酶的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种制备高效核酸酶的方法，该方法包括：克隆重组如SEQ ID No.1或者SEQ ID No.2所示的高效核酸酶基因到载体，将该重组载体转化至酵母细胞，筛选基因组中重组该基因的酵母细胞，对该重组酵母细胞进行诱导表达，分离纯化高效核酸酶。本发明的制备方法实现了在产业上高效的表达高效核酸酶，其表达的N段截短的高效核酸酶具有更好的酶活性，能广泛应用于亚单位疫苗中抗原蛋白的制备。

Description

一种制备高效核酸酶的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种制备高效核酸酶的方法及其应用，属于生物制药领域。

背景技术

核酸广泛存在于原核生物、真核生物和病毒中，是亚单位疫苗生产制备过程中的非必须成份，将其有效去除有利于降低下游产物分离纯化的成本、提高疫苗品质。传统的核酸去除方法主要是超声法和DNase/RNase酶法，但其操作周期较长，且核酸去除效率低，无法满足规模化生产的需求。全能核酸酶(以下简称SM-Nu)，是来源于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的一种核酸内切酶，该酶能够在非常广泛的条件下降解所有形式的(双链、单链、线状、环状)DNA和RNA，生成含有5'-磷酸末端的3-5个寡核苷酸残基片段。目前，SM-Nu已通过大肠杆菌原核表达系统获得可溶性表达，但由于SM-Nu存在一定的细胞毒性，致使其表达水平受到了一定的限制。

酵母真核表达系统可实现外源蛋白的分泌表达，且培养成本低、表达产物易分离纯化，利用该系统表达外源蛋白具有自身的优势。

因此，现有技术中亟需提供一种SM-Nu的高效表达方法，以及SM-Nu在制备抗原蛋白中的应用。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种制备高效核酸酶的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)克隆所述高效核酸酶的基因，重组到载体，得到包含有所述高效核酸酶基因的载体，其中，所述高效核酸酶基因如SEQ ID No.1所示，或者所述高效核酸酶基因如SEQID No.2所示；步骤(2)将所述包含有高效核酸酶基因的载体转化至酵母细胞，筛选基因组中重组有所述高效核酸酶基因的酵母细胞；步骤(3)对所述基因组中重组了所述高效核酸酶基因的酵母细胞进行诱导表达，得到分泌表达的所述高效核酸酶；以及步骤(4)分离所述分泌表达的高效核酸酶，纯化，得到所述高效核酸酶。

本发明对来源于粘质沙雷氏菌的全能核酸酶，按毕赤酵母偏爱密码子优化的原则，利用化学法合成，得到本发明的高效核酸酶基因。本发明制备方法实现了在表达体系中高效核酸酶的高表达量表达，其表达量分别达到0.2mg/mL、0.25mg/mL，实现了产业上的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明的方法中，所述步骤(1)中所述载体为pPICZɑA载体，所述步骤(2)中所述酵母细胞为酵母GS115株；所述步骤(3)中所述诱导的诱导剂为甲醇。

通过测定，本发明所述毕赤酵母表达的高效核酸酶基因在毕赤酵母中的表达量达到0.2mg/mL；酶活性为50KU/mL。

当将截去N端区域(截短后的高效核酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，表达的截短后的高效核酸酶活性明显增强，酶活性达到500KU/mL，且表达量达到0.25mg/mL。

本发明还提供了一种抗原蛋白的纯化方法，其中，所述纯化方法包括：步骤(1)将表达所述抗原蛋白的细胞破碎裂解，释放胞内表达的所述抗原蛋白；步骤(2)在所述步骤(1)的所述裂解释放的抗原蛋白中添加所述方法制备的高效核酸酶，酶解所述破碎细胞中的核酸；以及步骤(3)待所述步骤(2)的所述酶解完成后，分离所述抗原蛋白。

作为本发明一种实施方式，本发明的所述抗原蛋白的纯化方法中，所述步骤(2)中所述细胞为原核细胞；优选地，所述细胞为E.coli。

作为本发明一种实施方式，本发明的所述抗原蛋白的纯化方法中，所述步骤(2)中所述酶解温度为16℃。

作为本发明一种实施方式，本发明的所述抗原蛋白的纯化方法中，所述步骤(1)中所述抗原蛋白选自非洲猪瘟病毒EP153R蛋白、E248R蛋白、A238L蛋白、CD2v蛋白、CP312R蛋白、P22蛋白、P30蛋白、P54蛋白和pK205R蛋白；鸡传染性贫血病毒VP1蛋白和VP2蛋白；禽腺病毒Penton蛋白，禽腺病毒Fiber-2蛋白；禽减蛋综合征病毒Penton蛋白，禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白；鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白；猪圆环病毒3型Cap蛋白；猪圆环病毒2型Cap蛋白；猪伪狂犬病病毒gB蛋白，猪伪狂犬病病毒gD蛋白；猪细小病毒VP2蛋白；猪瘟病毒E2蛋白；牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白，牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白；口蹄疫病毒VP0蛋白，口蹄疫病毒VP3蛋白，口蹄疫病毒VP1蛋白；兔瘟病毒VP60蛋白；以及日本血吸虫GALE蛋白，和日本血吸虫Wnt5蛋白。

本发明还提供了所述的方法制备的高效核酸酶在抗原蛋白纯化中的应用。

本发明通过毕赤酵母GS115菌株实现SM-Nu的高效分泌表达，表达产物可快速、高效的裂解核酸等组份。本发明高效核酸酶可应用到多种大肠杆菌源亚单位抗原蛋白的纯化过程，且能够用于真核细胞表达外源蛋白过程中核酸的去除，具有广泛的适用范围。

本发明按照毕赤酵母偏爱密码子合成的高效核酸酶基因可以在毕赤酵母中表达出可溶性高效核酸酶并分泌至胞外，表达量达到0.2mg/mL，克服了野生型基因无法表达出可溶性高效核酸酶的问题；进一步的，通过截短N端区域，意外的发现高效核酸酶活性明显增强，酶活性达到500KU/mL，提高了10倍。制备方法制备的SM-Nu蛋白，在生物安全性上对动物的生长发育无不良反应，在免疫原性和免疫效力上对所纯化的抗原蛋白无影响，可以应用于多种亚单位疫苗的纯化过程。

作为本发明的一种实施方式，本发明的所述应用中，所述抗原蛋白选自非洲猪瘟病毒EP153R蛋白、E248R蛋白、A238L蛋白、CD2v蛋白、CP312R蛋白、P22蛋白、P30蛋白、P54蛋白和pK205R蛋白；鸡传染性贫血病毒VP1蛋白和VP2蛋白；禽腺病毒Penton蛋白，禽腺病毒Fiber-2蛋白；禽减蛋综合征病毒Penton蛋白，禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白；鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白；猪圆环病毒3型Cap蛋白；猪圆环病毒2型Cap蛋白；猪伪狂犬病病毒gB蛋白，猪伪狂犬病病毒gD蛋白；猪细小病毒VP2蛋白；猪瘟病毒E2蛋白；牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白，牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白；口蹄疫病毒VP0蛋白，口蹄疫病毒VP3蛋白，口蹄疫病毒VP1蛋白；兔瘟病毒VP60蛋白；以及日本血吸虫GALE蛋白，和日本血吸虫Wnt5蛋白。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述应用中，所述抗原蛋白选自非洲猪瘟EP153R、E248R和A238L蛋白；以及鸡传染性贫血病毒VP1和VP2蛋白。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

全能核酸酶，又称广谱核酸酶，英文名称Benzonase Nuclease，一种来源于Serratia Marcescen的非特异性核酸内切酶，可在链内任意核苷酸间进行切割，将核酸完全消化成3-5个碱基长度的5'-单磷酸寡核苷酸，能够在非常广泛的条件下降解所有形式的(双链，单链，线状，环状，天然或变性)DNA和RNA。

“EP153R蛋白”，非洲猪瘟病毒编码的蛋白，参与免疫调节，类似于细胞以及痘病毒中C-型凝集素样蛋白，具有调节细胞功能，参与血凝。

“E248R蛋白”，非洲猪瘟病毒编码的蛋白，氧化还原通路中二硫键形成所需蛋白，结构蛋白。

“A238L蛋白”，非洲猪瘟病毒编码的蛋白，钙调神经磷酸酶抑制因子，C末端结合到钙神经素的催化亚基上可以抑制它的磷酸酶活性，参与抑制宿主免疫调节基因的转录激活。

“VP1蛋白”，为鸡传染性贫血病毒核衣壳蛋白，为鸡传染性贫血病毒粒子表面唯一的衣壳蛋白，分子量为52Ku，为主要免疫原蛋白。

鸡传染性贫血病毒抗原蛋白VP2蛋白，鸡传染性贫血病毒为CAV的非结构蛋白,协助VP1完成病毒的组装。

实施例1 SM-Nu的分泌表达

1.1重组载体的构建

1.1.1设计合成引物

根据GeneBank中Serratia marcescens基因组序列中SM-Nu基因的核苷酸序列，将其进行密码子优化，优化后的序列如SEQ ID NO.1所示，然后合成、重组至pUC57载体，命名为pUC57::SM-Nu1。利用Primer 5.0设计引物，上下游引物如下所示，用于SEQ ID NO.1基因序列的全长表达。其中，SM-Nu基因与所用引物的合成均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

SM-Nu1-F:CCGGAATTCATGCGGTTCAATAATAAGAA

SM-Nu-R:AAGGAAAAAAGCGGCCGCATTCTTACATCCCATAAGTT

1.1.2克隆至pPICZɑA载体

以pUC57::SM-Nu1载体为模板，使用设计合成的SM-Nu1-F/SM-Nu-R引物组PCR扩增SM-Nu1基因，目的片段大小为800bp左右。PCR反应条件为：95℃3min；95℃20s，56℃20s，72℃30s，共35个循环；72℃5min。PCR产物电泳后使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化，获得的DNA片段使用EcoR I和Not I双酶切，并与相同双酶切处理的pPICZɑA质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞，筛选阳性克隆。提取转化子质粒并使用EcoR I和Not I进行双酶切鉴定，阳性质粒可酶切得到大小分别为3600和800bp左右的片段。酶切鉴定正确的质粒进行测序分析，测序验证正确的重组质粒命名为pPICZɑA::SM-Nu1。

1.2.酵母感受态细胞的制备

挑取GS115酵母单克隆接种于YPD液体培养基中，30℃、200r/min培养至OD₆₀₀值为0.8～1左右。取5mL培养液于4℃、5000r/min条件下，离心5min收集菌体细胞；先使用1mL预冷的无菌去离子水，在同样的离心条件下洗涤菌体沉淀，重复2次，以去除菌体沉淀中含有的培养基成份；其次，使用1mL预冷的1mol/L山梨醇洗涤菌体沉淀，重复2次，最终使用80μL的1mol/L山梨醇重悬菌体细胞，备用。

1.3.pPICZɑA::SM-Nu1重组载体线性化与电转

将步骤1.1.2中所得重组载体pPICZɑA::SM-Nu1使用Sac I进行酶切消化，所得产物使用普通DNA纯化回收试剂盒进行纯化回收。线性化后的重组载体pPICZɑA::SM-Nu1与步骤1.2中所得的GS115酵母感受态细胞混匀后，加入2mm的电击杯中进行电转化。电转条件如下：电压2000V；电阻200Ω；电击时长5ms。电转化后的感受态细胞迅速与1mL的1mol/L山梨醇混合均匀，于30℃、200r/min条件下孵育1.5h后，涂布至添加有100μg/mL博来霉素的YPD平板上，进行转化子的筛选。

1.4.重组转化子的筛选

1.4.1设计合成引物

根据毕赤酵母GS115菌株的基因组序列(Genebank ID:NC_012963)，利用Primer5.0设计引物，并由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

5'-AOX1-F:GACTGGTTCCAATTGACAAGC

3'-AOX1-R:GCAAATGGCATTCTGACATCC

1.4.2重组转化子的PCR鉴定

挑取步骤1.3中抗性平板上的转化子，并使用酵母基因组DNA提取试剂盒提取转化子基因组DNA。使用5'-AOX1-F/3'-AOX1-R引物组，以提取的转化子的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃3min；95℃20s，56℃20s，72℃30s，共35个循环；72℃5min。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，阳性转化子基因组DNA为模板可扩增出两条目的条带，大小分别为2200和1400bp左右；构建的重组载体中，目的基因位于5′AOX1和3′AOX1中间，扩增用上下游引物分别位于5′AOX1和3′AOX1的外侧。含目的基因的重组载体重组整合至酵母基因组上后，会有一组酵母自身原始的5′AOX1和3′AOX1序列片段，同时还会存在一组中间带有目的基因的5′AOX1----SM-Nu----3′AOX1序列片段。因此，所用引物可同时扩增出两组片段，两种片段的大概相差一个目的基因的大小。而野生型GS115基因组DNA为模板只能扩增出一条目的条带，大小为2200bp左右。经验证正确的重组转化子命名为GS115/SM-Nu1。

1.5.SM-Nu1的表达

将验证正确的GS115/SM-Nu1单克隆接种于YPD液体培养基中，30℃、200r/min培养24h左右后，按1％接种比接种至BMGY培养基。于相同条件下继续培养24h左右后，6000r/min离心10min收集菌体细胞，并使用BMMY培养基进行重悬(OD₆₀₀值在1～2之间)，同时向培养体系中添加终浓度为1.5％的甲醇，诱导目的蛋白表达，诱导96h后结束培养、收集上清，诱导期间每24h补加一次甲醇。SDS-PAGE检测上清，可检测出大小为38KDa左右的两条蛋白条带，表明目的蛋白发生了糖基化修饰。检测表达量达到0.2mg/mL。

实施例2截短型SM-Nu的分泌表达

将截去N端1～21AA区域的SM-Nu2序列(SEQ ID NO.2)进行表达。

2.1重组载体的构建与线性化

2.1.1设计合成引物

根据截去N端的SM-Nu2的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)，利用Primer5.0设计引物，用于SEQ ID NO.2基因序列的表达。其中，基因与所用引物的合成均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

SM-Nu2-F:CCGGAATTCGATACATTAGAATCTATTGA

SM-Nu-R即实施例1中步骤1.1.1所用引物SM-Nu-R序列

2.1.2SM-Nu2克隆至pPICZɑA载体

以实施例1中构建的pPICZɑA::SM-Nu1载体为模板，使用设计合成的SM-Nu2-F/SM-Nu-R引物组PCR扩增SM-Nu2基因，目的片段大小为740bp左右。PCR反应条件为：95℃3min；95℃20s，56℃20s，72℃25s，共35个循环；72℃5min。具体构建过程与方法，参照实施例1中步骤1.1进行。使用EcoR I和Not I对所得重组质粒进行双酶切鉴定，阳性质粒酶切得到大小分别为3600和740bp的片段。测序验证正确的重组载体命名为pPICZɑA::SM-Nu2。

2.1.3pPICZɑA::SM-Nu2载体线性化

使用Sac I于37℃条件下酶切消化2.1.2的pPICZɑA::SM-Nu2载体1h，所得产物使用普通DNA纯化回收试剂盒进行纯化回收。

2.2酵母感受态细胞的制备与电转化

参照实施例1中相关操作步骤进行酵母感受态细胞的制备与电转化，转化得到的转化子使用实施例1中5'-AOX1-F/3'-AOX1-R引物组提取的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，可扩增出大小分别为2200和1330bp的片段，而野生型GS115基因组DNA为模板只能扩增出一条目的条带，大小为2200bp，验证正确的重组转化子命名为GS115/SM-Nu2。

2.3重组转化子的筛选与SM-Nu2的表达

参照实施例1中相关操作步骤进行，利用GS115/SM-Nu2表达的SM-Nu2蛋白，经SDS-PAGE可鉴定出大小为35KDa左右的两条蛋白条带。检测表达量达到0.25mg/mL。

2.4酶活力分析

定义在37℃条件下、30min内使待测样品ΔA260值降低1.0(相当于完全消化37μgDNA)的酶量定义为一个酶活单位U。根据研究报道，SM-Nu在终浓度1～2mmol/L Mg²⁺存在、pH6.0～10.0条件下具有最高酶切活性。将实施例1和2中诱导96h的培养上清于37℃条件下、在包含终浓度1～2mmol/L Mg²⁺、pH7.0的缓冲体系中与底物反应30min进行酶活检测。根据酶活检测结果，SM-Nu2的酶活为500KU/mL，是SM-Nu1酶活的10倍。

实施例3 SM-Nu2在大肠杆菌源非洲猪瘟抗原蛋白纯化过程中的应用

3.1表达非洲猪瘟EP153R、E248R和A238L蛋白重组大肠杆菌的制备

将构建的pET28a-EP153R、pET28a-E248R和pET28a-A238L重组载体，转化至BL21(DE3)感受态细胞中，并于LB抗性平板上筛选重组转化子，所得重组转化子分别命名为BL21(DE3)/pET28a-EP153R、BL21(DE3)/pET28a-E248R和BL21(DE3)/pET28a-A238L。将重组转化子分别接种于LB液体培养基，并于37℃、220r/min条件下培养8h左右后，保藏备用。

3.2非洲猪瘟EP153R、E248R和A238L蛋白的诱导表达

将保藏的BL21(DE3)/pET28a-EP153R、BL21(DE3)/pET28a-E248R和BL21(DE3)/pET28a-A238L接种于LB液体培养基，37℃、220r/min条件下培养8h左右后，按1％接种于发酵培养基中(LB液体培养基，500mL规格摇瓶，装液量200mL)；37℃、220r/min培养至OD₆₀₀为0.8左右时，降温至28℃，并添加终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导目的蛋白表达，诱导时长12h。

3.3 EP153R、E248R和A238L蛋白纯化前处理

将诱导后的BL21(DE3)/pET28a-EP153R、BL21(DE3)/pET28a-E248R和BL21(DE3)/pET28a-A238L菌液，于8000r/min条件下离心10min收集菌体细胞；所得菌体细胞使用缓冲液A(20mmol/L Tris、500mmol/L NaCl、pH7.0)按照体积比1:10进行重悬，并使用高压均质机于800bar压力下破碎3～5个循环；所得BL21(DE3)/pET28a-E153R、BL21(DE3)/pET28a-E248R和BL21(DE3)/pET28a-A238L破碎样品添加1/100(体积比)的SM-Nu2进行酶切处理，每种样品分别设置未添加核酸酶组作为对照。酶切条件为：16℃恒温酶切6h。

3.4核酸酶作用效果评价

利用重力流速实验法对比核酸酶处理组及对照组上清的黏度，并对其膜过滤载量进行考察，以此来分析SM-Nu2对大肠杆菌破碎样品中核酸的去除效果。

具体方法为：使用1.2mL的小型移液吸头(Eppendorf,Wesseling-Berzdorf,Germany)，向其中加入1mL待测样品，静置至样品不再从吸头中流出，通过对比流出样品所占样品总量的百分比考察样品的黏度；此外，SM-Nu2酶切处理后的样品13000r/min离心15min，所得上清使用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤，对比膜过滤的载量。结果显示，BL21(DE3)/pET28a-E153R、BL21(DE3)/ET28a-E248R和BL21(DE3)/pET28a-A238L对应SM-Nu2处理组样品流出量分别占其上样总量的74％、78％和75％左右，较对照组均分别提高了4倍左右；SM-Nu2处理组样品膜过滤载量均为未添加核酸酶处理组的2倍左右。

实施例4 SM-Nu2在大肠杆菌源鸡传染性贫血病毒抗原蛋白纯化过程中的应用

4.1表达鸡传染性贫血病毒VP1和VP2蛋白重组大肠杆菌的制备

将构建的pET28a-VP1和pET28a-VP2重组载体，转化至BL21(DE3)感受态细胞中，并于LB抗性平板上筛选重组转化子，所得重组转化子分别命名为BL21(DE3)/pET28a-VP1和BL21(DE3)/pET28a-VP2。将重组转化子分别接种于LB液体培养基，并于37℃、220r/min条件下培养8h左右后，保藏备用。

4.2鸡传染性贫血病毒VP1和VP2蛋白的诱导表达

将保藏的BL21(DE3)/pET28a-VP1和BL21(DE3)/pET28a-VP2接种于LB液体培养基，37℃、220r/min条件下培养8h左右后，按1％接种于发酵培养基中(LB液体培养基，500mL规格摇瓶，装液量200mL)；37℃、220r/min培养至OD₆₀₀为0.8左右时，降温至28℃，并添加终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导目的蛋白表达，诱导时长12h。

4.3 VP1和VP2蛋白纯化前处理

将诱导后的BL21(DE3)/pET28a-VP1和BL21(DE3)/pET28a-VP2菌液，于8000r/min条件下离心10min收集菌体细胞；所得菌体细胞使用缓冲液B(20mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O，20mmol/L NaH₂PO₄·2H₂O，1mol/L NaCl，pH 7.0)按照体积比1:20进行重悬，并使用高压均质机于800bar压力下破碎3～5个循环，所得BL21(DE3)/pET28a-VP1和BL21(DE3)/pET28a-VP2破碎样品13000r/min离心30min分离上清和沉淀；所得上清添加1％的核酸酶于16℃酶切处理16h，设置未添加核酸酶组作为对照。

酶切处理后的样品中分别添加终浓度为0.05％的PEI(70k)，8000r/min离心10min，所得分离上清降温至10℃以下添加终浓度为0.5％的TritonX-114，然后升温至22℃添加终浓度1％的活性炭，搅拌均匀后8000r/min离心10min，取上清添加1％的活性炭重复操作；活性炭处理后所得上清添加终浓度40％的硫酸铵，于4℃搅拌30min后8000r/min离心10min，所得沉淀使用PBS(添加有终浓度0.2mmol/L的精氨酸)充分重悬。

4.4核酸酶作用效果评价

核酸酶处理组及对照组按照实施例3中所述利用重力流速实验法及膜过滤载量对比的相关方法，考察SM-Nu2去除破碎样品中核酸的作用效果。结果，BL21(DE3)/pET28a-VP1和BL21(DE3)/pET28a-VP2对应SM-Nu2处理组样品流出量分别占其上样总量的71％和78％左右，较对照组均分别提高了4倍左右；SM-Nu2酶切处理后样品13000r/min离心15min，所得上清使用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤，其中BL21(DE3)/pET28a-VP1对应核酸酶处理组膜过滤载量为对照组的2倍，BL21(DE3)/pET28a-VP2对应处理组的膜过滤载量为对照组的3倍左右。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 普莱柯生物工程股份有限公司

<120> 一种制备高效核酸酶的方法及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 798

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）

<400> 1

atgcggttca ataataagaa tgtgggtttg ggcgcccttc tatttgctgc acaggcttcg 60

gccgatacat tagaatctat tgacaattgc gccgtgggct gccctacggg cggaagctca 120

aatgtcagta tagtaaggca cgcgtacacg ttgaataata attccacgac aaaatttgct 180

aactgggtgg cctaccacat aacgaaagat acgccagcga gtggcaagac aagaaattgg 240

aagacagatc cagccttaaa tccggctgat accctcgcac ccgctgacta cacgggtgcc 300

aatgctgcgc tcaaggtaga ccgcggacat caggcaccgt tggcgtcgct agctggtgta 360

agcgactggg agtcactgaa ttacttgagt aatattacgc cccaaaagtc agatctaaat 420

cagggtgcct gggctaggct cgaggaccag gagaggaaac tcattgaccg cgcggacatt 480

agctctgtat acactgtaac gggtccgcta tacgagcggg acatgggcaa actcccgggc 540

acacaaaaag ctcatactat acctagcgcc tactggaagg tcatctttat taataacagc 600

cccgccgtga atcactacgc cgccttctta tttgatcaga acacaccaaa gggtgcggac 660

ttctgccagt tccgcgtcac cgtggacgag attgagaaga gaacaggtct cataatatgg 720

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cttatgggat gtaagaat 798

<210> 2

<211> 735

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）

<400> 2

gatacattag aatctattga caattgcgcc gtgggctgcc ctacgggcgg aagctcaaat 60

gtcagtatag taaggcacgc gtacacgttg aataataatt ccacgacaaa atttgctaac 120

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gctgcgctca aggtagaccg cggacatcag gcaccgttgg cgtcgctagc tggtgtaagc 300

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tctgtataca ctgtaacggg tccgctatac gagcgggaca tgggcaaact cccgggcaca 480

caaaaagctc atactatacc tagcgcctac tggaaggtca tctttattaa taacagcccc 540

gccgtgaatc actacgccgc cttcttattt gatcagaaca caccaaaggg tgcggacttc 600

tgccagttcc gcgtcaccgt ggacgagatt gagaagagaa caggtctcat aatatgggct 660

ggcctcccag atgatgtcca ggcttcccta aagagtaaac ccggtgttct tcctgaactt 720

atgggatgta agaat 735

Claims (9)

1.一种制备高效核酸酶的方法，其中，所述方法包括：

步骤(1)克隆所述高效核酸酶的基因，重组到载体，得到包含有所述高效核酸酶基因的载体，其中，所述高效核酸酶基因如SEQ ID No.1所示，或者所述高效核酸酶基因如SEQ IDNo.2所示；

步骤(2)将所述包含有高效核酸酶基因的载体转化至酵母细胞，筛选基因组中重组有所述高效核酸酶基因的酵母细胞；

步骤(3)对所述基因组中重组了所述高效核酸酶基因的酵母细胞进行诱导表达，得到分泌表达的所述高效核酸酶；以及

步骤(4)分离所述分泌表达的高效核酸酶，纯化，得到所述高效核酸酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)中所述载体为pPICZɑA载体，所述步骤(2)中所述酵母细胞为酵母GS115株；所述步骤(3)中所述诱导的诱导剂为甲醇。

3.一种抗原蛋白的纯化方法，其中，所述纯化方法包括：

步骤(1)将表达所述抗原蛋白的细胞破碎裂解，释放胞内表达的所述抗原蛋白；

步骤(2)在所述步骤(1)的所述裂解释放的抗原蛋白中添加所述权利要求1～2任一项所述的方法制备的高效核酸酶，酶解所述破碎细胞中的核酸；以及

步骤(3)待所述步骤(2)的所述酶解完成后，分离所述抗原蛋白。

4.根据权利要求3所述的纯化方法，其中，所述步骤(2)中所述细胞为原核细胞；优选地，所述细胞为E.coli。

5.根据权利要求3所述的纯化方法，其中，所述步骤(2)中所述酶解温度为16℃。

6.根据权利要求3所述的纯化方法，其中，所述步骤(1)中所述抗原蛋白选自非洲猪瘟病毒EP153R蛋白、E248R蛋白、A238L蛋白、CD2v蛋白、CP312R蛋白、P22蛋白、P30蛋白、P54蛋白和pK205R蛋白；鸡传染性贫血病毒VP1蛋白和VP2蛋白；禽腺病毒Penton蛋白，禽腺病毒Fiber-2蛋白；禽减蛋综合征病毒Penton蛋白，禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白；鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白；猪圆环病毒3型Cap蛋白；猪圆环病毒2型Cap蛋白；猪伪狂犬病病毒gB蛋白，猪伪狂犬病病毒gD蛋白；猪细小病毒VP2蛋白；猪瘟病毒E2蛋白；牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白，牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白；口蹄疫病毒VP0蛋白，口蹄疫病毒VP3蛋白，口蹄疫病毒VP1蛋白；兔瘟病毒VP60蛋白；以及日本血吸虫GALE蛋白，和日本血吸虫Wnt5蛋白。

7.根据权利要求1～2任一项所述的方法制备的高效核酸酶在抗原蛋白纯化中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述抗原蛋白选自非洲猪瘟病毒EP153R蛋白、E248R蛋白、A238L蛋白、CD2v蛋白、CP312R蛋白、P22蛋白、P30蛋白、P54蛋白和pK205R蛋白；鸡传染性贫血病毒VP1蛋白和VP2蛋白；禽腺病毒Penton蛋白，禽腺病毒Fiber-2蛋白；禽减蛋综合征病毒Penton蛋白，禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白；鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白；猪圆环病毒3型Cap蛋白；猪圆环病毒2型Cap蛋白；猪伪狂犬病病毒gB蛋白，猪伪狂犬病病毒gD蛋白；猪细小病毒VP2蛋白；猪瘟病毒E2蛋白；牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白，牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白；口蹄疫病毒VP0蛋白，口蹄疫病毒VP3蛋白，口蹄疫病毒VP1蛋白；兔瘟病毒VP60蛋白；以及日本血吸虫GALE蛋白，和日本血吸虫Wnt5蛋白。

9.根据权利要求8所述的所述的应用，其中，所述抗原蛋白选自非洲猪瘟EP153R、E248R和A238L蛋白；以及鸡传染性贫血病毒VP1和VP2蛋白。