TWI805025B - 即時性蛋白產製平台及自動組裝該即時性蛋白產製平台之方法 - Google Patents

Abstract

本發明係揭露一種即時性蛋白產製平台及自動組裝該即時性蛋白產製平台之方法，其中，即時性蛋白產製平台係能夠提供一種BaMV重組病毒顆粒，能夠藉由外鞘蛋白與目標蛋白進行即時性地接合，有效地維持目標蛋白與BaMV重組病毒顆粒之結構穩定性，並能達到高效率產製目標蛋白之功效；此外，由於該BaMV重組病毒顆粒能夠於植物細胞內自動組裝獲得，且不需要進行任何前處理程序，可立即使用於呈現各種目標蛋白，因而能夠提升製造過程之安全性，亦能夠降低製造成本。

Description

即時性蛋白產製平台及自動組裝該即時性蛋白產製平台之方法

本發明係有關於一種重組病毒表現載體，特別係指一種即時性蛋白產製平台及自動組裝該即時性蛋白產製平台之方法。

按，目前利用病毒顆粒或類病毒顆粒（Virus-like particles, VLPs）作為呈現目標蛋白的框架之技術，可分為兩種方式：

第一種方式係將目標蛋白與病毒外鞘蛋白（Coat protein, CP）之基因重組融合，使所產生的重組病毒顆粒表面直接呈現目標蛋白，但表現過程常會造成兩種蛋白之互相干擾，造成目標蛋白摺疊錯誤而失去預期活性，或重組病毒外鞘蛋白無法組裝為病毒顆粒，以致無法使用，因而未避免上述缺失產生，該方法僅能用於小片段之蛋白質（胜肽）。

第二種方式係為先行生產原型病毒顆粒，進行病毒顆粒之純化，再進行酵素或化學方式修飾病毒顆粒，使目標蛋白以酵素或化學方式連結於病毒顆粒表面，造成操作時間與困難度增加；並且，若是採用如化學連結劑之化學方式修飾病毒顆粒，於目標蛋白與病毒顆粒間之連結反應結束後，尚須以透析方式將化學連結劑移除，導致程序繁瑣及費時。

本發明之主要目的係在於提供一種即時性蛋白產製平台及自動組裝該即時性蛋白產製平台之方法，其係能夠將大量目標蛋白呈現於重組竹嵌紋病毒（Bamboo mosaic virus，BaMV）顆粒表面，藉此能夠做一個高效率、低成本之目標蛋白高量呈現系統，而能夠廣泛地被應用於產製醫療蛋白、疫苗或是各式蛋白之生產。

本發明之另一目的係在於提供一種即時性蛋白產製平台及自動組裝該即時性蛋白產製平台之方法，其係透過植物生產的重組植物病毒顆粒來作為目標蛋白呈現之工具，因此能夠避免以動物細胞或是細菌作為蛋白呈現工具所造成之不安全性，並且能夠簡化製造步驟，有效地降低製造及生產成本。

本發明之次一目的係在於提供一種即時性蛋白產製平台及自動組裝該即時性蛋白產製平台之方法，其係能夠於植物細胞內自動組裝出可即時性與目標蛋白接合之重組植物病毒顆粒，不僅具有結構上之穩定性，並且能夠大量呈現目標蛋白。

緣是，為能達成上述目的，本發明之一實施例中係揭露即時性蛋白產製平台，其係包含有一竹嵌紋病毒重組病毒顆粒，其中：該竹嵌紋病毒重組病毒顆粒係由複數個重組竹嵌紋病毒外鞘蛋白單體所組裝而成者；並且各該重組竹嵌紋病毒外鞘蛋白單體之N端係具有至少一突出之接合點，用以與一目標蛋白藉由一蛋白合成酶之作用而彼此接合，使該目標蛋白表呈於該竹嵌紋病毒重組病毒顆粒表面。

其中，該突出之接合點為一甘胺酸殘基，具體來說，為五個甘胺酸所組成之殘基。

於本發明之另一實施例中係揭露該竹嵌紋病毒重組病毒顆粒之製備方法，包含有下列步驟：

（a）構築一重組竹嵌紋病毒，其中：

該重組竹嵌紋病毒之基因體係包含有一第一序列及一第二序列，該第一序列係為一編碼為蛋白質截切酶之核酸，用以取代原基因體上之三基因區塊蛋白（Triple-gene-block proteins，TGBps）編碼區，該第二序列係為一編碼為重組BaMV外鞘蛋白之核酸；

該第二序列係由一編碼為BaMV外鞘蛋白之核酸與一編碼為對應該蛋白質截切酶辨識切位點之核酸所組成。

（b）將該重組竹嵌紋病毒接種至一植物，如圓葉菸草。

（c）該重組竹嵌紋病毒於該植物細胞內表現該第一序列及該第二序列，得到一蛋白質截切酶及一重組BaMV外鞘蛋白，其中，該重組BaMV外鞘蛋白係包含有該蛋白質截切酶辨識切位點。

（d）該蛋白質截切酶自該重組BaMV外鞘蛋白上之該蛋白質截切酶辨識切位點進行截切，得到一重組BaMV外鞘蛋白單體。

（e）組裝複數重組BaMV外鞘蛋白而形成該竹嵌紋病毒重組病毒顆粒。

其中，該蛋白質截切酶係為TEV（Tobacco Etch Virus）蛋白酶、furin蛋白酶、pepsin蛋白酶或其他蛋白酶。

其中，該步驟a中係藉由基因重組技術以該第一序列取代該竹嵌紋病毒載體基因體上之三基因區塊蛋白編碼區；並且，將該BaMV外鞘蛋白N端35個胺基酸編碼區域以該編碼為對應該蛋白質截切酶辨識切位點之核酸取代。

其中，該重組竹嵌紋病毒載體係具有至少一35S啟動子，而啟動子數量以2個以上為佳。

其中，該突出之接合點係一由複數個甘胺酸組成之序列。

本發明所揭該竹嵌紋病毒重組病毒顆粒之製備方法係透過該竹嵌紋病毒重組病毒能於植物細胞中同時表現重組BaMV外鞘蛋白及該蛋白質截切酶，使蛋白質截切酶自動地於植物細胞內截切出BaMV外鞘蛋白單體，以能於植物細胞內自動組裝且產製出竹嵌紋病毒重組病毒顆粒。而透過上述方法所製備之竹嵌紋病毒重組病毒顆粒係能作為即時性蛋白產製平台中之主要工具。

本發明之另一實施例係提供一種即時性蛋白產製平台之製備方法，其包含有下列步驟：

（a）取得該竹嵌紋病毒重組病毒顆粒，其中，該竹嵌紋病毒重組病毒顆粒係得由上述方法所製備而得，亦得由生物重組技術所製備而得。

（b）取得一目標蛋白。

（c）將該竹嵌紋病毒重組病毒顆粒與該目標蛋白混合，該竹嵌紋病毒重組病毒顆粒以外鞘蛋白N端上突出之接合點與該目標蛋白接合；

（d）該目標蛋白於該竹嵌紋病毒重組病毒顆粒表面呈現。

其中，該目標蛋白係為一抗原蛋白，例如為一病毒之套膜蛋白。

其中，該步驟c中之該目標蛋白與該竹嵌紋病毒重組病毒顆粒係藉由一蛋白合成酶於該目標蛋白與各該突出之接合點間建立肽鍵而接合。

其中，該目標蛋白係為一重組蛋白，具有該蛋白合成酶可辨識之位點，例如當該蛋白合成酶為一轉肽酶，該目標蛋白上係具有可供轉肽酶辨識之位點。

本發明係揭露一種即時性蛋白產製平台及自動組裝該即時性蛋白產製平台之方法，其中，該即時性蛋白產製平台主要係利用於一BaMV重組病毒顆粒（Chimeric virus particle，以下簡稱CVP）即時性地與一目標蛋白結合，以使該目標蛋白能夠大量地於該BaMV重組病毒顆粒表面上呈現。更進一步來說，BaMV重組病毒顆粒係呈長絲狀，由複數個N端具有至少一裸露（或突出）甘胺酸之外鞘蛋白單體所組成，並係利用蛋白合成酶與任何帶有蛋白合成酶辨識位之目標蛋白進行即時性結合，使目標蛋白係能表現於BaMV重組病毒顆粒表面突出之甘胺酸上。

必須強調者，本發明所揭即時性蛋白產製平台係透過BaMV重組病毒顆粒之外鞘蛋白與目標蛋白間直接接合達到大量產製目標蛋白之功效，而非如習知技術般採取將BaMV重組病毒顆粒之外鞘蛋白與目標蛋白以融合蛋白之方式連結，因此，於植物體內進行BaMV重組病毒顆粒組裝時不會受到目標蛋白之干擾，且目標蛋白亦不會影響到外鞘蛋白之構形正確性。

其中，該蛋白合成酶係指能夠使目標蛋白與外鞘蛋白N端突出之甘胺酸進行接合作用者，例如轉肽酶（Sortase A，SrtA）係能夠使目標蛋白與外鞘蛋白裸露出甘胺酸間產生肽鍵而接合。

透過本案所揭BaMV重組病毒顆粒作為產製目標蛋白之工具時，目標蛋白之胺基酸數量未有限制，根據本發明所揭實施例可知，本發明所揭即時性蛋白產製平台係能夠生產序列長度超過100個胺基酸之蛋白。

具體來說，目標蛋白係為日本腦炎病毒的套膜蛋白第三區域（ Japanese encephalitis virus recombinant envelope protein domain III，JEV rEDIII），具有111個胺基酸，如圖1所示，JEV rEDIII蛋白係可透過轉肽酶SrtA催化與本發明所揭BaMV重組病毒顆粒之外鞘蛋白接合，得到BJLPET5G CVP。而經過定量分析可知，約1μg之BaMV重組病毒顆粒之外鞘蛋白能夠接合97 ng之JEV rEDIII蛋白，意即本發明所揭即時性蛋白產製平台所提供之BaMV重組病毒顆粒的每5個外鞘蛋白單體可與1個rEDIII蛋白進行接合反應。

本發明所揭即時性蛋白產製平台之特點在於係能夠以植物作為宿主細胞，而使重組竹嵌紋病毒於植物細胞內進行自動截切及自動組裝地產製出大量之BaMV重組病毒顆粒，並且由於BaMV重組病毒顆粒係不需要經由任何前處理程序，即能以其外鞘蛋白上裸露之胺基酸殘基即時地與目標蛋白進行結合，當帶有重組竹嵌紋病毒之細菌感染植物後，重組竹嵌紋病毒係能於植物體內大量生產及組裝成為能夠用以攜帶目標蛋白的BaMV重組病毒顆粒，而基於每個BaMV重組病毒顆粒都是由複數個重組竹嵌紋病毒之外鞘蛋白所組成，因此，透過本發明所揭即時性蛋白產製平台係能夠達到提升目標蛋白生產效率及安全性、降低生產目標蛋白成本之功效。

於本發明之實施例中，BaMV重組病毒顆粒係由平均數量為8～2200個N端具有至少一裸露（或突出）甘胺酸之外鞘蛋白單體所組成，該些外鞘蛋白單體係排列成具有高度規則性重複的螺旋狀對稱結構，因此，本發明所揭BaMV重組病毒顆粒係適合用於大量呈現抗原蛋白，並能誘發較高力價的免疫反應，特別適用於疫苗的快速開發。

更進一步來說，本發明所揭即時性蛋白產製平台之製備方法係包含有下列步驟：

a.將竹嵌紋病毒進行基因改造而得到重組竹嵌紋病毒，其中，重組竹嵌紋病毒之基因體係被構築成包含有一編碼為蛋白質截切酶之序列，用以取代原竹嵌紋病毒載體基因體上之三基因區塊蛋白（Triple-gene-block proteins，TGBps）編碼區，及一編碼為重組BaMV外鞘蛋白之序列，係由編碼為BaMV外鞘蛋白之核酸及編碼對應該蛋白質截切酶之辨識切位點之核酸所組成；

b.將重組竹嵌紋病毒接種至一植物，使重組竹嵌紋病毒能於植物細胞內同時表現蛋白質截切酶及重組BaMV外鞘蛋白；

c.該蛋白質截切酶係於該植物細胞內自動地將重組BaMV外鞘蛋白截切為一外鞘蛋白單體，其中，該外鞘蛋白單體之N端至少帶有一裸露之甘胺酸，用以作為與一目標蛋白連結點；

d.於植物細胞內將複數個外鞘蛋白單體進行自動組裝成BaMV重組病毒顆粒。

本發明所揭重組竹嵌紋病毒具有較佳之生物封鎖性（Enhanced bio-containment），意即重組竹嵌紋病毒接種於植物後，不會於植物中或植物間移動，大幅降低重組病毒外流之環境之風險。

更進一步來說，於步驟a中係以下列步驟來進行竹嵌紋病毒基因體之改造：

將BaMV外鞘蛋白N端35個胺基酸區域置換為蛋白質截切酶辨識位，再加上4個甘胺酸，並且以蛋白質截切酶取代竹嵌紋病毒基因體上的三基因區塊蛋白。

其中，該重組竹嵌紋病毒之質體係被替換為能夠利用感染植物宿主之媒介的二元質體（Binary plasmid），例如二元質體pKn。

於本發明之實施例中，該蛋白質截切酶係為一種內切蛋白酶，如TEV（Tobacco Etch Virus）蛋白酶、furin蛋白酶或pepsin蛋白酶等。而基於竹嵌紋病毒於植物細胞內表現之重組BaMV外鞘蛋白係含有蛋白質截切酶能夠辨識之切割位點，故蛋白質截切酶能夠自動辨識且截切重組BaMV外鞘蛋白上對應之辨識位點，意即本發明所揭即時性蛋白產製平台係能夠於植物細胞中自動地產出及截切出複數個外鞘蛋白單體。

舉例來說，當蛋白質截切酶為TEV蛋白酶時，上述製備方法中系以編碼為TEV蛋白酶之基因取代竹嵌紋病毒基因體上的三基因區塊蛋白，並且，將竹嵌紋病毒外鞘蛋白N端與TEV蛋白酶辨識位（ENLYFQG）融合且加上額外之4個甘胺酸，建構出重組竹嵌紋病毒，於感染植物後，可於植物細胞內自動截切且自動組裝而產出BaMV重組病毒顆粒。由於TEV蛋白酶能夠辨識出重組嵌紋病毒外鞘蛋白N端之TEV蛋白酶辨識位，並且自Q（麩胺酸醯胺）與G（甘胺酸）間進行切割，切割後所得之重組竹嵌紋病毒外鞘蛋白會帶有5個甘胺酸之殘基，用以作為跟以轉肽酶為媒介之目標蛋白接合；意即於植物體內自動截切產出之複數個重組竹嵌紋病毒係能夠被自動組裝成為BaMV重組病毒顆粒，並且透過外鞘蛋白上之5個甘胺酸之殘基而得與目標蛋白接合，如圖2及圖3所示。

於本發明之實施例中，該植物係可為圓葉菸草。

本發明所揭竹嵌紋病毒（Bamboo mosaic virus，以下簡稱BaMV），分類學上為甲型線形病毒科（Alphaflexiviridae）馬鈴薯X病毒屬（Potexvirus）之RNA病毒，病毒顆粒為長絲狀，會感染麻竹、綠竹等植物。

本發明所揭之BaMV基因序列及結構係為先前專利已經公開，如中華民國專利公開第201713680A號、中國大陸專利公告第101611144B號。具體來說，竹嵌紋病毒具有5個主要的之開放閱讀框架（Open reading framea，ORFs），其中，編碼為ORF5之序列係能夠被轉譯為病毒外鞘蛋白（coating protein）。

以下，為說明本發明之技術特徵及其功效，將茲舉若干實例並搭配圖式進行說明如後，而下列實例僅為說明性之例示，並非用於限制本發明請求項之保護範圍。

實例一：製備BaMV重組病毒顆粒

取BaMV感染性選殖株pBS-d35CP，其外鞘蛋白之N端有35個胺基酸之序列缺失，並具有一多克隆位點：AgeI-NheI-NotI，用於插入目標多胜肽之編碼序列。將原始pBS-d35CP之質體置換為可利用農桿菌（Agrobacterium tumefacieans）媒介接種的二元質體pKn，得到pKBNd35，如圖4所示，其中，pKBNd35可利用原始pBS-d35CP之2個35S啟動子及保留病毒本身ORF1的病毒RNA複製酵素，並搭配尾端之Nos ter將目標病毒基因轉錄完成。

請再參閱圖4，將原本竹嵌紋病毒外鞘蛋白N端之35個胺基酸區域置換為TEV蛋白酶之辨識位的胺基酸序列為：ENLYFQG，且外加4個甘胺酸（Glycine），用以作為轉肽酶（SrtA）作用時的目標蛋白連結位，得到一重組BaMV感染性選殖株，命名為pKBTM4G；而後將pKBTM4G上之三基因區塊蛋白（Triple-gene-block proteins，TGBps）之編碼區置換為TEV 蛋白酶之基因，得到一重組BaMV感染性選殖株，命名為pKB5G，其接種於植物後，係能於植物細胞中自動產出重組竹嵌紋病毒之外鞘蛋白（下稱為B5G CP）。

實例二：分析pKB5G之蛋白表現

將實例一所得到之重組BaMV感染性選殖株pKB5G經由農桿菌介導方式接種於圓葉菸草（N. benthamiana）後，取培養7天後的葉子，並萃取總蛋白質，以電泳（SDS-PAGE）進行蛋白質分析。

蛋白質分析結果如圖5所示，並以西方墨點法再分析特定蛋白質之表現，結果如圖6至圖8所示；而各圖中之Lane 1 為未經任何處理之圓葉菸草葉的蛋白質分析結果；Lane 2為以農桿菌介導pKBNd35接種圓葉菸草葉子的蛋白質分析結果；Lane 3為以農桿菌介導pKBTM4G接種圓葉菸草葉子的蛋白質分析結果；Lane 4為以農桿菌介導pKB5G接種圓葉菸草葉子的蛋白質分析結果；Lane 5為以農桿菌同時介導pKB5G及pBIN-HcPro接種圓葉菸草葉子的蛋白質分析結果，其中，pBIN-HcPro係為重組病毒沉默抑制子HcPro。

由圖5至圖8之結果係可知pKB5G確實能夠於同一植物細胞內表現TEV蛋白酶與改造後的BaMV外鞘蛋白，並且BaMV外鞘蛋白係能夠確實地被TEV蛋白酶截切，成為N端帶有五個Gly突出的外鞘蛋白單體。

實例三：製備rEDIII蛋白

於本實例中係藉由大腸桿菌作為重組蛋白之生物生產平台產製rEDIII蛋白（recombinant envelope protein domain III），意即先構築好之pET29a-rEDIII-CaM質體送入大腸桿菌中，使該pET29a-rEDIII-CaM質體能於大腸桿菌中表現一蛋白質產物：rEDIII-CaM（rEDIII-LPETG-GS-6xHis-CaM-6xHis），其中，pET29a-rEDIII-CaM質體係含有轉肽酶（下稱SrtA）之辨識位點：LPETG。

實例四：分析rEDIII蛋白與B5G CP之接合條件

將B5G CP、rEDIII-CaM及SrtA進行接合反應之過程中SrtA會辨識SrtA位點：LPETG-GS片段（LPETG-GS motifs），並截切於T與G之間，從rEDIII-CaM切除CaM並與BaMV重組病毒顆粒接合，得到一分子大小約35kDa之產物，命名為BJLPET5G（rEDIII-LPET-5G-mCP）；而為能分析出B5G CP、rEDIII-CaM及SrtA進行接合反應之最適條件，將進行以下試驗：

取相同量之B5G CP、rEDIII-CaM及SrtA，分別進行不同反應時間：1、5、10、15、30、60分鐘後，分別檢測反應後之蛋白質表現，並且分析出不同反應時間下之接合效率，結果如圖9A及圖9B所示。

取不同比例之B5G CP、rEDIII-CaM及SrtA進行結合反應，時間為1分鐘，反應後分別檢測不同條件下蛋白質表現及分析接合效率，結果如圖10A及圖10B所示。

分別以下列條件進行接合反應：B5G CP、rEDIII-CaM及SrtA之重量比為1：3：1，反應時間為1分鐘；及B5G CP、rEDIII-CaM及SrtA之重量比為1：3：0.2，反應時間分別為1、5、10、15、30、45分鐘；反應後分別檢測不同條件下蛋白質表現及分析接合效率，結果如圖11A及圖11B所示。

由圖9A及圖9B之結果可知，B5G CP、rEDIII-CaM及SrtA反應時間越長，接合效率最差，其中，以反應時間為1～10分鐘時，反應效率較佳，若反應時間超過15分鐘，接合效率會大幅下降。

由圖10A及圖10B之結果可知，當rEDIII-CaM之量為B5G CP之量的2到10倍時，能夠大幅提升接合效率，意即能夠產製較多之BJLPET5G（即為表位呈現BaMV重組病毒顆粒），其中，又以B5G CP與rEDIII-CaM之重量比為1：3或高於1：3者可達到較佳之接合效率。

由圖11A及圖11B之結果可知，當減少SrtA之量時，B5G CP與rEDIII-CaM於較長反應時間下之接合效率較佳（22.5～43％），其中，以反應時間為10-15分鐘時之接合效率為佳。

綜合圖9至圖11之結果顯示，B5G CP、rEDIII-CaM及SrtA之最適反應重量比為1：3：0.2，並且分別之濃度為4.38、9.48、1.12μM。

由上述結果可知，藉由本發明所揭即時性蛋白產製平台所提供之BaMV重組病毒顆粒確實能夠透過合成蛋白酶之作用於其表面呈現目標蛋白，而BaMV重組病毒顆粒、目標蛋白及合成蛋白酶於一預定重量比下進行反應可獲得較佳之接合效率。

實例五：表位呈現BaMV重組病毒顆粒之影像分析

將BaMV-Nd35、BJLPET5G、B5G樣品分別藉由蔗糖緩衝超高速離心法進行純化後，再以電子顯微鏡觀察UA（uranyl acetate）染色及以含有特異性抗體之血清進行免疫染色之結果，結果如圖12所示，其中，，BaMV-Nd35係由有pKBNd35接種植物所產生之重組竹嵌紋病毒，並作為B5G與BJLPET5G對照組別。。

由圖12之結果可知rEDIII蛋白確實位於BJLPET5G之表面，顯示本發明所揭重組竹嵌紋病毒顆粒確實能夠以外鞘蛋白接合目標蛋白，使目標蛋白呈現於重組竹嵌紋病毒顆粒之表面。

實例七：免疫反應分析

如同上述實例中所載者，以本發明所揭BaMV 重組病毒顆粒作為抗原表現蛋白之載體，將日本腦炎病毒的套膜蛋白第三區域（JEV rEDIII）與BaMV 重組病毒顆粒外鞘蛋白N端突出之甘胺酸透過轉肽酶之作用，意即使日本腦炎病毒的套膜蛋白第三區域接合於BaMV 重組病毒顆粒表面，進而作為疫苗候選株。

進行動物接種試驗，意即將BALB/c小鼠隨機分為3組，試驗期間共28天，於試驗第0天、第11天、第26天抽血檢測，於試驗第1天進行初次接種（priming），於第12天進行追加接種（boosting），各組小鼠分別接種B5G CP（52.25μg）、純化之rEDIII蛋白（5μg）及BJLPET5G（以5μg rEDIII蛋白與52.25μg B5G CP進行接合反應所得者）。試驗結束後檢測各組小鼠血液中總抗體濃度，並且進行中和性抗體力價測試（virus neutralization test），結果如圖13A及圖13B所示。

由圖13A之結果可知，相較於接種B5G CP、rEDIII蛋白來說，初次接種BJLPET5G即可快速地增加血清中抗日本腦炎之抗體；而由圖13B之結果可知，接種BJLPET5G可於小鼠體內誘發產生中和性抗體之力價顯著高於接種B5G、rEDIII蛋白者。

由圖13A及圖13B之結果顯示，本發明所揭即時性蛋白產製平台不僅能夠用以使目標蛋白表呈於BaMV重組病毒顆粒表面，並且當目標蛋白為一抗原蛋白時，透過接種與BaMV重組病毒顆粒表面接合之目標蛋白至生物體體內係能夠明顯提升血清中抗體總量及中和性抗體之力價。

無

圖1係為重組目標蛋白JEV rEDIII與BaMV重組病毒顆粒經由轉肽酶SrtA催化而進行結合之示意圖，其中，LPET|GGS中之「∣」代表轉肽酶SrtA的截切位置。 圖2係為生產N端帶有五個Gly突出的外鞘蛋白單體之示意圖。 圖3係為以圓葉菸草自動組裝形成BaMV 重組病毒顆粒之示意圖。 圖4係建構pKBNd35及pKB5G之示意圖，其中，ENLYFQ∣G中之「∣」代表TEV蛋白酶的截切位置，4G代表4個甘胺酸。 圖5係以電泳分析經不同重組病毒感染後圓葉菸草葉子蛋白質表現之結果。 圖6係以西方墨點法分析不同重組病毒感染後圓葉菸草葉子中BaMV外鞘蛋白之表現，其中，所使用之特異性抗體為anti-BAMV CP。 圖7係以西方墨點法分析不同重組病毒感染後圓葉菸草葉子中TEV蛋白酶辨識位點之表現，其中，所使用之特異性抗體為anti-TEV site。 圖8係以西方墨點法分析不同重組病毒感染後圓葉菸草葉子中HcPro之表現，其中，所使用之特異性抗體為anti-HcPro。 圖9A係以電泳檢測相同量之B5G CP、rEDIII-CaM及SrtA於不同反應時間下之蛋白質表現。 圖9B係分析相同量之B5G CP、rEDIII-CaM及SrtA於不同反應時間下接合效率之結果。 圖10A係以電泳檢測不同比例之B5G CP、rEDIII-CaM及SrtA於相同反應時間下之蛋白質表現。 圖10B係分析不同比例之B5G CP、rEDIII-CaM及SrtA於相同反應時間下接合效率之結果。 圖11A係以電泳檢測B5G CP、rEDIII-CaM及SrtA於不同反應條件下之蛋白質表現。 圖11B係分析B5G CP、rEDIII-CaM及SrtA於不同反應條件下接合效率之結果。 圖12係以電子顯微鏡觀察BaMV-Nd35、BJLPET5G、B5G CP以UA染色及以特異性抗體進行免疫染色之結果。 圖13A係為各組小鼠於接種試驗期間檢測血清中抗體總含量之結果。 圖13B係為各組小鼠於接種試驗結束後分析其體內中和抗體力價之結果。

無

Claims (13)

1. 一種即時性蛋白產製平台，其係包含有一竹嵌紋病毒重組病毒顆粒，其中： 該竹嵌紋病毒重組病毒顆粒係由複數個重組竹嵌紋病毒外鞘蛋白單體所組裝而成者； 各該重組竹嵌紋病毒外鞘蛋白單體之N端具有至少一突出之接合點，用以與一目標蛋白藉由一蛋白合成酶之作用而彼此接合，使該目標蛋白表呈於該竹嵌紋病毒重組病毒顆粒表面。
2. 如請求項1所述即時性蛋白產製平台，其中，該突出之接合點係為一甘胺酸殘基。
3. 一種即時性蛋白產製平台之製備方法，其包含下列步驟： a.      構築一重組竹嵌紋病毒，其中： 該重組竹嵌紋病毒載體之基因體係包含有一第一序列及一第二序，該第一序列係為一編碼為蛋白質截切酶之核酸，用以取代原基因體上之三基因區塊蛋白（Triple-gene-block proteins，TGBps）編碼區，該第二序列係為一編碼為重組BaMV外鞘蛋白之核酸； 該第二序列係由一編碼為BaMV外鞘蛋白之核酸及一編碼為對應該蛋白質截切酶辨識切位點之核酸所組成； b.      將該重組竹嵌紋病毒接種至一植物； c.      該重組竹嵌紋病毒於該植物細胞內表現該第一序列及該第二序列，得到該蛋白質截切酶及該重組BaMV外鞘蛋白，其中，該重組BaMV外鞘蛋白係包含有該蛋白質截切酶辨識切位點； d.      該蛋白質截切酶自該重組BaMV外鞘蛋白上之該蛋白質截切酶辨識切位點進行截切，得到一重組BaMV外鞘蛋白單體，其中，該重組BaMV外鞘蛋白單體之N端係具有至少一突出之接合點； e.      組裝複數重組BaMV外鞘蛋白而形成一竹嵌紋病毒重組病毒顆粒； f.       將該竹嵌紋病毒重組病毒顆粒與一目標蛋白混合，該竹嵌紋病毒重組病毒顆粒係藉由該些突出之接合點分別與該目標蛋白接合，以使該目標蛋白於該竹嵌紋病毒重組病毒顆粒表面呈現。
4. 如請求項3所述即時性蛋白產製平台之製備方法，其中，該蛋白質截切酶係為TEV（Tobacco Etch Virus）蛋白酶、furin蛋白酶或pepsin蛋白酶。
5. 如請求項3所述即時性蛋白產製平台之製備方法，其中，該步驟a中係將該BaMV外鞘蛋白N端35個胺基酸編碼區域以該編碼為對應該蛋白質截切酶辨識切位點之核酸取代。
6. 如請求項3所述即時性蛋白產製平台之製備方法，其中，該步驟a中之該重組竹嵌紋病毒載體係具有至少一35S啟動子。
7. 如請求項3所述即時性蛋白產製平台之製備方法，其中，該步驟d中之該突出之接合點係一由複數個甘胺酸組成之序列。
8. 如請求項3所述即時性蛋白產製平台之製備方法，其中，該步驟f中之該目標蛋白係為一抗原蛋白。
9. 如請求項3所述即時性蛋白產製平台之製備方法，其中，該步驟f中之該目標蛋白與該竹嵌紋病毒重組病毒顆粒係藉由一蛋白合成酶於該目標蛋白與各該突出之接合點間建立肽鍵而接合。
10. 一種竹嵌紋病毒重組病毒顆粒之製備方法，其包含下列步驟： a.      構築一重組竹嵌紋病毒，其中： 該重組竹嵌紋病毒載體之基因體係包含有一第一序列及一第二序列，該第一序列係為一編碼為蛋白質截切酶之核酸，用以取代原竹嵌紋病毒載體基因體上之三基因區塊蛋白（Triple-gene-block proteins，TGBps）編碼區，該第二序列係為一編碼為重組BaMV外鞘蛋白之核酸； 該第二序列係由一編碼為BaMV外鞘蛋白之核酸與一編碼為對應該蛋白質截切酶辨識切位點之核酸所組成； b.      將該重組竹嵌紋病毒接種至一植物； c.      該重組竹嵌紋病毒於該植物細胞內表現該第一序列及該第二序列，得到一蛋白質截切酶及一重組BaMV外鞘蛋白，其中，該重組BaMV外鞘蛋白係包含有該蛋白質截切酶辨識切位點； d.      該蛋白質截切酶自該重組BaMV外鞘蛋白上之該蛋白質截切酶辨識切位點進行截切，得到一重組BaMV外鞘蛋白單體； e.      組裝複數重組BaMV外鞘蛋白而形成一竹嵌紋病毒重組病毒顆粒。
11. 如請求項10所述竹嵌紋病毒重組病毒顆粒之製備方法，其中，該蛋白質截切酶係為TEV（Tobacco Etch Virus）蛋白酶、furin蛋白酶或pepsin蛋白酶。
12. 如請求項10所述竹嵌紋病毒重組病毒顆粒之製備方法，其中，該步驟a中係將該BaMV外鞘蛋白N端35個胺基酸編碼區域以該編碼為對應該蛋白質截切酶辨識切位點之核酸取代。
13. 如請求項10所述竹嵌紋病毒重組病毒顆粒之製備方法，其中，該步驟d中之該突出之接合點係一由複數個甘胺酸組成之序列。

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