NO177794B

NO177794B - Fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein, samt nukleinsyre, ekspresjonsvektor og vertscelle som kan anvendes ved fremgangsmåten

Info

Publication number: NO177794B
Application number: NO882918A
Authority: NO
Inventors: Alan John Kingsman; Susan Mary Kingsman; Sally Elizabeth Adams
Original assignee: British Bio Technology; Oxford Gene Systems Ltd
Priority date: 1986-11-01
Filing date: 1988-06-30
Publication date: 1995-08-14
Also published as: NO882918D0; WO1988003562A1; ES2010230A6; EP0329671A1; HUT50875A; AU8153487A; JPH02501107A; EP0329671B1; NO882918L; NO177794C; DE3788806T2; DE3788806D1; AU606627B2

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte

for fremstilling av et fusjonsprotein som er i stand til spontant å danne en partikkel, en nukleinsyre som koder for fusjonsproteinet, en ekspresjonsvektor som omfatter og er i stand til å uttrykke nukleinsyren, og en vertscelle som er i stand til å uttrykke det angitte gen.

Bakgrunn for kjent teknikk

HIV, også kjent som LAV eller HTLV-III, er årsaken til ervervet immunmangelsyndrom (AIDS) (Barre-Sinoussi et al., 1983, Science 220, 868; Gallo et al., 1984, Science 224, 500; Levy et al., 1984, Science 225, 840; Clavel et al., 1986, Nature, 324, 691). På det nåværende tidspunkt foreligger det ikke noe middel mot AIDS, og det foreligger heller ingen tilgjengelig vaksine. Den genetiske organisa-sjon og den fullstendige nucleotidsekvens av HIV er kjent (Råtner et al., 1985, Nature 313, 277; Wain-Hobson et al., 1985, Cell 40, 9; Muesing et al., 1985, Nature 313, 450;

Sandoz-Pescador et al., 1985, Science, 227, 484). HIV er

et lentivirus-lignende retrovirus med gag-, pol- og env-gener som andre retrovira, men det inneholder også ytterligere kodingssekvenser, sor, tat, art/trs og 3'-orf som er medvirkende i forskjellige sider av virusreplikasjon og ekspresjon (Sodroski et al., 1985, Science 227, 171;

Sodroski et al., 1986, Nature 319, 555; Sodroski et al., 1986, Nature 321, 412; Feinberg et al., 1986, Cell 46,

807) selv om funksjonene til sor og 3'-orf er uklare.

Tre generelle fremgangsmåter kan anvendes for å fremstille en HIV-vaksine. For det første kan store mengder HIV dyrkes og inaktiveres for å tilveiebringe antigen.

For det andre kan rekombinant DNA-teknikker anvendes for å fremstille HIV-antigener enten som enkle monomere proteiner (f.eks. Putney et al., (1986), Science 234, 1392; Laskey et al., 1986, Science 233, 209) eller som vaccinia-virus-hybrider, selv om det ikke er klart at en generell anvendelse av et levende vaccinia-basert system noensinne vil bli ansett risikofritt (f.eks. Chakrabarti et al., 1986, Nature 320, 535; Zagury et al., 1987, Nature 326, 249). For det tredje kan syntetiske peptider være anvendelige (Kennedy et al., 1986, Science 231, 1556; Chanh et al. EMBO J. 5, 3065).

Mesteparten av arbeidet med fremstilling av HIV-antigener har frem til i dag konsentrert seg om fremstillingen av de to overflate-glycoproteiner som kodes for av env-genet, gpl20 og gp41 (Putney et al., op. eit.; Laskey et al., op. eit.; Certa et al., 1986, EMBO J. 5_, 3051) selv om det er utført noe arbeide med andre antigener, f.eks. tat-III (Aldovini et al.', 1986, PNAS 83_, 6672), sor (Kan et al., 1986, Science 231, 1553), pol (Veronese et al., 1986, Science 233, 1289; Kramer et al., 1986, Science 231, 1580). Fremstillingen av HIV-antigener for vaksiner eller diagnostika og forskningsmateriell ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi har tre hovedfordeler fremfor fremstilling basert på formering av viruset. For det første er fremstillingen risikofri. For det andre kan høye utbytter oppnås (Putney et al., op. eit.) ved anvendelse av ekspresjons-systemer med høy effektivitet. For det tredje er fremstillingen allsidig ved at antigene områder som normalt ligger skjult, kan komme til syne. Et vaksine-antigen kan merkes med et annet antigen for å adskille vaksinasjon fra infeksjon, eller det kan fremstilles sammensatte antigener.

En betydelig mangel hos de fleste antigener fremstilt ved rekombinant DNA-teknikker for vaksiner, er at antigenene vanligvis er dannet som enkle, monomere proteiner. Dette er ikke den ideelle konfigurasjon for et immuniser-ende antigen fordi det ikke lett tillater kryss-bindingen av bestanddelene i immunsystemet som er påkrevet for maksimal stimulering av humoral og cellulær immunitet.

Et ideelt immunogen er en polymer av multiple, antigene determinanter som er satt sammen til en bærer med høy mole-kylvekt. Et godt immunogen bør også foreligge med det maksimale antall epitoper avdekket. Dette oppnås best ved å fremvise multiple kopier av antigenet på overflaten av en partikkel. Av denne årsak vil det være ønskelig å ut-vikle polyvalente, partikulære bærersystemer for immuniser-ende antigener.

Fremleggelse av oppfinnelsen

En fullstendig ny, flerverdig antigen bærerpartikkel basert på evnen til pl-proteinet, som kodes for av TYA-genet i gjær-retrotransposon Ty, til å danne 60 nm partikler kjent som Ty-VLP (viruslignende partikler), er emnet for britisk patentsøknad 8626148. pl-sammensmeltningsproteiner kan fremstilles ved sammensmeltning av egnede TYA-hybride gener som innbefatter noe av kodingsområdet til TYA og kodingsområdet til et hvilket som helst antigen. Disse sammensmeltningsproteiner danner hybride Ty-VLP og fremviser det tilføyde antigen i en høymolekylær, flerverdig, partikulær form som er ideell for stimuleringen av immunsvaret hos pattedyr. I foreliggende oppfinnelse anvendes denne teknologi på fremstillingen av partikulære HIV-antigener.

Ifølge et første aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein som er i stand til spontant å danne en partikkel, hvor fusjonsproteinet omfatter en første aminosyresekvens og en biologisk aktiv andre aminosyresekvens, hvori den første aminosyresekvens er et partikkel-dannende protein kodet av et retrotransposon eller et RNA-retrovirus, hvori den andre aminosyresekvens er et HIV-antigen, og hvori den andre aminosyresekvens ikke danner en aminosyresekvens naturlig direkte fusjonert til den første aminosyresekvens av angitte retrotransposon eller RNA-retrovirus. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at (a) det fremstilles en ekspresjonsvektor inneholdende nukleinsyre omfattende en første nukleotidsekvens og en andre nukleotidsekvens, hvori den første nukleotidsekvens er komplementær til genetisk materiale i et retrotransposon eller RNA-retrovirus som koder et partikkeldannende protein, og hvori den andre nukleotidsekvens koder, eller er komplementær til, en nukleotidsekvens som koder den andre aminosyresekvens, hvori vektoren er valgt slik at nukleinsyren er i stand til å bli uttrykt i en enkelt leseramme, og hvori nukleinsyren eventuelt omfatter en nukleotidsekvens som koder for et spesifikt proteolytisk spaltingssete i sammenknytningspunktet mellom den første

og den andre nukleotidsekvens;

(b) en vert transfekteres eller transformeres med ekspre-sj onsvektoren; (c) fusjonsproteinet uttrykkes i verten; og (d) det uttrykte fusjonsprotein får danne partikler spon tant; hvor fremgangsmåten eventuelt videre omfatter ett av eller begge av de følgende trinn: (e) partiklene renses ved sukrosedensitetsgradientsentrifugering; og/eller (f) dersom det proteolytiske spaltingssete er til stede, den partikkeldannende sekvens spaltes fra fusjonsproteinet under anvendelse av et enzym som er spesifikt for det proteolytiske spaltingssete, og det spaltede, biologisk aktive protein renses ved sukrosedensitetsgradientsentrifugering.

Disse partikler kan refereres til som partikkelformede HIV-antigener.

Slike partikler er vanligvis vesentlig rene, med hvilket er ment minst 5%, 10%, 20%, 50%, 80%, 90%, 95%

eller 99 vekt% rene, i økende preferanseorden.

En gitt partikkel kan være sammensatt av et stort antall forskjellige sammensmeltningsproteiner; det vil si sammensmeltningsproteiner hvor den andre aminosyresekvens er forskjellig og derved fremviser forskjellige HIV-antigener. To, tre eller enda flere andre aminosyresekvenser kan være til stede i en partikkel.

Den første aminosyresekvens kan være produktet av

Ty TYA-<g>enet fra gjær, produktet av copia og copia-lignende bestanddeler fra insekter eller av gag-genet fra et RNA-retrovirus .

Retrovira innbefatter humant immunmangelvirus-I

og -II (HIV-I, HIV-II), humant T-celle lymfotropisk

virus-I og -II (HTLV-I, HTLV-II), murint leukemivirus, Moloney murint leukemivirus, bryst-tumorvirus fra mus, aviær leukosevirus, SIV, felint leukemivirus, humant B-celle lymfotropisk virus og bovint leukemivirus. Retrotransposoner innbefatter, som angitt ovenfor, Ty-bestanddelen fra gjær, copia og copia-lignende bestanddeler fra insekter som Drosophilia melanogaster, VL30 fra mus og IAP-gener fra mus.

Foretrukne retrotransposoner innbefatter gjær-retrotransposonet Ty. Det er tidligere vist at Ty styrer syntesen av 60nm viruslignende partikler (Ty-VLP) (Mellor et al., 1985a, Nature 318, 513). Det er nå påvist at pl-proteinet som kodes for av TYA-genet, ikke synes å kreve videre behandling for å danne Ty-VLP. Derfor er aminosyresekvensen kodet for av Ty, fortrinnsvis pl-proteinet kodet for av TYA-genet. Det er kjent (Fulton et al., NAR 13(11), 1985, 4097) at begge sorter (I og II) av Ty danner pl; slik at begge sorter kan anvendes.

Aminosyresekvensen kodet for av Ty, behøver ikke utgjøre hele pl-proteinet; den kan i stedet være en del av pl-proteinet som er kodet.for av en del av TYA-genet, og hvor denne del kan styre syntesen av Ty viruslignende partikler (Ty-VLP). Aminosyresekvensen som er kodet for av Ty, kan fortrinnsvis avledes fra sort I Ty-bestanddelen kjent som Ty1-15. Stoppkodonet ved enden av TYA-<g>enet innbefattes fortrinnsvis ikke; dersom det imidlertid innbefattes, kan ekspresjon av sammensmeltningsprotein fort-sette, ennskjønt ved lavt utbytte, ved at det viser seg at stoppkodonet kan ignoreres med en frekvens på 1 i løpet av 20 ganger ved hjelp av den rammeskiftende mekanisme beskrevet av Wilson et al. (NAR 14(17), 1986, 7001).

Den foreliggende oppfinnelse baseres således i det minste delvis på påvisningen at Ty-protein pl, som er produktet av TYA-genet (Dobson et al., 1984, EMBO. J, 3, 1115), er tilstrekkelig for å fremstille Ty-VLP, og at pl kan anvendes i dannelsen av partikler som er sammensatt av sammensmeltningsproteiner.

Den andre aminosyresekvens kan være i det vesentlige homolog med (dette uttrykk innbefatter klart "identisk med") ethvert HIV-antigen. HIV-antigenet kan være et HIV-I-

eller HIV-II-antigen. Det kan være glycosylert eller modifisert på annen måte, enten ved en naturlig post-transkrip-sjonal modifikasjonsmekanisme eller på annen måte (f.eks.

ved kjemisk syntese). Spesielt kan den andre aminosyresekvens være et HIV-overflateglycoprotein. Slike glycoproteiner (eller i det minste noen av dem) er formodet å

være kodet for av env-genet. Eksempler på disse glycoproteiner innbefatter gpl20 og gp41.

Ved foreliggende oppfinnelse innbefattes således som det andre protein, HIV-antigener med vesentlig samme antigene egenskaper som HIV-antigen p24, p41 eller pl20.

En første del av den andre aminosyresekvens kan være en linker-sekvens som i noen tilfeller kan være lett salgbar. Resten av den andre aminosyresekvens kan således, avspaltes i et rensningstrinn.

Slike partikkelformede antigener kan derfor være anvendelige ved fremstillingen av vaksiner. Vaksinen kan innbe-fatte et partikkelformet antigen og en fysiologisk akseptabel ikke-toksisk bærer, som sterilt, fysiologisk saltvann eller sterilt PBS. Sterilitet er vanligvis vesentlig for parenter-alt administrerbare vaksiner. Ett eller flere egnede hjelpe-stoffer kan også være til stede. Eksempler på egnede hjelpe-stoffer innbefatter muramyldipeptid, aluminiumhydroxyd og saponin.

Det bør bemerkes at slike vaksiner kan fremvise mer enn ett antigen. Det kan enten anvendes en blanding av forskjellige partikkelformede antigener, eller det kan anvendes en homogen populasjon av partikkelf ormede antigener med mer enn én epitop (fremstilt f.eks. ved å tillate en blanding av forskjellige hybride proteiner å samle seg til partikler, eller ved å uttrykke mer enn ett partikkel formet antigen i den samme celle); subsidiært kan en vaksine inneholde en blanding av disse typer partikkelformede antigener.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen nukleinsyre omfattende en første nukleotidsekvens og en andre nukleotidsekvens, hvor sekvensene til sammen koder for et fusjonsprotein som er i stand til spontant å danne en partikkel, kjennetegnet ved at den første nukleotidsekvens er komplementær til genetisk materiale i et retrotransposon eller RNA-retrovirus som koder et partikkeldannende protein, hvori den andre nukleotidsekvens koder, eller er komplementær til, en nukleotidsekvens som koder et HIV-antigen, hvor nukleinsyren er i stand til å bli uttrykt i en enkelt leseramme for å danne et fusjonsprotein som ikke naturlig produseres av angitte retrotransposon eller RNA-retrovirus, og hvori den andre nukleotidsekvens ikke danner en nukleotidsekvens uttrykt som en del av et fusjonsprotein naturlig fremstilt av retrotransposonet eller RNA-retroviruset, hvori den første og den andre nukleotidsekvens eventuelt er bundet av en tredje nukleotidsekvens som koder for et proteolytisk spaltingssete i fusjonsproteinet .

Det vil vanligvis være tilfelle at nucleinsyren kan uttrykkes uten tilfeller med spleising eller antiterminer-ing. Det vil vanligvis ikke foreligge noe rammeskift.

I visse utforminger av oppfinnelsen tilveiebringer

vi et TYA-genderivat som kan sammensmeltes med en HIV-antigen-kodende sekvens for å fremstille et TYA-sammen-smeltningsgen. TYA-sammensmeltningsgenet danner et sammensmeltningsprotein som setter seg sammen til hybride Ty-VLP. Disse hybride Ty-VLP utgjør et høyt molekylvekt-partikkelformet antigen-utformingssystem som kan fremstilles med veldig høye utbytter, og som kan renses ved hjelp av enkle fysiske fremgangsmåter.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes videre en ekspresjonsvektor innbefattende nucleinsyre som beskrevet ovenfor. Et eksempel er pMA5620 som innbefatter TYA-genderivat, og som styrer dannelsen på høyt nivå av hybride Ty-VLP i gjær.

Ekspresjonsvektorer ifølge den foreliggende oppfinnelse inneholder vanligvis en promotor. PGK er en foretrukket promotor, men enhver annen promotor kan anvendes hvis nødvendig eller ønskelig. Eksempler innbefatter GAPD, GALl-10, PH05, ADHl, CYC1, Ty-deltasekvens, PYK og hybride promotorer dannet av bestanddeler fra mer enn én promotor (som de angitte).

Oppfinnelsen innbefatter også vertsceller, kjennetegnet ved at de er valgt fra klassen bestående av bakterielle, gjær-, pattedyr- og insektceller innbefattende en ekspresjonsvektor ifølge krav 10, og er i stand til å uttrykke det angitte gen.

På grunn av de partikkelformede antigeners flerverdige natur er det sannsynlig at det vil være lettere å fremstille antistoffer med disse partikkelformede antigener enn med kon-vensjonelle antigener, og at disse antistoffer vil ha spesi-fikke karakteristika. Det kan således tilveiebringes antistoffer mot fusjonsproteiner fremstilt ifølge oppfinnelsen. An-tistoffene kan være polyklonale (erholdt f.eks. ved injeksjon av antigener i en kanin) eller monoklonale antistoffer, dannet av hybridomceller. På grunn av de partikkelformede antigeners flerverdige natur er det sannsynlig at in vitro-immunisering kan oppnås lettere enn med andre former for antigen; dette kan lette fremstillingen av humane, monoklonale antistoffer. Hybridomceller kan fremstilles ved sammensmeltning av milt-celler fra et immunisert dyr med en tumorcelle. Egnede, ut-sondrende hybridomceller kan deretter utvelges. (Se Koehler & Milstein, Nature, 1976, 296. 495).

Fusjonsproteiner fremstilt ifølge oppfinnelsen, er anvendelige som diagnostiske reagenser. Partikkelformede antigener med diagnostiske formål er spesielt fordelaktige fordi de kan adskilles fysisk ved sentrifugering eller filtrering, og de kan direkte dispergeres på faste støttematerialer som slides av glass eller plast, dyppepinner, makro- eller mikro-perler, prøverør og brønner i mikrotiterplater. De partikkelformede antigener kan også dispergeres i fibrøse eller oppsug-ende materialer som absorberende skiver (se U.S. patent 4.632.901), strimler eller kromatografikolonner som det faste støttemateriale. Partiklene og sammensmeltningsproteinene fester seg lett til faste støttematerialer. Etter rensing kan partiklene oppsplittes i sammensmeltningsproteiner, og sammensmeltningsproteinene kan dispergeres på overflater som angitt ovenfor. Disse reagenser er anvendelige for mange forskjellige diagnostiske tester. F.eks., en testprøve som formodes å inneholde antistoff mot det partikkelformede antigen, og et fluorescerende stoff, et enzym eller et radio-merket antistoff, reageres kompetitivt med det partikkelformede antigen eller sammensmeltningsprotein på et fast støttemateriale, og mengden av merket antistoff som binder seg til det partikkelformede antigen på det faste støttemateriale, bestemmes. Slike partikkelformede antigener er også anvendelige for agglutineringsreaksjoner med antistoffer. Dyktige diagnoseteknikere vil erkjenne mange forskjellige former for anvendelse av slike partikkelformede antigener og av fusjonsproteiner fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse for diagnostiske formål.

Oppfinnelsen illustreres nå ved hjelp av de følg-ende eksempler, med referanse til de ledsagende illustra-sjoner, i hvilke bokstaven T etterfulgt av et nummer refererer seg til MD40-4c transformert med et plasmid med dette nummer: Figur 1 viser et fotografi av Ty virus-lignende partikler (Ty-VLP) renset fra MD40-4c transformert med plasmid pMA91-ll. Figur 2 viser et skjematisk diagram av fremstillingen av pMA5620.

Figur 3 viser et diagram av plasmid pMA5620 med

et utvidet diagram av nøkkelbestanddelene ifølge dette eksempel av oppfinnelsen og nucleotidsekvensen rundt det entydige BamHI-sete.

Figur 4 viser nucleotidsekvenser rundt BamHI-setene til plasmider pMA5620, pMA5621 og pMA5622. Figur 5 viser den tilnærmede beliggenhet av fragmenter hiv3 til hiv 10 på kartet over env-området for HIV. Figur 6 viser nucleotidsekvensen av 5'-endene av fragmenter hiv3 og hiv 10. Figur 7 viser en Western-blot av sucrosegradient-fraksjoner fra ekstraktet av MD40-4c og MD40-4c transformert med pMA5620-hiv5 og pMA5620-8. De plettede proteiner under-søkes med anti-Ty-VLP-antistoff. Figur 8 viser et elektronmikrografi av hybrid Ty:HIV-VLP fremstilt fra pMA5620-hiv5. Figur 9 viser et diagram av den tilnærmede beliggenhet av fragment hiv2 2 på kartet over gag-området til HIV og nucleotidsekvensen og aminosyresekvensen ved TYA-hiv22-koblingen i plasmidet pMA5620-hiv22. Figur 10 viser nucleinsyresekvensen og den utledede aminosyresekvens av pl:p24-sammensmeltningsproteinet kodet for av plasmidet pMA5620-hiv22. Figur 11 viser sekvensen av to syntetiske HIV-oligo-merer. Figur 12 viser nucleinsyresekvensen og den utledede aminosyresekvens av pl:hiv31-sammensmeltningsproteinet kodet for av det plasmide pMA5620-hiv31. Figur 13 viser nucleinsyresekvensen og den utledede aminosyresekvens av pl:hiv32-sammensmeltningsproteinet kodet for av plasmidet pMA5620-hiv32.

Aminosyresymbolene anvendt i illustrasjonene, er som følger:

Eksempel 1

Anvendte stammer var E. coli AKEC28 (C600, thrC, thyA, trpC1117, hsdRK, hsdK) og S. cerevisiae MD40-4c

(urd2, trpl, leu2-3, leu2-112, his_3-ll, his3-15). E. coli-media ble fremstilt ifølge Miller (Miller 1972 Experiments in Molecular Genetics, CSH p433), og gjærmedia ble fremstilt ifølge Hawthorne og Mortimer

(Hawthorne og Mortimer, 1960, Genetics 4_5, 1085) .

E. coli ble transformert ved anvendelse av standard fremgangsmåter (Maniatis et al., 1982, Molecular cloning - A Laboratory Manual, CSH pl99). Gjær ble transformert som beskrevet av Hinnen et al. (Hinnen et al., 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. 75' 1929) .

Standard fremgangsmåter ble anvendt for restrik-sjonsfordøyelse og fremstillinger av plasmid (Maniatis et al., 1982, op. eit.). Restriksjonsenzymer og T4-DNA-ligase ble anvendt ifølge leverandørens bruksanvisninger. Bal 31-exonucleasefordøyelser ble utført som beskrevet av Dobson et al. (Dobson et al., 1982, Nucl. Acids Res. 10, 5463). Utslettelses-endepunkter ble bestemt ved DNA-sekvensanalyse (Sanger et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. 7_ 4, 5463). BamHI syntetiske oligonucleotid-linkere ble erholdt fra Pharmacia.

Plasmid-DNA ble isolert preparativt fra E. coli som beskrevet av Chinault og Carbon (Chinault og Carbon, 1979, Gene 5_, 111) og for hurtig analyse ved hjelp av fremgangsmåten ifølge Holmes og Quigley (Holmes og Quigley, 1981, Anal. Biochem. 114, 193).

Ty-VLP ble renset som følger. Gjærceller ble dyrket

o fil selektivt ved 30 C til en tetthet på 8 x 10 celler pr. ml . Cellene ble deretter innsamlet ved sentrifugering ved lav hastighet, vasket en gang i iskaldt vann og resuspendert i TEN buffer (10 mM Tris, pH 7,4; 2 mM EDTA; 140 mM NaCl) ved 1 ml pr. 1 liter celler. Cellene ble knust ved hvirvling med glassperler (40-mesh; BDH) ved 4°C inntil >70% var ned-brutt. Perlene ble bunnfelt ved hjelp av sentrifugering ved lav hastighet, supernatanten ble deretter innsamlet, og avfallet ble fjernet ved sentrifugering i en mikrosentrifuge i 20 minutter. Ty-VLP ble deretter bunnfelt fra supernatanten ved sentrifugering ved 100.000 gil time ved 4°C og ved resuspendering over natten i TEN-buffer. De resuspenderte Ty-VLP ble sentrifugert i en mikrosentrifuge i 15 minutter ved 4°C for å fjerne celleavfall før supernatanten ble lagt på toppen av en 15-45% (vekt/volum) sucrosegradient i 10 mM Tris, pH 7,4; 10 nM NaCl og sentrifugering ved 7 6.300 g i 3 timer ved 15°C. Fraksjoner ble innsamlet gjennom bunnen av røret, og toppfraksjonene ble identifisert ved eluering av aliquoter av fraksjonene gjennom SDS-PAGE-geler og farging med Coomassie-blått. VLP ble konsentrert ved sentrifugering av toppfraksjonene ved 100.000 gil time ved 4°C.

Proteinekstrakter av hele gjærceller ble fremstilt som tidligere beskrevet (Mellor et al., 1983, Gene 24./ D • Gel-fremgangsmåter var de ifølge Laemmli (Laemmli, 1970, Nature 227, 68). Proteinkonsentrasjoner ble målt ved hjelp av en fargestoff-bindende mengdebestemmelse (Bradford, 1976, Anal. Biochem. 7_2' 248) erholdt fra Bio-Rad Laboratories.

Plasmid pMA91-ll er tidligere beskrevet (Dobson et al., 1984, EMBO. J. 3, 1115): det inneholder de første 1450 nucleotider av den viktigste transkripsjonsenhet av Ty-bestanddelen, Tyl-15, innføyd i høyeffektivitet-ekspresjons-vektoren pMA91 (Mellor et al., 1983, op. eit; Kingsman og Kingsman, 1985, Biotech. and Genet. Eng. Rev. 3^, 377). Ty-bestanddelen ble avledet fra pKT40b som beskrevet av Dolson et al. (op. eit); pKT40b er deponert hos the National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, U.K. under registreringsnummer NCIB 12427. I sin tur består eks-presjonsvektoren pMA91 av plasmide pBR22-sekvenser som tillater replikasjon og seleksjon i E. coli, det 2-mikron plasmide replikasjonsutgangspunkt fra gjær som tillater effektiv autonom replikasjon i gjær, gjær LEU2-genet som en utvelgbar markør i både gjær- leu2- og E. coli leuB-mutanter, og et Bg_/II-ekspres jonssete som adskiller det ikke kodende område mot replikasjonsretningen av gjær-PGK-genet fra -1500 til -1 fra 3'-området av PGK som inneholder alle signalene for gjær-transkripsjons-terminering.

Plasmid pMA91 er også beskrevet i USA-4615974, selv om man nøye bør merke seg at plasmidet betegnet som pMA3013 i figur 15 ifølge dette US patent, er det som nå er kjent som plasmid pMA91. Plasmidet vist i den nedre del av figur 1 ifølge USA-4 615974, har senere fått nytt navn.

Ty-ekspresjon fremdrives derfor fra promotoren hos det ytterst effektive gjær-fosfoglycerat-kinase-gen (PGK), og gjærekstrakter av stammer inneholdende pMA91-ll over-produserer omfattende mengder pl-protein som er det primære translasjonsprodukt av TYA-genet (Dobson et al., 1984,

op. eit; Mellor et al., 1985a, op. eit). Vi påviser nå at ekstrakter av gjær-transformanter inneholdende pMA91-ll, inneholder Ty-VLP i store mengder (figur 1). Derfor inneholder TYA alene tilstrekkelig informasjon for å danne Ty-VLP, og pl-proteinet funnet i ekstrakter av MD40-4c inneholdende pMA91-ll, samles til partikler (figur 1).

Fremstillingen av en plasmid vektor, pMA5620, som kan styre syntesen av enhver hybrid Ty-VLP-partikkel, er vist skjematisk i figur 2. Dette gjorde det påkrevet å fremstille en vektor som inneholdt et egnet restriksjons-endonuclease-sete innen TYA-genet, slik at enhver kodingssekvens kan innføyes i dette sete for å skape et TYA-hybrid gen. Det er imidlertid vesentlig at det innen et slikt hybrid er tilstrekkelig TYA-kodingssekvens for å styre syntesen av Ty-VLP.

Plasmid pMA91-ll ble spaltet med Bglll, fordøyd med Bal 31 exonuclease flere ganger, og re-ligert under tilstedeværelse av overskudd av Barn HI-linkere (CCGGATCCGG). Utslettelses-endepunktene av de dannede plasmider ble bestemt ved DNA-sekvensanalyse. Plasmid pMA91-357 er et utslettelsesderivat hvori 265bp er fjernet. Dette plasserer BamHI-linkeren ett nucleotid på den andre siden av kodon 381 i TYA (figur 3).

For å tilveiebringe både transkripsjons-terminerings-sekvenser og translasjons-stoppkodoner i alle tre avlesningsrammer ble de utslettede PGK 3'-terminatorsekvenser til pMA91-357 erstattet med et 287 bp BamHI-Sall DNA-fragment isolert fra plasmid pDT86. Dette DNA-fragment er et modifisert 3'-transkripsjons-terminatorfragment fra gjær- PGK-genet som inneholder translasjons-stoppkodoner i alle tre avlesningsrammer i transkripsjonsretningen fra BamHI-setet (figur 2). Dette terminatorfragment begynner med en BamHI-linker (CCGGATCCGG) bundet til det siste kodon med betydning i PGK-kodingssekvensen, og strekker seg til Hindlll-setet 279 nucleotider på den andre siden av PGK-kodingssekvensen (Hitzeman et al., 1982, Nucl. Acids Res. 10, 7791). I disse fremstillinger er Hindlll-setet omdannet til et Sall-sete ved anvendelse av syntetisk linker. Terminator-fragmentet er ikke kritisk, og ethvert fragment som inneholder termineringskodoner i alle tre avlesningsrammer, etterfulgt av en gjær-transkripsjonsterminator, er tilstrekkelig. Det dannede plasmid, pMA5620, inneholder et entydig BamHI-sete hvori enhver egnet sekvens kan innføyes for å fresmtille et hybrid protein som vil sammensettes til hybride Ty-VLP.

Plasmid pMA5620 er vist i figurene 2 og 3. Dette plasmid kan akseptere kodingssekvensen til ethvert antigen ved dets entydige BamHI-sete, og deretter styre syntesen i gjær av det resulterende sammensmeltningsprotein. Antigen-kodingssekvensen må tydeligvis være innføyd på en slik måte at den foreligger i den samme translasjons-avlesningsfase som TYA. For å forenkle dette for ethvert restriksjons-fragment som inneholder en antigen-kodingssekvens, ble det fremstilt to derivater, pMA5621 og pMA5622, av pMA5620 hvori spaltningsstedene for deres entydige BamHI-seter er plassert ved posisjoner som korresponderer med TYA-translasjons-avlesningsfaser +1 og +2. pMA5621 og pMA5622 ble fremstilt ved spaltning av pMA5620 med BamHI, utfylling av 5<1->utvidelsene med DNA-polymerase I, og deretter ligering under tilstedeværelse av oligonucleotid AAGGATCC, for pMA5621, og oligonucleotid GGATCC for pMA5622. Sekvensen av sammensetningene ble bestemt ved dideoxynucleotid-sekvensanalyse. Figur 4 viser en sammenligning av sekvensene til pMA5620, pMA5 621 og pMA5622 omkring deres entydige BamHI-seter med hensyn til avlesningsfasen for TYA.

For å fremstille hybride Ty:HIV-VLP var det nød-vendig å innføye fragmenter av HIV-provirus-genomet i pMA5620, pMA5621 og pMA5622. HIV-DNA ble erholdt fra provirus-formen av virusisolat HIV Ib (HTLV Illb) som innbe-rettet av Råtner et al. (1985, Nature, 313, 277). Plasmid pHIVX er plasmid pSP46 (Promega Biotec) som inneholder et 8931 bp Sstl-fragment som begynner ved det andre Sstl-sete av proviruset og ender ved det tredje sete. Dette fragment inneholder derfor alle virus-kodingsområdene og var kilden til HIV-fragmentene.

Åtte HIV-fragmenter fra env-kodingsområdet til viruset ble utvalgt for anvendelse i et innledende studium. Disse ble betegnet fragmenter hiv3, hiv4, hiv5, hiv6, hiv7, hiv8, hiv9 og hivlO. Fragment hiv3 er et Kpnl:PvuII-fragment som tilnærmet svarer til kodoner 41 til 287; hiv4 er et Dral:HindIII-fragment som tilnærmet svarer til kodoner 341 til 639; hiv5 er et Dral:Dral-fragment som tilnærmet svarer til kodoner 129 til 341; hiv6 er et Sau3a:Sau3a-fragment som tilnærmet svarer til kodoner 25 til 112;

hiv7 er et Sau3a:Sau3a-fragment som tilnærmet svarer til kodoner 112 til 272; hiv8 er et Sau3a:Sau3a-fragment som tilnærmet tilsvarer kodoner 272 til 466; hiv9 er et Sau3a:Sau3a-fragment som tilnærmet svarer til kodoner 466 til 588; hivlO er et Sau3a:Sau3a-fragment som tilnærmet svarer til kodoner 588 til 743.

Figur 5 viser de tilnærmede beliggenheter av disse fragmenter på et kart over HIV-env-området. Hvert av disse fragmenter ble renset fra agarosegeler og innføyd i enten pMA5620, pMA5621 eller pMA5622 ved hjelp av forskjellige fremgangsmåter: hiv8 ble innføyd via en klebrig-ende-ligering i pMA5620 for å fremstille pMA5620-hiv8; hiv6 og hiv9 ble innføyd i pMA5621 via klebrig-ende-ligeringer for å fremstille hhv. pMA5 621-hiv6 og pMA5 6 21-hiv9; hiv7 og hivlO ble innføyd i pMA5622 via klebrig-ende-ligeringer; hiv4 og hiv5 klebrige-ender ble utfylt ved hjelp av DNA-polymerase I, og deretter ble fragmentene butt-ende-ligert inn i pMA5620 som på forhånd var spaltet ved BamHI-setet og også utfylt, for å fremstille pMA5620-hiv4 og pMA5620-hiv5; hiv3-klebrige-ender ble utfylt, og fragmentet ble butt-ende-ligert inn i pMA5621 som på forhånd var spaltet ved BamHI-setet og også utfylt, for å fremstille pMA5621-hiv3. Figur 6 viser nucleotidsekvensen for 5'-endene av hiv3-10-fragmentene.

Hvert av plasmidene ble anvendt for å transformere gjærstamme MD40-4c til leucin-uavhengighet. Ekstrakter av de erholdte transformanter ble deretter analysert for tilstedeværelsen av hybride Ty:HIV-VLP. VLP ble fremstilt fra transformanter, og fraksjoner fra en 15-45% sucrosegradient ble eluert gjennom en SDS-PAGE-gel. Proteinene ble visualisert ved Western-blotting og deretter analysert med et anti-Ty-VLP-antistoff. Figur 7 viser resultatene for pMA5620-hiv5.

Sammensmeltningen av den del av TYA som er til stede i pMA5620 med hiv5, burde danne et nytt Ty:HIV-protein på omkring 70kd. Dette protein, dersom det foreligger i sin partikkelformede form, burde bevege seg sammen med partiklene i ekstrakter av MD40-4c transformert med pMA5620-hiv5, men det inneholder en interferon-alfa2-cDNA istedenfor et hiv5-fragment (britisk patentsøknad nr. 8626148). Dataene i figur 7 viser at dette er tilfelle, og dette tyder på at pMA5620-hiv5 styrer dannelsen av hybride Ty:HIV-VLP. Lignende resultater erholdes med de andre sammensetninger. Fraksjonene fra sucrosegradienten som inneholdt det 70 kd sammensmeltningsprotein, ble undersøkt ved elektronmikro-skopi og ble vist å inneholde partikler (figur 8). Vi vil derfor trekke den slutning at pMA5620-hiv5 styrer fremstillingen av hybride Ty:HIV-VLP.

For å påvise at disse VLP virkelig er bærere av HIV-epitoper, kan fraksjoner fra sucrosegradientene, som inneholder partikler, slås sammen, og prøver elueres gjennom en SDS-PAGE, elektroblottet på nitrocellulose og deretter undersøkes med anti-HIV-antiserum. Som en positiv kontroll for dette eksperiment kan oppsplittet HIV elueres ved siden av partikkelproteinene.

Eksempel 2

For å undersøke virkningsfullheten av de hybride Ty:HIV-VLP fremstilt som i eksempel 1, i frembringelse av et immunsvar til HIV-bestanddelen, dyrkes antisera i kaniner mot konsentrerte, hybride Ty:HIV-VLP som er renset fra MD40-4c og transformert med pMA5620-hiv5 og pMA5620-hiv8. Disse antisera anvendes deretter i en Western-blot mot oppsplittet HIV fra hvilken det kan påvises at de reagerer, noe som viser at de hybride Ty:HIV-VLP bevirker dannelsen av anti-HIV-antistoffer.

Det er viktig at et antigen som skal anvendes som en vaksine, bevirker dannelsen av nøytraliserende antistoffer. For å undersøke dette med henblikk på de hybride Ty:HIV-VLP, analyseres antisera i en HIV-infektivitets-nøytraliseringsbestemmelse, fra hvilken det kan påvises at antisera vil nøytralisere HIV, noe som viser at de hybride Ty:HIV-VLP er anvendelige som en vaksine.

Disse data viser: 1) sammensmeltningsproteiner sammensatt av 381 aminosyrer fra TYA-genet og forskjellige fragmenter fra HIV kan lett fremstilles: 2) disse sammensmeltningsproteiner danner polyvalente, hybride Ty:HIV-VLP;

3) disse hybride Ty:HIV-VLP reagerer med anti-HIV-antiserum; 4) de hybride Ty:HIV-VLP bevirker dannelsen av nøytraliser-ende anti-HIV-antistoffer i kaniner. Det er derfor rimelig å vente at pMA5620, pMA5621 eller pMA5622 vil styre eks-presjonen av polyvalente, hybride Ty:HIV-VLP som inneholder ethvert HIV-antigen fra gag, pol, env, sor, tat, art/trs eller 3'ort. Ethvert av disse antigener kan utgjøre en nøkkelbestanddel i en vaksine eller i et diagnostisk ana-lysesett.

Eksempel 3

Fremstillingen av hybride Ty:HIV-VLP som bærer med

seg p24- antigener

Forløperproteinet HIV- gag spaltes i tre modne proteiner, pl7, p24 og pl5 som danner viruskjernen. p24-proteinet er spesielt betydningsfullt fra et diagnostisk synspunkt, fordi HIV-positive asymptomatiske individer viser høye titreringsverdier for anti-p24-antistoff.

Videre kan p24 være betydningsfull ved fremstillingen av

en vaksine (Salk, 1987, Nature 327, 473).

For å fremstille hybride Ty:HIV-VLP som bærer p24-antigener, ble et HindIII-fragment, hiv22, fra gag-genet til HIV-provirus-genomet, innføyd i BamHI-setet til pMA5620. hiv22 begynner ved nucleotid 1082 og slutter ved 1709 (Råtner et al., 1985, Nature 313, 277), og det koder for aminosyrer 99 til 308 i gag. Dette området inneholder derfor carboxy-enden av pl7 og det meste av p24 (figur 9). hiv22 ble innføyd i pMA5620 slik at TYA- og gag-sekvensene var innen rammen (figur 9), og det dannede molekyl ble betegnet pMA5620-hiv2 2. Dette plasmid ble innført i gjærstamme MD40-4c, og ekstrakter av transformantene ble analysert på 15-45% sucrosegradienter. Coomassie-fargede SDS-PAGE-geler av gradientfraksjonene viste tilstedeværelsen av et sammensmeltningsprotein på tilnærmet 75 kd, den ventede størrelse av et pl:p24-sammensmeltningsprotein, i det område av gradienten som er karakteristisk for partikkelformede strukturer. At dette protein bærer p24-antigener, ble bekreftet ved blotting av en lignende gel og undersøkelse med et p24-monoklonalt antistoff. Dette viste en klar topp av reagerende materiale godt nede i gradienten ved en beliggenhet som er diagnostisk for partikkelformede strukturer.

Den partikkelformede natur av pl:p24-sammensmeltningen ble videre bekreftet ved undersøkelse av toppfraksjoner i elektronmikroskop. Tallrike partikler ble observert.

Figur 10 viser aminosyresekvensen og nucleotid-kodingssekvensen for pl-p24.

Disse data viser at hybride HIV:Ty-VLP som bærer p24-antigener, kan fremstilles, og at antigenet reagerer med et anti-p24 monoklonalt antistoff. Dette system kan anvendes for å fremstille p24-antigener for anvendelse som diagnostika, eller en anti-HIV-vaksine.

Eksempel 4

Syntetiske oligonucleotider for å fremstille Ty:HIV- sammensmeltningsgener

Oligonucleotidene ble syntetisert ved automatisert fosforamiditt-kjemi ved anvendelse av cyanoethyl-fosfor-amiditter (Beaucage og Caruthers, 1981, Tetrahedron Letters 24, 245). Oligomerene ble av-blokkert og fjernet fra det kontrollerte poreglass-underlag, og oligomerene ble deretter renset på denaturerende polyacrylamidgeler, de ble videre renset ved bunnfelling med ethanol og til slutt oppløst i vann forut for beregning av deres konsentrasjon. Oligomerene ble deretter behandlet med kinase for å forsyne dem med et 5'-fosfat som påkrevet for ligeringstrinnet. Komple-mentære oligomere ble deretter herdet før de ble ligert inn i den relevante plasmide vektor. Sekvensen av de syntetiske oligomere ble bekreftet ved dideoxy-sekvensanalyse. Den anvendte protokoll var i det vesentlige som beskrevet (Biggin et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei, 80m, 3963) og modifisert for å tillate en plassering i rekkefølge på plasmid-DNA som beskrevet (Guo og Wu, 1983, Nucl. Acids Res. 11, 5521).

For å fremstille hybride HIV:Ty-VLP som bærer env-antigener, ble to DNA-oligomere syntetisert. Oligomer hiv31 har en lengde på 105 bp og koder for aminosyrer 495 til 527 i env-forløperproteinet gpl60 hos HIV lb (HTLVIIIb; Råtner et al., 1985, Nature 313, 277): det spenner over spaltningssetet mellom gpl20 og gp41. Oligomer hiv32 har en lengde på 114 bp og koder for aminosyrene 53 til 88 i gpl20 hos HIVlb (HTLVIIIb; Råtner et al., 1985, Nature 313, 277). Kodonene ble utvalgt til å være de som foretrekkes av gjær (Maruyama et al., Nucl. Acids Res. Suppl., 14^, 151). Endepunktene av oligomerene ble utformet slik. at, etterfulgt av ligering inn i pMA5620 spaltet med BamHI, et BamHI-sete ville dannes på nytt ved 3'-enden av innføyelsen, og en BamHI/Bglll-kobling ville dannes ved 5<1->enden (figur 10).

De syntetiske oligomere hiv31 og hiv32 (figur 11) ble ligert inn i pMA5 620 som på forhånd var spaltet ved BamHI-setet. De dannede plasmider betegnes pMA5620-hiv31 og pMA5620-hiv32. Den fullstendige nucleotidsekvens og den utledede aminosyresekvens av HIV:Ty-sammensmeltningsproteinene kodet for av disse to plasmider, er vist i figurene 12 og 13.

Plasmider pMA5620-hiv31 og pMA5620-hiv32 ble anvendt for å transformere gjærstamme MD40-4c til leucin-uavhengighet. Ekstrakter av de dannede transformanter ble deretter analysert med henblikk på tilstedeværelse av hybride HIV:Ty-VLP. VLP ble fremstilt fra transformantene, og fraksjoner fra en 15-45% sucrosegradient ble eluert gjennom SDS-PAGE-geler. I begge tilfeller avslørte farging med Coomassie-blått tilstedeværelsen av et sammensmeltningsprotein på tilnærmet 54 kD, den ventede størrelse av begge de HIV:Ty-sammensmeltningsproteiner, i området for gradientkarakter-istikken for partikkelformede strukturer, selv om det er verdt å legge merke til at den nøyaktige posisjon er forskjellig for de to typer partikler.

Disse data viser at syntetiske oligomere kan anvendes i fremstillingen av hybride HIV:Ty-sammensmeltningsgener. Overekspresjon av disse gener fører til dannelsen av

hybride HIV:Ty-VLP. Dette system kan anvendes for å fremstille definerte env-antigener for anvendelse som diagnostika, eller en anti-HIV-vaksine.

Eksempel 5

Enzym-immunoanalyse-fremgangsmåte med anvendelse

av VLP inneholdende et HIV- antigen

96-brønners mikrotiterplater overtrekkes med VLP inneholdende et sammensmeltet HIV-antigen (VLP-HIV) ved å inkubere 50 ul av 20 ug/ml av VLP i 50 mM natriumcarbonat-buffer, pH 9,5, i hver brønn i to timer ved romtemperatur. Overskudd av VLP-HIV vaskes ut av brønnene ved hjelp av

tre 5-minutters vaskinger med fosfatbufret, fysiologisk saltvann (PBS), pH 7,4. For å redusere bakgrunnsreaksjoner mest mulig blokkeres brønnene med 100 ul 2% casein i PBS i 1 time ved romtemperatur, etterfulgt av tre 5-minutters vaskinger med PBS inneholdende 0,1% "Tween-20" (PBS-T).

En testprøve fortynnes passende i PBS-T inneholdende 0,5% casein (PBS-CT). En egnet fortynning kan være en tredobbelt fortynningsserie fra 1/10 til 1/7.290. HIV-antistoffet i testprøven har reaksjonsevne overfor HIV-bestanddelen av . ethvert hybrid VLP-HIV. 50 ul fortynnet testprøve-antistoff tilsettes de egnede brønner og inkuberes i 2 timer ved romtemperatur. Overskudd av testprøve-antistoff fjernes ved tre 5-minutters vaskinger med PBS-T. Sekundært antistoff er pepperrotperoxydase-merket anti-art IgG og fortynnes 1/1.500 i PBS-CT. 50 ul fortynnet, sekundært antistoff tilsettes hver brønn og inkuberes i to timer ved romtemperatur, etterfulgt av fem 5-minutters vaskinger med PBS-T. Substratet er 3,3<1>,5,5'-tetramethylbenzidin ved en konsentrasjon på 0,1 mg/ml i 0,1M natriumacetat, justert til pH 6,0 med 0,5M sitronsyre, pluss 0,03% hydrogenperoxyd. 50 ul substrat tilsettes hver brønn, og fargereaksjonen utvikles i 10 minutter. Reaksjonen avsluttes ved tilsetning av 25 ul 0,5M svovelsyre til hver brønn. Fargeutvikling vur-deres ved måling ved 450 nm ved anvendelse av en mikroplate-avleser. På denne måte utføres en direkte analyse av HIV-antistof f et i testprøven.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein som er i stand til spontant å danne en partikkel, hvor fusjonsproteinet omfatter en første aminosyresekvens og en biologisk aktiv andre aminosyresekvens, hvori den første aminosyresekvens er et partikkel-dannende protein kodet av et retrotransposon eller et RNA-retrovirus, hvori den andre aminosyresekvens er et HIV-antigen, og hvori den andre aminosyresekvens ikke danner en aminosyresekvens naturlig direkte fusjonert til den første aminosyresekvens av angitte retrotransposon eller RNA-retrovirus, karakterisert ved at (a) det fremstilles en ekspresjonsvektor inneholdende nukleinsyre omfattende en første nukleotidsekvens og en andre nukleotidsekvens, hvori den første nukleotidsekvens er komplementær til genetisk materiale i et retrotransposon eller RNA-retrovirus som koder et partikkeldannende protein, og hvori den andre nukleotidsekvens koder, eller er komplementær til, en nukleotidsekvens som koder den andre aminosyresekvens, hvori vektoren er valgt slik at nukleinsyren er i stand til å bli uttrykt i en enkelt leseramme, og hvori nukleinsyren eventuelt omfatter en nukleotidsekvens som koder for et spesifikt proteolytisk spaltingssete i sammenknytningspunktet mellom den første og den andre nukleotidsekvens; (b) en vert transfekteres eller transformeres med ekspre-sj onsvektoren; (c) fusjonsproteinet uttrykkes i verten; og (d) det uttrykte fusjonsprotein får danne partikler spon tant; hvor fremgangsmåten eventuelt videre omfatter ett av eller begge av de følgende trinn: (e) partiklene renses ved sukrosedensitetsgradientsentrifugering; og/eller (f) dersom det proteolytiske spaltingssete er til stede, den partikkeldannende sekvens spaltes fra fusjonsproteinet under anvendelse av et enzym som er spesifikt for det proteolytiske spaltingssete, og det spaltede, biologisk aktive protein renses ved sukrosedensitetsgradientsentrifugering.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at retrotransposonet er gjær-retrotransposonet Ty eller et copia-lignende element.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den Ty-kodete aminosyresekvens er pl-proteinet kodet av TYA-genet.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den Ty-kodete aminosyresekvens er en del av pl-proteinet kodet av en del av TYA-genet, hvilken del er i stand til å styre syntesen av Ty-virus-lignende partikler (Ty-VLP-er).

5. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den Ty-kodete aminosyresekvens er avledbar fra Tyl-15.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at partikkelen dannes fra et flertall av fusjonsproteiner.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at partikkelen dannes fra fusjonsproteiner hvori de andre aminosyresekvenser ikke alle er de samme som hverandre.

8. Nukleinsyre omfattende en første nukleotidsekvens og en andre nukleotidsekvens, hvor sekvensene til sammen koder for et fusjonsprotein som er i stand til spontant å danne en partikkel, karakterisert ved at den første nukleotidsekvens er komplementær til genetisk materiale i et retrotransposon eller RNA-retrovirus som koder et partikkeldannende protein, hvori den andre nukleotidsekvens koder, eller er komplementær til, en nukleotidsekvens som koder et HIV-antigen, hvor nukleinsyren er i stand til å bli uttrykt i en enkelt leseramme for å danne et fusjonsprotein som ikke naturlig produseres av angitte retrotransposon eller RNA-retrovirus, og hvori den andre nukleotidsekvens ikke danner en nukleotidsekvens uttrykt som en del av et fusjonsprotein naturlig fremstilt av retrotransposonet eller RNA-retroviruset, hvori den første og den andre nukleotidsekvens eventuelt er bundet av en tredje nukleotidsekvens som koder for et proteolytisk spaltingssete i fusjonsproteinet.

9. Nukleinsyre, karakterisert ved at den koder for et fusjonsprotein fremstilt ved en fremgangsmåte ifølge krav 1.

10. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter nukleinsyre ifølge krav 8 og er i stand til å uttrykke nukleinsyren.

11. Ekspresjonsvektor ifølge krav 10, karakterisert ved at den er valgt fra klassen bestående av bakterie-, gjær-, pattedyr- og insekt-ekspresj onsvektorer.

12. Ekspresjonsvektor ifølge krav 11, karakterisert ved at den inneholder et derivat av TYA-genet med et restriksjonsenzym-spaltingssete innen TYA-genet, i hvilket er innskutt den andre nukleotidsekvens .

13. Ekspresjonsvektor ifølge krav 11, karakterisert ved at den inneholder de første 381 kodoner av TYA-genet.

14. Vertscelle, karakterisert ved at den er valgt fra klassen bestående av bakterie-, gjær-, pattedyr- og insektceller innbefattende en ekspresjonsvektor ifølge krav 10, og er i stand til å uttrykke det angitte gen.