DK172990B1 - Fusionsprotein, partikler omfattende dette, vaccine omfattende sådanne partikler, nukleinsyre, som koder for fusionsprotei - Google Patents

Description

DK 172990 B1 . Den foreliggende opfindelse angår et fusionsprotein, der kan danne en partikel, hvilket fusionsprotein er ejendommelig ved, at det omfatter en første aminosyresekvens og en biologisk aktiv anden aminosyre-sekvens, hvor den første aminosyresekvens er i det væsentlige homolog 5 med et partikeldannende protein, som kodes for af et retrotransposon eller et RNA-virus, hvor den anden aminosyresekvens ikke er i det væsentlige homolog med et HIV-antigen, og hvor, når den anden aminosyresekvens indeholder mere end 30 aminosyrerester, de første 30 rester af den anden aminosyresekvens ikke danner en aminosyresekvens, 10 som naturligt er fusioneret direkte til den første aminosyresekvens ved hjælp af retrotransposonet eller RNA-retroviruset. I særlige udførelsesformer angår den partikler, som omfatter en flerhed af fusionsproteiner, hvilke partikler er ejendommelige ved, at hvert fusionsprotein omfatter en første aminosyresekvens og en anden amino-15 syresekvens, hvor de første aminosyresekvens er i det væsentlige homolog med et partikeldannende protein, som kodes for af et retrotransposon eller et SNA-retrovirus, hvor den anden aminosyresekvens ikke er i det væsentlige homolog med et HIV-antigen, og hvor den anden aminosyresekvens er biologisk aktiv og ikke naturligt fusioneret til 20 den første aminosyresekvens ved hjælp af retrotransposonet eller RNA-viruset, en vaccine, der som antigen omfatter sådanne partikler, en nukleinsyre, som er ejendommelig ved at den omfatter en første nukleo-tidsekvens og en anden nukleotidsekvens, hvor den første nukleotid-sekvens er i det væsentlige homolog med eller komplementær med ge-25 netisk materiale i et retrotransposon eller et RNA-retrovirus, som koder for et partikeldannende protein, og hvor den anden nukleotidsekvens ikke koder for eller ikke er komplementær med en nukleotidsekvens, som koder for et HIV-antigen, og hvor den anden nukleotidsekvens koder for, eller er komplementær med, en nukleotidsekvens, som 30 koder for en anden aminosyresekvens, idet nukleinsyren er i stand til at blive udtrykt i en enkelt læseramme til dannelse af et fusionsprotein, som ikke naturligt produceres af retrotransposonet eller RNA-retroviruset, og hvor, når den anden nukleotidsekvens indeholder mere end 90 baser, de første 90 baser ikke udgør en nukleotidsekvens, som 35 udtrykkes som en del af et fusionsprotein, som naturligt produceres af retrotransposonet eller RNA-retroviruset, en ekspressionsvektor, som omfatter en sådan nukleinsyre, en bakterie-, gær-, pattedyr- eller insektcelle, som omfatter en sådan ekspressionsvektor, og en fremgangsmåde til fremstilling og oprensning af fusionsproteinet. Op-40 findelsen angår endvidere et diagnostisk reagens, som omfatter en partikel eller et fusionsprotein ifølge opfindelsen.

Én af de vigtigste anvendelser af den nye rekombinant-DNA-teknologi er ved fremstilling af sikre vacciner imod infektionssygdomme og ved syntese af definerede proteiner, imod hvilke antisera kan produceres 2 DK 172990 B1 til eksperimentelle, industrielle og diagnostiske formål. Disse mål kan teoretisk nås ved syntese af hensigtsmæssige antigener i mikroorganismer såsom gæren Saccharomvces cerevisiae. Antigenet vil blive udtrykt fra en egnet ekspressionsvektor som beskrevet i EP 0073635.

5 Korrekt præsentation af antigenet for et dyrs eller menneskes immunsystem er et hovedkrav til en virkningsfuld underenhedsvaccine eller immunogen. Præsentation har været et stort problem med potentielle vacciner og immunogener, der er fremstillet med rekombinant DNA såvel som de, der er baseret på kemisk syntetiserede epitoper. Et ideelt 10 immunogen er en polymer af mange antigendeterminanter, der er samlet til en højmolekylær bærer. Et godt immunogen bør også have det størst mulige antal epitoper blotlagte. Disse krav kan være svære at opfylde ved tilfældig kemisk binding af antigener til en bærer. En ideel situation ville være den, hvor antigenet blev præsenteret i den 15 korrekte konformation på overfladen af et stort partikulært complex.

Den partikulære natur af et sådant system ville endvidere gøre antigenoprensningen ved enkle fysiske metoder nemmere.

Disse krav opfyldes sjældent ved den enkle syntese af monomere proteiner ved rekombinant-DNA-teknologi eller kemisk syntese.

20 Forud for den foreliggende opfindelse var det eneste selvsamlende partikulært antigen-præsentationssystem til fremstilling af immunogener i gær baseret på antigenfusion (fx Herpes Simplex Virus I (HSV-I) glycoprotein D eller et poliovirusantigen) til Hepatitis B-overflade-antigen-(HBsAg)-proteinet via rekombinant-DNA-teknologi (Valenzuela et 25 al., Biotechnology 3. 19B5, 323). Disse fusionsproteiner aggregerer til dannelse af 22 nm partikler. Dette system er forbundet med alvorlige ulemper: 1) udbytter er meget lave; 2) partikler dannes ikke i gærcellen, men er et biprodukt fra ekstraktionsprocessen (Hitzemann et al.. Nuel. Acids Res, il. 1983, 27450). Dette giver begrænsninger med 30 hensyn til produktionsprocessen; 3) nogle fusioner danner ikke partikler; 4) HBsAg-komponenten udøver i visse tilfælde immunodominans, dvs. der fremstilles fortrinsvis antistoffer imod HBsAg.

Kniskern et al.. Gene 46. 1986, 135, har angivet, at Hepatitis B kerneantigen (HBcAg) danner partikler i gær i meget høje niveauer, men 35 dets anvendelse som bærer for andre epitoper har ikke været beskrevet.

Da disse partikler er beskrevet at være særdeles immunogene i mus, kan de udøve immunodominans svarende til HBsAg-partiklerne.

Et tilsvarende system i bakterier er beskrevet af Haynes et al.

(Bio/Technology 4. 1986, 637). Tobakmosaikvirus-(TMV)-kappeprotein er 40 den del, der samles til en partikulær struktur. Når TWV-kappeproteinet <9 3 DK 172990 B1 udtrykkes i £. coll og derefter oprenses, er det muligt at samle proteinerne til polyvalente partikler in vitro. Fusionsproteiner, der er fremstillet af TMV-kappeprotein og et andet protein, kan fremstille hybride partiker, der er immunogene. En polioepitop på kun 8 amino-5 syrer er blevet undersøgt og har vist sig at være immunogen, selv om den var 4 gange mindre immunogen end salk-vaccinen. Dette system har de potentielle fordele, at partikelstørrelsen kan varieres eksperimentelt, og blandede partikler (dvs. bærende mere end én epitoptype) kan muligvis være nemme at fremstille. En forventet ulempe er imidlertid, 10 at kun relativt små antigener vil være i stand til at sættes til TMV-partiklen.

Mellor et al., wature 313. 1985, 243, beskriver et fusionsprotein, der omfatter produktet af en gær Ty åben læseramme ORF1 (der nu betegnes TYA-genet), en Aben læseramme ORF2 (der nu betegnes TYB-genet) og 15 nukleinsyre, der koder for interferon. I denne artikel er der imidlertid ingen omtale eller antydning af, at de fusionsproteiner, der fremstilles, eller for den sags skyld et hvilket som helst Ty-protein, er eller kan være i stand til at samles til partikler.

Det har nu overraskende vist sig, at visse proteiner, der udtrykkes af 20 retrotransposoners genetiske materiale, har evnen til selv at samles til partikler. Det har også vist sig, at det er muligt at konstruere fusionsproteiner, der er baseret på sådanne retrotransposon-afledte samlende proteiner, der kan samles til antigen- (eller et andet biologisk aktivt molekyle) præsenterende partikler. Det har yderligere 25 vist sig, at lignende fusionsproteiner kan konstrueres på basis af samlende proteiner fra RNA-retrovira.

I et første aspekt angår den foreliggende opfindelse et fusionsprotein, der er i stand til at samles til en partikel, hvilket fusionsprotein omfatter en første aminosyresekvens og en biologisk aktiv 30 anden aminosyresekvens, hvor den første aminosyresekvens i det væsentlige er homolog med et partikeldannende protein, der indkodes af et retrotransposon eller et RNA-retrovirus, og hvor de første 30 rester af den anden aminosyresekvens, hvis den anden aminosyresekvens indeholder mere end 30 aminosyrerester, ikke udgør en aminosyrese-35 kvens, der naturligt er fusioneret direkte til den første aminosyresekvens af retrotransposonet eller RNA-retroviruset.

I et andet aspekt angår den foreliggende opfindelse en partikel, der omfatter mange fusionsproteiner, hvor hvert fusionsprotein omfatter en første aminosyresekvens og en anden aminosyresekvens, hvor den første 40 aminosyresekvens i det væsentlige er homolog med et partikeldannende protein, der indkodes af et retrotransposon eller et RNA-retrovirus, 4 DK 172990 B1 og hvor den anden aminosyresekvens er biologisk aktiv og ikke naturligt fusioneret til den første aminosyresekvens af retrotransposonet eller RNA-retroviruset.

Sådanne partikler er generelt i det væsentlige rene, hvilket skal 5 forstås som mindst 95 eller 99 vægtprocent fusionsprotein, i stigende præferencerækkefølge.

En given partikel kan være sammensat af mange forskellige fusionsproteiner; det vil sige fusionsproteiner med en indbyrdes forskellig anden aminosyresekvens. To, tre eller endog flere forskellige anden 10 aminosyresekvenser kan være til stede i én partikel.

Den første aminosyresekvens kan være produktet af gær Ty TYA-genet. produktet af copla og copia-lignende elementer fra insekter eller gaggenet fra RNA-retrovira.

Retrovira omfatter humant immundefektvirus I og II (HTV-I, HIV-II), 15 SIV, human T-celle-lymfotropisk virus I og II (HTLV-I, HTLV-II), museleukæmivirus, Moloney-museleukæmlvirus, musebrysttumorvirus, fugleleukosevirus, katteleukæmivirus, human B-celle-lymfotropisk virus og bovin leukæmivirus. Som anført ovenfor omfatter retrotransposoner Ty-elementet af gær, copia-elementerne og de copia-lignende elementer 20 fra insekter såsom Drosonhilia melanogaster. VL30 i mus og IAP-gener i mus.

Foretrukne retrotransposoner omfatter gærretrotransposonet Ty. Det er tidligere blevet påvist, at Ty dirigerer syntesen af 60 nm viruslignende partikler (Ty-VLP'er) (Mellor et al., Nature 318. 1985a, 513).

25 Det har nu vist sig, at pl-proteinet, der indkodes af TYA-aenet. er stabilt og ikke ser ud til at kræve yderligere forarbejdning. Derfor er den Ty-indkodede aminosyresekvens fortrinsvis pl-proteinet indkodet af TYA-genet. Det er kendt (Fulton et al., NAR 13 (11). 1985, 4097), at begge klasser (I og II) af Ty fremstiller pi, så begge klasser kan 3 0 anvendes.

Den Ty-indkodede aminosyresekvens behøver ikke være hele pl-proteinet; den kan i stedet være en del af pl-proteinet, der indkodes af en del af TYA-aenet. hvilken del er i stand til at dirigere syntesen af Ty-viruslignende partikler (Ty-VLP'er). Det er blevet bestemt, at en del 35 af aminosyresekvensen 286-381 (fig. 16) er nødvendig til partikeldannelse. Den Ty-indkodede aminosyresekvens kan fortrinsvis afledes af Tyl-15. Stopkodonen ved enden af ΤΥΆ-oenet er fortrinsvis ikke inkluderet; hvis den imidlertid er inkluderet, kan fusionsprotein fortsat udtrykkes, omend i lavt udbytte, da det ser ud til, at stopkodonen kan 5 DK 172990 B1 ignoreres med en frekvens på ca. 1-20 gange af den rammeskiftende mekanisme, der er beskrevet af Wilson et al. (NAR 14 (17), 1986, 7001).

Det er derfor bl.a. blevet påvist, at Ty-proteinet pi, produktet fra TYA-aenet (Dobson et al., embo J. 3. 19B4, 1115) og dele deraf, som 5 indeholder i det mindste en del af aminosyresekvensen 286-381 i fig.

16, er tilstrækkelig til at producere Ty-VLP'er.

Den anden aminosyresekvens (dvs. især udførelsesformer med det ikke-Ty-proteinkodende område) kan være en hvilket som helst aminosyresekvens, der enten er kendt inden for området, eller som stadig skal 10 opklares. Den biologiske aktivitet kan være en enkelt type aktivitet (fx antigenicitet), receptorbindingsaktivitet, terapeutisk aktivitet eller målretningsaktivitet (dvs. evnen til at rette sig mod et bestemt mål), eller den kan være en kombination af to eller flere forskellige biologiske aktiviteter. Forskellige fusionsproteiner kan ligeledes 15 samles til et partikulært antigen, hvorved hele partiklen bringes til at have mere end én aktivitet.

Som et eksempel kan den anden aminosyresekvens være afledt af et lymfokingen såsom et interferongen eller et gen, der koder for et antigen fra et infektiøst agens såsom et virus, en bakterie eller en 20 anden (fx protozo) parasit. Fx kan den være et antigen fra influenzavirus, et HIV-I- eller HIV-II-virus (dvs. HTLV-III, LAV eller AIDS), et rabiesvirus, FMDV-virus, HBsAg, HBcAg, poliovirus, influenzavirus, parainfluenzavirus, respiratorisk eyncytialvirus, rhinovirus, corona-virus, adenovirus, Rotavira, Norwalkvira, Arbovira, fx Dengue, Herpes 25 simplex, Cytomegalovirus, Epstein Barr-virus, mæslingevirus, fåresygevirus, Rubella, hesteinfluenzavirus, heste-rhinopneumonitis, smitsom svine-gastroenteritisvirus, hundesyge, Parovovirus, FeLV, venezuelansk eller vestlig hesteencephalitis, plasmodium-trypanosom, schistosomer.

Chlamydia trachomatis eller en meningococcus, eller den kan være et 30 fragment af ovenstående antigener eller et peptid, der er opstået ud fra en kemisk syntetiseret kodende sekvens på en sådan måde, at det resulterende peptid har i det væsentlige samme antigenicitet som ovenstående antigener eller fragmenter _der’å£.

Nukleotidsekvensen for en lang række virale og bakterielle antigener 35 er kendt, således at antigenet kan fremstilles ved rekombinant-DNA-teknikker. Disse DNA-kodende sekvenser kan anvendes til at kode for den anden aminosyresekvens i fusionsproteinet ifølge den foreliggende opfindelse. Fx kendes nukleotidsekvensen for antigener forbundet med almindelige sygdomme såsom kighoste og malaria: kighoste, Bordetella 40 pertussis, W0 87/03301, 4. juni 1987,- malaria, Plasmodium vivax og P. falciparum. Dame et al., Science 225:593. 1984; Enea et al.. Science 6 DK 172990 B1 22S-.626. 1984; Young et al.. Science 225:958. 1984. Andre almindelige sygdomme, for hvilke antigen-nukleotidsekvensen er kendt, er: hepatitis, EP 218 474 og EP 020 251,- herpes, EP 216 195 og JP 61-97630; rabies, WO 87/00179; skoldkopper; EP 210 931; og polio, WO 86/01828 og 5 JP 61-47585.

En første del af den anden atninosyresekvens kan være en linkersekvens, som i nogle tilfælde kan være let at spalte. Resten af den anden aminosyresekvens kan således fraspaltes i et oprensningstrin.

Partikler ifølge opfindelsen kan derfor anvendes til fremstilling af 10 vacciner, hvilket udgør et yderligere aspekt af opfindelsen. Den anden aminosyresekvens kan således kode for en aminosyresekvens af et antigen af ét af de ovenfor nævnte infektiøse agentier. Vaccinen omfatter et partikulært antigen og en fysiologisk acceptabel, ikke-toxisk bærer såsom sterilt fysiologisk saltopløsning eller steril PBS.

15 Sterilitet er generelt essentielt for parenteralt administrerbare vacciner. Én eller flere hensigtsmæssige adjuvanser kan også være til stede. Eksempler på hensigtsmæssige adjuvanser omfatter muramyl-dipeptid, aluminiumhydroxid og saponin.

Det skal bemærkes, at vacciner ifølge opfindelsen kan have mere end ét 20 antigen. Der kan enten anvendes en cocktail af forskellige partikulære antigener, eller der kan anvendes en homogen population af partikulære antigener med mere end én epitop {der fx er fremstillet ved at lade en blanding af forskellige hybride proteiner aggregere til partikler eller ved at udtrykke mere end ét partikulært antigen i samme celle); 25 alternativt kan en vaccine indeholde en blanding af disse typer partikulære antigener.

I et yderligere aspekt angår opfindelsen nukleinsyre, der omfatter en første nukleotidsekvens og en anden nukleotidsekvens, hvor den første nukleotidsekvens er i det væsentlige homolog med eller komplementær 30 med genetisk materiale i et retrotransposon eller RNA-retrovirus, som koder for et partikeldannende protein, og hvor den anden nukleotidsekvens koder for eller er komplementær med en nukleotidsekvens, der koder for en anden, biologisk aktiv aminosyresekvens, idet nukleinsyren er i stand til at blive udtrykt i en enkelt læseramme til 35 dannelse af et fusionsprotein, som ikke naturligt produceres af retrotransposonet eller RNA-retroviruset, og hvilket fusionsprotein samler sig til en partikel.

Det er generelt tilfældet, at nukleinsyren er i stand til at blive udtrykt uden splejsnings- eller antitermineringsbegivenheder. Der er 40 generelt intet rammeskift.

7 DK 172990 B1 I visse udførelsesformer for opfindelsen tilvejebringes et TYA-gen-derivat, der kan fusioneres til en hvilken som helst ikke-Ty-pro-teinkodende eekvens til dannelse af et TYA-fusionsgen. TYA-fusionsoe-net producerer et fusionsprotein, som samles til hybride Ty-VLP'er.

5 Disse hybride Ty-VLP'er udgør et højmolekylært partikulært antigen-(eller en anden partikel)-præsentationssystem, der kan produceres i meget høje udbytter, og som kan oprenses ved enkle fysiske procedurer.

Den foreliggende opfindelse angår endvidere en ekspressionsvektor, der omfatter nukleinsyre som anført ovenfor. Et eksempel er pMA5620, der 10 omfatter TYA.-trenderIvatet. og som dirigerer højniveau-produktion af hybride Ty-VLP'er i gær.

Ekspressionsvektorer ifølge opfindelsen indeholder sædvanligvis en promotor. PGK er en foretrukken promotor, men en hvilken som helst anden promotor kan anvendes, hvis det er nødvendigt eller ønskeligt.

15 Eksempler omfatter GAPD, GAL1-10, PH05, ADH1, CYC1, Ty delta-sekvens, PYK og hybride promotorer fremstillet ud fra bestanddele fra mere end én af disse promotorer eller en hvilken som helst anden promotor.

Opfindelsen angår også værtsceller, fx bakterieceller såsom E. coli. gærceller såsom Saccharomvces cerevislae eller dyreceller såsom 20 kinesisk hamsterovarieceller (CHO) eller COS-celler, der indeholder ovenstående ekspressionsvektorer, der dirigerer produktionen af hybride partikler.

På grund af de partikulære antigeners polyvalente natur er det sandsynligt, at det er nemmere at producere antistoffer end med konven-25 tionelle antigener, og at disse antistoffer har specifikke karakteristika. Opfindelsen angår således desuden antistoffer fremstillet mod partikler ifølge opfindelsen, der er antigene. Antistofferne kan være polyklonale (fx vundet ved injektion af antigener i en kanin) eller monoklonale antistoffer, der produceres af hybridomceller ifølge 30 opfindelsen. På grund af de partikulære antigeners polyvalente natur er det sandsynligt, at in vitro-iminunigerinq kan opnås lettere end med andre former for antigen; dette kan lette produktionen af humane monoklonale antistoffer. Hybridomceller kan fremstilles ved at fusionere miltceller fra et immuniseret dyr med en tumorcelle. Hensigts-35 mæssigt secernerende hybridomceller kan derefter selekteres (se Koehler & Milstein, Hature 296. 1976, 495).

Opfindelsen angår også en hensigtsmæssig teknik til oprensning af biologisk aktive peptider. Dette aspekt af opfindelsen er baseret på, at det generelt er relativt let at adskille partikler fra dermed 40 forbundne urenheder, fx ved filtrering eller centrifugering. Opfin- 8 DK 172990 B1 delsen angår således også en fremgangsmåde til fremstilling af et i alt væsentligt rent biologisk aktivt peptid, ved hvilken fremgangsmåde partikler som beskrevet ovenfor adskilles fra dermed forbundne urenheder, hvorefter det biologisk aktive peptid spaltes fra fusions-5 proteinerne i partiklerne.

Fusionsproteinet og de partikulære antigener ifølge opfindelsen kan anvendes som diagnostiske reagenser. Partikulære antigener til diagnostiske formål er særlig fordelagtige, fordi de fysisk kan skilles fra ved centrifugering eller filtrering og kan dispergeres direkte på 10 faste underlag såsom glas- eller plastobjektglas, dipsticks, makro- eller mikrokugler, reagensglas, brønde i mikrotiterplader og lignende.

De partikulære antigener ifølge opfindelsen kan også dispergeres i fibrøse eller sugende materialer såsom absorbentskiver (se US 4.632.901), strimler eller chromatografisøj ler som det faste underlag.

15 Partiklerne og fusionsproteineme adhærerer let til faste underlag.

Partiklerne kan efter oprensning sprænges til fusionsproteiner, og fusionsproteinet kan dispergeres på overflader som angivet ovenfor.

Disse reagenser kan anvendes til en række diagnostiske tests. En testprøve, der mistænkes for at indeholde antistof mod det partikulære 20 antigen, og et fluorescerende stof, enzym eller radiomærket antistof omsættes fx kompetitivt med det partikulære antigen eller fusionsprotein på et fast underlag, og den mængde mærket antistof, der binder til det partikulære antigen på det faste underlag, bestemmes. Partikulære antigener ifølge opfindelsen kan også anvendes i agglutinations-25 reaktioner med antistoffer. Fagfolk inden for det diagnostiske område kender en lang række anvendelsesmuligheder for det partikulære antigen og fusionsprotein ifølge opfindelsen til diagnostiske formål.

Opfindelsen belyses ved nedenstående eksempler og tegningen, hvor fig. 1 viser et fotografi af Ty-viruslignende partikler (Ty-VLP'er) 30 oprenset fra MD40-4C transformeret med plasmidet pMA91-ll, fig. 2 skematisk viser konstruktionen af pMA5620 og pMA5620-8, fig. 3 skematisk viser plasmidet pMA5620-8 med et forstørret diagram over hovedbestanddelene i dette eksempel ifølge opfindelsen og nukleotidsekvenserne af hovedforbindelsespunkter, 35 fig. 4 viser fotografier af SDS-polyacrylamidgel-analyser af fraktioner fra en saccharosegradient-separation af partikler og proteiner fra MD40-4C indeholdende pMA91-ll, pMA 91 og pMA5620-8, fig. 5 viser et fotografi af hybride Ty:IFN-VLP'er oprenset fra MD40-40 4c indeholdende pMA5620-B, fig. 6 viser fotografier af Western blots af saccharosegradient- fraktionerne af ekstrakter af MD40-4c indeholdende pMA5620-8; 9 DK 172990 B1 a) viser resultatet under anvendelse af anti-Ty-VLP-antistof; b) viser resultatet under anvendelse af anti-interferon-antistof, fig. 7 viser et fotografi af Coomassie-farvede SDS-polyacrylamid-5 gelanalyser af proteiner i den oprensede hybrid Ty:lFN-VLP- præparation (1) og totale ekstrakter af MD40-4c transformeret med pMA5620-8 (2) og utransformeret MD40-4C (3), fig. 8 viser fotografier af Western blots under anvendelse af anti-

Ty-VLP-antistof (b), anti-hybrid Ty:IFN-VLP-antistof (d) og de 10 tilsvarende "præimmune" ("prebled") sera (a + c). Hver an vendes mod totale ekstrakter af MD40-4c indeholdende pMA91 (1) og pMA91-l (2); plasmidet pMA91-l dirigerer syntesen af IFN-a2, pMA91 er en negativ kontrol, der ikke producerer interferon, 15 fig. 9 viser nukleotidsekvensen af det 262 bp lange SpeI:SpeI-fragment indeholdende HA-kodoneme 25-111, som er beskrevet i eksempel 5, fig. 10 skematisk viser plasmidet pMA5620-ha23, fig. 11 viser en SDS-PAGE-analyse af saccharosegradient-fraktioner af 20 ekstrakter fra MD40-4c transformeret med pMA5620 eller pMA5620-ha23 ,· proteinerne er farvet med Coomassie-blåt, fig. 12 viser et elektromikrografi af oprensede Ty:HA-VLP'er, fig. 13 viser Western blots af proteiner fra saccharosegradient-fraktioner af ekstrakter fra MD40-4c transformeret med pMA5620-25 ha23; blots blev probet med anti-Ty-VLP-antistof og anti- helinfluenzavirus-antistof, fig. 14 viser Western blots af oprensede Ty:HA-VLP'er, helinfluen- zavirus NT60 (H3) og helinfluenzavirus PR8 probet fra venstre til hejre med normalt "præimmunt" kaninserum, anti-Ty-VLP-30 antiserum, normalt "præimmunt" kaninserum, anti-Ty:HA-VLP- antiserum og anti-helinfluenzavirus-serum, fig. 15 viser strategien til fremstilling af pMA5620-3S8 ud fra pMA5620; pMA5620-358 indeholder de ferste 280 kodoner af TYA. fig. 16 viser DNA- og aminosyresekvensen af TYAl over 381 aminosyrer, 35 der indeholder segmentet fra 286 til 381, hvoraf mindst en del er nedvendigt til partikeldannelse; symboler for aminosyrer er:

Aminosyre Etboustavsymbol

Alanin A

40 Arginin R

Asparagin N

Asparaginsyre D

Asn og/eller Asp B

Cystein C

45 Glutamin Q

10 DK 172990 B1

Glutaminsyre E

Gin og/eller Glu Z

Glycin G

Histidin H

5 Isoleucin I

Leucin L

Lysin K

Methionin M

Phenylalanin F

10 Prolin p

Serin S

Threonin T

Tryptophan W

Tyrosin Y

15 Valin V

EKSEMPEL 1

De anvendte stammer var E. coli AKEC28 (C600, thrC, thyA, trpC1117, hsdRK, hsdK) og S. cerevisiae MD40-4c (urd2, trpi, leu2-3, leu2-112, his3-ll, his3-15). E. coli-medier blev fremstillet ifølge Miller 20 (Miller 1972, Experiments in Molecular Genetics. CSH, s. 433), og garmedier blev fremstillet ifølge Hawthorne og Mortimer (Hawthorne og Mortimer 1960, Genetics 45. 1085).

E. coli blev transformeret under anvendelse af standardmetoder (Mani-atis et al. 1982, Molecular Cloning - A Laboratory Manual. CSH, s.

25 199) . Gær blev transformeret som beskrevet af Hinnen et al. (Hinnen et al. 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. 75. 1929).

Der blev benyttet standardprocedurer til restriktionsskaring og plasmidkonstruktioner (Maniatis et al. 1982, op.cit.). Restriktionsenzymer og T4-DNA-ligase blev anvendt ifølge leverandørens instruk-30 tioner. Bal31-exonuklease-nedbrydninger blev udført som beskrevet af Dobson et al. (Dobson et al. 1982, Nuel. Acids Res. 10. 5463). Deletionsendepunkter blev bestemt ved DNA-sefcventering (Sanger et al.

1977, Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463). Syntetiske BamHI-oligonukleo-tidlinkere blev skaffet fra Pharmacia.

35 Plasmid-DNA blev præparativt isoleret fra E. coli som beskrevet af Chinault og Carbon (chinault og Carbon 1979, Gene 5. ill) og til hurtig analyse ved metoden ifølge Holmes og Quigley (Holmes og Quigley 1981, Anal. Biochem. 114. 193).

11 DK 172990 B1

Ty-VLP'er blev oprenset som følger: Gærceller blev dyrket selektivt ved 30°C til en tæthed på β x 106 celler .ml'1. Cellerne blev derefter opsamlet ved centrifugering ved lav hastighed, vasket én gang i iskoldt vand og resuspenderet i TEN-puffer (10 mM Tris, pH 7,4; 2 triM 5 EDTA; 140 mM NaCl) med 1 ml pr. 1 liter celler. Cellerne blev sprængt ved vortexbehandling med glaskugler (0,42 mm; BDH) ved 4°C, indtil >70% var sprængt. Kuglerne blev pelleteret ved centrifugering ved lav hastighed, hvorefter supernatanten blev opsamlet, og resterne blev fjernet ved centrifugering i en mikrofuge i 20 minutter. Ty-VLP'eme 10 blev derefter pelleteret fra supernatanten ved centrifugering ved 100.000 x g i i time ved 4eC og ved resuspendering natten over i TEN-puffer. De resuspenderede Ty-VLP'er blev centrifugeret i en mikrofuge i 15 minutter ved 4eC for at fjerne cellerester, inden supernatanten blev anbragt på en 15-45% (vægt/volumen) saccharosegradient i 10 mM 15 Tris, pH 7,4,- 10 nM NaCl, og centrifugering ved 76.300 x g i 3 timer ved 15“C. Fraktioner blev opsamlet gennem rørets bund, og topfrektionerne blev identificeret ved at køre alikvoter af fraktionerne på SDS-PAGE-geler og farve med Coomassie-blåt. VLP'er blev koncentreret ved centrifugering af topfraktioneme ved 100.000 x g i l time ved 4®C.

20 Proteinekstrakter af hele gærceller blev fremstillet som beskrevet tidligere (Mellor et al. 1983, Gene 24. i). Gelprocedurer var som beskrevet af Laemmli (Laemmli 1970, Nature 227. 68). Proteinkoncentrationer blev målt ved et farvestofbindingsassay (Bradford 1976,

Anal. Biochem. 72. 248) fra Bio-Rad Laboratories.

25 Et polyklonalt heste-anti-interferon-(IFN)-or-antistof blev skaffet fra Boehringer Mannheim. Anti-Ty-VLP-antisera blev fremstillet i kaniner ved standardprocedurer.

Western blotting blev udført som beskrevet af Towbin et al. (Towbin et al. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. 76. 4350). Bundet antistof blev 30 detekteret under anvendelse af enten et kanin-anti-heste andet antistof konjugeret til peberrodsperoxidase (Miles Scientific) eller et gede-anti-kanin andet antistof efterfulgt af et peroxidase-anti-peroxidase-(PAP)-complex fremstillet i en kanin (sigma). Den enzymatiske reaktion blev fremkaldt som beskrevet af De Blas og Cherwinski 35 (De Blas og Cherwinski 1983, Anal. Biochem. 133. 214).

Plasmidet pMA91-ll er beskrevet tidligere (Dobson et al. 1984, EMBO J. i, 1115); det indeholder de første 1450 nukleotider af den vigtigste transkriptionelle enhed af Ty-eleméntét, Tyl-15, indsat i højeffektivitets -ekspressions vektoren pMA91 (MelTor et al. 1983, op.cit: 40 Kingsman og Kingsman 1985, Biotech, and Genet. Eng. Rev. 3. 377). Ty-bestanddelen var afledt af pKT40b som beskrevet af Dobson et al.

12 DK 172990 B1 (op.cit.) ; pKT40b er deponeret i National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, Storbritannien, med deponeringsnummer NCIB 12427. Ekspressionsvektoren pMA9l består af plasmid pBR322-sekvenser, som tillader replikation og selektion i E. coli. gær-2fi-plasmid-replika-5 tionsoriginet, som tillader effektiv autonom replikation i gær, LEU2-gærgenet som selekterbar markør i både gær-leu2- og E. coli leuB-mutanter og et Bglll-ekspressionssted, som skiller det opstrøms ikke-kodende område fra gær-PGK-genet fra -1500 til -1 fra 3'-området i PGK, der indeholder alle signalerne for termination af gærtranskrip-10 tiori. Plasmidet pMA9l er også beskrevet i US 4.615.974, selv om det skal bemærkes, at det plasmid, der betegnes pMA3013 i fig. 15 i dette USA-patentskrift, er det samme som det, der nu kendes som pMA91.

Plasmidet vist i den nederste del af fig. 1 i US 4.615.974 har siden fået nyt navn.

15 Ty-ekspression styres derfor fra promotoren af det højeffektive gær-phosphoglyceratkinasegen (PGK), og gcrekstrakter fra stammer indeholdende pMA91-ll overproducerer store mængder pi-protein, det primære translationsprodukt fra TYA-genet (Dobson et al. 1984, op.cit. .· Mellor et al. 19B5a, op.cit.). Det er nu blevet påvist, at ekstrakter fra 20 gærtransformanter indeholdende pMA91-ll indeholder Ty-VLP'er i store mængder (fig. 1). Derfor indeholder TYA alene tilstrækkelig information til at fremstille Ty-VLP'er, og pl-proteinet, som findes i ekstrakter fra MD40-4C indeholdende pMA91-ll, samler sig til partikler (fig. 1 og 4). Denne information udgør grundlaget for den foreliggende 25 opfindelse.

Konstruktionen af en plasmidvektor, pMA5620, som dirigerer syntesen af en hvilken som helst hybrid Ty-VLP-partikel, er vist skematisk i fig.

2. Denne krævede konstruktion af en vektor indeholdende et hensigtsmæssigt restriktionsendonukleasested inden for TYA-genet. således at 30 en eventuel kodende sekvens kan indsættes i dette sted til dannelse af et TYA-hybridgen. Det er imidlertid essentielt, at der inden for en sådan hybrid er en tilstrækkelig TYA-kodende sekvens til at dirigere syntesen af Ty-VLP'er.

Plasmidet pMA91-ll blev skåret med BgllX, nedbrudt med Bal31-exonuk-35 lease på forskellige tidspunkter og religeret i nærværelse af overskydende BamHI-linkere (CCGGATCCGG). Deletionsendepunkterne af de resulterende plasmider blev bestemt ved DNA-sekventering. Plasmidet pMA91-357 er et deletionsderivat, hvor 265 bp er blevet fjernet. Dette anbringer BamHI-linkeren ét nukleotid ud over kodon 381 i TYA (fig.

40 3) .

13 DK 172990 B1

For at tilvejebringe både transkriptionsterminationssekvenser og translationsstopkodoner i alle tre læserammer blev de deleterede PGK 3'-terminatorsekvenser af pMA91-357 erstattet med et 287 bp langt BamHI-Sall DNA-fragment isoleret fra plasmidet pDT86. Dette DNA-5 fragment er et modificeret 3'-transkriptionsterminatorfragment fra gær-PGK-genet, som indeholder translationsstopkodoner i alle tre læserammer nedstrøms for BamHI-stedet (fig. 2 og 3). Dette termina-torfragment starter med en BamHI-linker (CCGGATCCGG) forbundet med den sidste sense-kodon af den PGK-kodende sekvens og strækker sig til 10 Hindlll-stedet 279 nukleotider efter den PGK-kodende sekvens (Hitzeman et al. 1982, Nuel. Acids Res. 10. 7791). i disse konstruktioner er Hindlll-stedet blevet omdannet til et Sall-sted under anvendelse af en syntetisk linker. Terminatorfragmentet er ikke kritisk, og et hvilket som helst fragment, der indeholder terminationskodoner i alle tre 15 læserammer efterfulgt af gærtranskriptionsterminator, er tilstrækkeligt. Det resulterende plasmid, pMA5620, indeholder et unikt BamHI-sted, i hvilket en hvilken som helst egnet sekvens kan indsættes til fremstilling af et hybridt protein, som samles til hybride Ty-VLP'er.

For at teste pMA5620 blev et interferon-or2 (IFN) cDNA anvendt som 20 model-antigenkodende sekvens. Et 540 bp BamHI-IFN-or2 cDNA-fragment, betegnet fragment 8 (Mellor et al. 1985b, Gene 33. 215), blev indsat i det unikke BamHI-sted på plasmidet pMA5620. Det resulterende plasmid betegnes pMA5S20-8 (fig. 2 og 3).

VLP'er blev fremstillet ud fra gærstammen MD40-4c transformeret med 25 plasmidet pMA5£20-8, og fraktioner fra en 15-45% saccharosegradient blev kørt på en SDS-PAGE-gel. Proteinerne i gradienten blev visualiseret ved farvning med Coomassie-blåt (fig. 4). Det forventede 70 kd TYA-IFN-fusionsproteins position i gradienten viste på afgørende måde proteinets partikulære natur. Elektronmikroskopi af fraktionerne 30 bekræftede, at partikler var til stede (fig. 5). For at fastslå, at dette 70 kd partikulære protein faktisk var et Ty(50kd):IFN(20kd)-fusionsprotein blev fraktioner fra saccharosegradienter igen kørt på SDS-PAGE-geler, og de fraskilte proteiner blev overført til nitrocellulosefiltre. Ét filter blev probet med et Ty-VLP-antistof, der vides 35 at reagere med Ty-proteiner, og et andet blev probet med et anti-IFN-a-antistof (fig. 6). I begge tilfælde reagerede 70 kd-proteinet kraftigt, hvilket viser, at dette protein indeholdt både Ty- og IFN-epitoper.

Effektiviteten af metoden til oprensning af hybride Ty:IFN-VLP'er er 40 vist i fig. 7. Det 70 kd hybride protein er langt det vigtigste stof i præparationen.

14 DK 172990 B1

For at teste effektiviteten hos disse hybride Ty:IFN-VLP'er til at fremkalde et immunrespons mod model-antigenet, interferon, blev et antiserum fremstillet i kaniner mod koncentrerede hybride Ty:IFN-VLP'er oprenset fra gærekstrakter transformeret med pMA5620-8. En 5 ekstrakt af MD40-4C transformeret med plasmidet pMA91-l, der overproducerer IFN-or2 (Mellow et al. 1985b, op.cit.). blev kørt på en SDS-PAGE-gel ved siden af en ekstrakt af MD40-4C transformeret med pMA91, der ikke producerer interferon. De fraskilte proteiner blev overført til nitrocellulose og probet med enten Ty-VLP-antisera eller Ty:IFN-10 VLP-antisera (fig. 8). Mens begge antisera reagerede med Ty-proteiner til stede i ekstrakterne, reagerede kun anti-hybride Ty:IFN-VLP-antisera med det 20 kd IFN-protein i den ekstrakt, der indeholdt plasmidet pMA91-l.

Disse data viser: 1) pMA5620-8 dirigerer syntesen af et hybridt 15 fusionsprotein, som består af de første 381 aminosyrer i Ty-proteinet pi og et ikke-Ty-protein. I dette tilfælde interferon-or2; 2) dette fusionsprotein danner hybride Ty:IFN-VLP'er; 3) de hybride Ty:IFN-VLP'er kan let isoleres; 4) de hybride Ty:IFN-VLP'er præsenterer model-antigenet, interferon-o2, for kanin-immunsystemet. Det er derfor 20 rimeligt at forvente, at pMA5620 dirigerer syntesen af et hvilket som helst Ty-VLP, og at et hvilket som helst antigen, der er til stede i en sådan partikel, præsenteres for et hvilket som helst pattedyrs immunsystem, fx rotter, hamstere, hunde, katte, kvæg, får, svin og mennesker. Det interferon-cDNA, der er anvendt som eksempel her, kan 25 klart erstattes med et hvilket som helst andet stykke DNA, som koder for et komplet protein eller en del af et protein.

Den partikulære natur af dette antigenpræsentationssystem og den lethed, hvormed de hybride Ty-VLP'er kan oprenses, gør den foreliggende opfindelse anvendelig som et middel til stimulering af pro-30 duktionen af antistoffer mod definerede antigener, som et middel til dannelse af nye vacciner, som et middpl til fremstilling af definerede antigener til fremstilling af monoklonale antistoffer samt som et middel til fremstilling af antigener til anvendelse i diagnostiske assaymetoder.

35 Hybride Ty:IFN-VLP'er kan derfor anvendes til at fremkalde anti-IFN-antistoffer (enten monoklonale eller polyklonale, men fortrinsvis monoklonale), som derpå kan anvendes til oprensning af IFN.

DK 172990 B1

IS

EKSEMPEL 2

Copia-elementet i Drosophilia melanogaster ligner bemærkelsesværdigt Ty-elementet i gær, både med hensyn til genetisk organisation og dannelse af viruslignende partikel (Mount & Rubin 1985, Mol. Cell.

5 Biol. 5. 1530). Det område i copia, der svarer til TYA. betegnes gag i analogi med retrovirusorganisation. Derfor kan ekspression i høje niveauer af gag-området i et copia-element i et insektcelle-ekspres-sionssystem vise sig at føre til proteiner, der samler sig til partikler i lighed med Ty-VLP’erne. Hvis gag fusioneres med den kodende 10 sekvens i et andet protein, kan det resulterende fusionsprotein også vise sig at samle sig til en hybrid copia-partikel analogt med de ovenfor beskrevne Ty:IFN-hybridpartikler.

For at etablere copia-partikler som et antigenpræsentations- og oprensningssystem manipuleres gag fra plasmidet pPW220 (Potter & 15 Brosein 1979, Cell 17, 415) ved standard-rekombinant-DNA-procedurer for indsætning i en typisk højeffektivitets-Baculovirus-ekspressions-vektor såsom pAc373 (Smith et al. 1983, J. Vlrol. 45. 584) til fremstilling af plasmidet pAc373-gag. Ekspressionen styres af polyhedrin-promotoren. Et interferon-cDNA indsættes derefter i ramme i 3'-enden 20 af gag til fremstilling af plasmidet pAc373-gag-IF7J. Dette plasmid er direkte analogt med pMA5620-8 (se eksempel 1 ovenfor). pAc373-gag-IFN indsættes derefter i Baculovirus, Autocrrapha califomica keme-poly-hedrosisvirus (AcNPV) ved in vivo-rekombination i Spodoptera fruoi-perda-celler (Smith et al. 1983, Mol. Cell. Biol. 4. 2158). Rekombi-25 nante vira høstes fra okklusion-minus-plagues og anvendes til rein-fektion af friske S. fruciperda-celler. Hybride copia:IFN-partikler høstes 72-95 timer efter infektion og fraktioneres på en saccharose-gradient for at skille dem fra Baculovirus-kontamination. Partikler identificeres ved elektronmikroskopi og Western blotting som beskrevet 30 for Ty-IFN-hybridpartikler (se eksempel 1 ovenfor).

EKSEMPEL 3

Den generelle procedure ifølge eksempel 2 følges bortset fra, at et rekombinant plasmid indeholdende gag-IFM-fusionen, der udtrykkes af Drosophila ADH-genpromotoren (Benyajati et al. 1983, Cell 33. 125), 35 indsættes i en hvilken som helst insektcelle (fx Drosophila Schneider 2-celler) ved simpel DHA-medieret transfektion.

16 DK 172990 B1 EKSEMPEL· 4 TYA-genet af gær-Ty-elementet er direKte' analogt med gag-generne fra fugle- og pattedyrretrovira. Da produktet fra TYA alene er i stand til at danne partikler, er det sandsynligt, at et hvilket som helst gag-5 protein vil gøre det samme og derfor vil kunne udgøre grundlaget for et antigenpræsentations- og oprensningssystem.

i

For at etablere retrovirale gag-proteiner som antigenoprensnings- og præsentationssystemer manipuleres gag-genet fra HIV-1 ved standard-rekombinant-DNA-procedurer og indsættes i gærekspressionsvektoren 10 pMA9l og et derivat af pattedyr-ekspressionsvektoren pSV2 (Southern og Berg 1982, J. Mol. AppI. Genet. 1. 327), som indeholder et pattedyr-dhfr-cDNA (Kaufman et al. 1985, Mol. Cell. Biol. 5. 1750), for henholdsvis at fremstille pMA91-HIVgag og pSV25-HIVgag. Et interferon-cDNA indsættes derefter i ramme i begge disse molekyler ved 3-enden af 15 gag til fremstilling af henholdsvis pMA91-HIV-gag-IFN og pSV25-HIVgag-IFN. Disse molekyler er analoge med pMA5620-8 (se eksempel 1 ovenfor). pMA91 -HIVgag-IFN"a'hvéndés derefter til at transformere gærstammen MD40-4c, og pSV25-HIVgag-IFN anvendes til at transficere CHQ-dhfr-celler. Stabile transformanter propageres, og 20 celleekstrakter fremstilles og fraktioneres på saccharosegradienter.

Hybride HIVgag:IFN-partikler identificeres ved elektronmikroskopi og Western blotting som beskrevet for Ty:IFN-hybridpartikler (se eksempel 1 ovenfor).

EKSEMPEL 5 25 Proceduren ifølge eksempel 4 følges bortset fra, at pSV25-HIVgag-IFN indsættes i COS-celler (Gluzman et al. 1977, J. Virol. 24. 534), og hybride partikler høstes mellem 3 og 9 dage efter transfektion.

EKSEMPEL 6 I dette eksempel påvises, at hybride Ty-VLP'er, der indeholder en del 30 af et influenzavirus-hæmagglutinin (HA), kan fremstilles, og at disse hybride Ty:HA-VLP'er inducerer dannelsen af anti-HA-antistoffer i kaniner.

Strategien for disse eksperimenter var i det væsentlige den samme som for produktionen og analyserne af de hybride Ty:IFN-VLP'er beskrevet i 35 eksempel 1. MRC12/80 anti-helinfluenzavirus-antistof blev skaffet fra World Influenza Centre i NIMR, Mill Hill, Storbritannien og blev 17 DK 172990 B1 fremstillet mod influenzavirusstammen A/Scotland/840/74 x A/PR/8/34 (H3N2) . Et område af den HA-kodende sekvens svarende til kodoneme 25-lll i HAl-området i influenzaviruset A/Memphis/102/72 (H3N2) blev valgt til dannelse af hybride Ty:HA-VLP'er på basis af dataene ifølge 5 Wilson et al. (1984, Cell 37. 767). Et 262 bp langt Spel:Spel-fragment (fig. 9) svarende til kodonerne 25-111 blev oprenset fra en hensigtsmæssig skæring af plasmidet MX29. MX29 er plasmidet pATl53 (Twigg og Sherratt 1980, Nature 283. 216), der har et H3 HA cDNA afledt af HA RNA'et fra influenzavirusstammen A/Memphis/102/72, der er G:C-"tallet" 10 i Pstl-stedet. Hæfteenderne af Spel:Spel-fragmentet blev udfyldt med DNA-polymerase I, hvorefter fragmentet blev stumpende-ligeret til HinclI-stedet på plasmidet pSP46 til fremstilling af pSP46-ha23. pSP46 er et derivat af pSP64 (Promega Biotec), i hvilket Hindlll-stedet i pSP64 er blevet omdannet til et BglZI-sted. Et BamHI:BglZZ-fragment 15 med betegnelsen ha23 blev oprenset ud fra p5P46-ha23. ha23 indeholder det udfyldte 262 bp lange Spel:Spel-fragment. ha23 blev derefter indsat i BamHI-stedet på pMA5620 til fremstilling af pMA5620-ha23 (fig. 10). Dette plasmid blev derefter anvendt til at transformere gærstammen MD40-4c til leucin-uafhængighed.

20 VLP'er blev fremstillet fra gærstammen MD40-4c transformeret med pMA5620-ha23 eller pMA5620 og fraktioneret på en 15-45% saccharose-gradient. Fraktioner blev kørt på en SDS-PAGE-gel, og proteiner blev visualiseret med Coomassie-blåt (fig. 11). Positionen i gradienten af det forventede TYA-HA-fusionsprotein viste proteinets partikulære 25 natur. Elektronmikroskopi af fraktionerne bekræftede, at partikler var til stede (fig. 12).

For at bekræfte, at partiklerne indeholdt HA-antigener, blev fraktionerede ekstrakter af MD40-4c indeholdende pMA5620-ha23 fra tilsvarende gradienter igen kørt på SDS-PAGE-geler, og derefter blev fraskilte 30 proteiner elektroblottet til nitrocellulosefiltre. Ét filter blev probet med anti-Ty-VLP-antistof, som vides at reagere med Ty-proteiner, og et andet blev probet med anti-HA-antistof. z begge tilfælde reagerede det formodede Ty:HA-fusionsprotein kraftigt, hvilket viser, at dette protein indeholdt både Ty- og HA-epitoper (fig. 13) .

35 For at teste effektiviteten hos disse hybride Ty-.HA-VLP'er til at fremkalde et immunrespons mod HA blev et antiserum fremstillet i kaniner mod koncentrerede hybride Ty:HA-VLP'er oprenset fra ekstrakter af MD40-4c transformeret med pMA5620-ha23. Dette antiserum blev derefter anvendt til at probe proteiner fra sprængt helinfluenzavirus 40 ved Western blotting. 3 proteinprøver blev anvendt. Den første var oprensede Ty:HA-VLP'er anvendt til at fremstille antiserummet. Den anden var helinfluenzavirus PR8 (H3). Den tredje var helinfluenzavirus 18 DK 172990 B1

NT60 (Hl). Både PR8 og NT60 blev skaffet fra professor George Brownlee, Sir William Dunn School of Pathology, Oxford, Storbritannien. Fig. 14 viser, at anti-Ty:HA-VLP-antistoffet reagerer med HA1-området i H3 HA, men ikke med Hl HA. Ingen sådan reaktion ses med 5 præimmunt serum og ej heller med anti-Ty-VLP-antistof. Som positiv I kontrol blev de samme prøver probet med anti-helvirus-antistof. I

dette tilfælde reagerede både Hl HA og H3 HA med antiserummet. De hybride Ty:HA-VLP'er inducerer produktion af anti-HA-antistof, der er specifikt for en H3-antigenepitop.

10 Disse data viser, at pMA5620-ha23 dirigerer syntesen af et hybridt fusionsprotein, der består af de første 381 aminosyrer af Ty-proteinet pi og et lille område af et viralt protein, influenzavirus HA. Dette fusionsprotein danner hybride Ty:HA-VLP'er. De hybride Ty:HA-VLP'er kan let isoleres og præsenterer den lille HA-bestanddel for kanin-15 immunsystemet på en sådan måde, at der produceres anti-HA-antistoffer.

Disse antistoffer kan skelne mellem Hl HA og H3 HA ved et Western blot. HA-bestanddelen i de hybride Ty:HA-VLP'er kan klart erstattes med en hvilken som helst anden influenzavirusbestanddel eller en hvilket som helst anden vi rusbestanddel, og det er rimeligt at for-20 vente, at der kan opnås lignende resultater.

EKSEMPEL 7

For at danne en række afkortede ΓΥΑ-oener. som indeholdt progressivt mindre sekvens ved 3'-enden, blev der udført en standard-Bal3l-ned-brydning under anvendelse af pMA5620 som udgangsmolekyle. Plasmidet 25 pMA5620 blev skåret med BamHI, skåret med Bal31 på forskellige tids punkter og religeret i nærværelse af overskydende BairiHI-linkere (CCGGATCCGG). Deletionsendepunkterne af de resulterende plasmider blev bestemt ved DNA-sekventering. Én af disse deletioner indeholder kun de første 286 kodoner af TYA og betegnes 358. De deleterede PGK-termina-30 torsekvenser af 358 blev erstattet ved at ligere det store PvuII-

BamHI-fragment fra pMA5620 med det 680 bp lange PvuII-BamHI-fragment fra 358. Det resulterende plasmid betegnes pMA5620-358 (fig. 15).

Interferon-or2 cDNA BamHI-fragmenter med to lidt forskellige 3'-terminaler (IFN-8 og IFN-2; Mellor et al. 1985, Gene 33. 215; Mellor et al.

35 1985, Nature 313. 243) blev indsat i ramme i BamHI-stederne i pMA5620 og pMA5620-358 til dannelse af plasmiderne pMA5620-8 og pMA5620-358-2.

Plasmiderne pMA91-ll, pMA5620 og pMA5620-358 blev anvendt til at transformere gærstammen MD40-4c til leucin-uafhængighed. De resulterende transformanter blev sammenlignet med hensyn til TYA-RNA

19 DK 172990 B1 produceret af plasmideme og med hensyn til mængderne af pi- eller afkortede pi-proteiner, bestemt ved Western blotting under anvendelse af anti-Ty-VLP-antistof. Mængderne af RNA og protein var de samme i hver transformant.

5 Ekstrakter fra hver transformant blev derefter analyseret ved fraktionering på 15-45% saccharosegradienter efterfulgt af farvning med Coomassie-blåt. I både pMA91-ll og pMA5620 er der pi- eller afkortede pl-proteiner i det område af gradienten, der er karakteristisk for partikulære strukturer. Imidlertid observeres der intet partikulært 10 materiale i tilfælde af pMA5620-358.

Et interferon-a2 cDNA blev fusioneret i ramme med hvert af plasmideme ΡΜΆ5620 og pMA5620-358 til fremstilling af plasmideme pMA5620-8 og pMA5620-358-2. Disse plasmider blev anvendt til at transformere gærstammen MD40-4C til leucin-uafhængighed, og Ty homologt SNA og pl-15 og pi:interferon-fusionsproteiner blev målt som beskrevet ovenfor.

Niveauerne af RNA og protein er de samme for begge transformanter og også de samme som pMA5620. Når ekstrakter af gxrtransformanter indeholdende pMA5620-8 blev analyseret på 15-45% saccharosegradienter, sås et 70 kd pi:interferon-fusionsprotein i det område af gradienten, der 20 er karakteristisk for partikulære strukturer. Imidlertid sås intet partikulært materiale, når ekstrakter indeholdende pMA5620-358-2 blev analyseret.

Ty-VLP-dannelse kræver således i det mindste en del af sekvensen mellem amlnosyrerne 286 og 381. DNA- og aminosyresekvensen af pi er 25 vist i fig. 16, som også viser DNA- og aminosyresekvensen af amino-syrerne 286-381.

EKSEMPEL 8

Enzvmimmunoassavprocedure med VLP-antigen

Mikrotiterplader med 96 brande overtrækkes med VLP-antigen (viruslig-30 nende partikel med antigen) ved inkubation af 50 μΐ af 20 μg/ml VLP'er i 50 mM natriumcarbonatbuffer, pH 9,5, i hver brønd i 2 timer ved stuetemperatur. Overskydende VLP-antigen vaskes ud af brøndene ved 3 x 5 minutters vask med phosphatpufret saltopløsning (PBS), pH 7,4. For at minimere baggrundsreaktioner blokeres brøndene med 100 μΐ 2% casein 35 i PBS i 1 time ved stuetemperatur efterfulgt af 3 x 5 minutters vask med PBS indeholdende 0,1% Tween-20 (PBS-T). Primært antistof i en testprøve fortyndes hensigtsmæssigt i PBS-T indeholdende 0,5% casein (PBS-CT). En hensigtsmæssig fortynding kan være en tre ganges for- 20 DK 172990 B1 tyndingsserie fra 1/10 til 1/7.290 af primart antistof, der er reaktivt over for ikke-Ty-bestanddelen i et hvilket som helst hybridt Ty-VLP. 50 /«1 fortyndet primært antistof sættes til de relevante brønde og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur. Overskydende primært 5 antistof fjernes ved 3x5 minutters vask med PBS-T. Sekundært antistof er peberrodsperoxidase-mærket antistof af typen IgG og fortyndes 1/1.500 i PBS-CT. 50 μΐ fortyndet sekundært antistof sættes til hver brønd og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur, efterfulgt af 5 x 5 minutters vask med PBS-T. Substratet er 3,3', 5, 5'-tetramethylbenzidin 10 i en koncentration på 0,1 mg/ml i 0,1 M natriumacetat, indstillet til pH 6,0 med 0,5 M citronsyre plus 0,03% hydrogenperoxid. 50 μΐ substrat sættes til hver brønd, og farvereaktionen lades forløbe i 10 minutter.

Reaktionen standses ved tilsætning af 25 μΐ 0,5 M svovlsyre til hver brønd. Farveudvikling bedømmes ved måling ved 450 nm under anvendelse 15 af en mikropladelæser. På denne måde udføres et direkte assay af det primære antistof i testprøven.

EKSEMPEL 9

Spaltning af exooent protein fra hybride Tv-VLP'er I situationer, hvor hybride Ty-VLP’er anvendes til oprensning af 20 pl-fusionsproteiner, er det fordelagtigt at fjerne pi-bestanddelen af fusionsproteinet, hvilket efterlader den exogene eller ikke-pl-be-standdel. Dette kræver spaltning ved forbindelsespunktet mellem pi- og ikke-pi-sekvensen. Dette tilvejebringer et middel til anvendelse af Ty-VLP'er til fremstilling af autentiske proteiner. En måde at opnå 25 dette på er at indføre et specifikt proteolytisk spaltningssted ved pl/ikke-pi-forbindelsespunktet.

For at producere ikke-fusionsinterferon fra Ty-VLP'er blev der konstrueret et derivat af ρΜΆ5620 med betegnelsen pMA5623. Dette er identisk med pMA5620 bortset fra, at der ved kodon 381 af TYA er 30 tilføjet 4 yderligere kodoner før BamHI-linkeren. Disse kodoner koder for aminosyresekvensen Ile-Glu-Gly-Arg, som er et spaltningssted for blodkoagulationsfaktor Xa (Nagai & Thogersen 1984, Nature 309. 810). Forbindelsesområdet for en konstruktion, der er analog med pMA5620-8, pMA5623-8, er som følger:

35 CCC AAA ATC GAG CGT AGG gga tcc a tg ggC TGC AAG

PRI BGRGSMGCK 380 381 Faktor Xa IFN

TYA -BamHI

Claims (24)

1. 21 DK 172990 B1 Når pMA5623-8 transformeres til gærstammen MD40-4C, produceres et pi:IFN-fusionsprotein, som samler sig til hybride IFN:Ty-VLP'er. I modsætning til transformanter indeholdende pMA5620-8, spalter inkubation af det partikulære fusionsprotein med bovin blodfaktor Xa imid-5 lertid interferonet fra partiklerne på grund af tilstedeværelsen af spaltningsstedet ved proteinfusionsforbindelsespunktet. Hybride IFN:Ty-VLP'er oprenses derfor ud fra ikke-partikulære proteiner ved en forste runde af saccharosedensitetsgradientfraktionering som beskrevet ovenfor. IFN'et spaltes derefter fra og oprénses ud fra 10 det partikulære pi-protein ved endnu en runde saccharosedensitets-gradientfraktionering, hvilket giver rent "autentisk" interferon. Den interferon-kodende sekvens, der er beskrevet i dette eksempel, kan erstattes med en hvilken som helst anden kodende sekvens, og denne strategi kan således benyttes ved ekspression og oprensning af et 15 hvilket som helst protein.
2. 1. Fusionsprotein som er i stand til at danne en partikel, kendetegnet ved, at det omfatter en første aminosyresekvens og en biologisk aktiv anden aminosyresekvens, hvor den første aminosyresekvens er i det 20 væsentlige homolog med et partikeldannende protein, som kodes for af et retrotransposon eller et RNA-retrovirus, hvor den anden aminosyresekvens ikke er i det væsentlige homolog med et HIV-antigen, og hvor, når den anden aminosyresekvens indeholder mere end 30 aminosyrerester, de første 30 rester af den anden aminosyresekvens ikke danner en 25 aminosyresekvens, som naturligt er fusioneret direkte til den første aminosyresekvens ved hjælp af retrotransposonet eller RNA-retroviruset.
3. 2. Fusionsprotein ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er i det væsentlige er rent.
4. 3. Fusionsprotein ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at retro transposonet er gær-retrotransposonet Ty eller et copia-lignende element.
5. 4. Fusionsprotein ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den Ty-kodede aminosyresekvens er pi-proteinet, som kodes af TYA-genet.
6. 5. Fusionsprotein ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den Ty-kodede aminosyresekvens udgør en del af pi-proteinet, som kodes af en del af DK 172990 B1 22 TYA-genet, hvilken del er i stand til at styre syntesen af Ty-viruslignende partikler (Ty-VLP'er).
7. 6. Fusionsprotein ifølge krav 3, 4 eller 5, kendetegnet ved, at den I Ty-kodede aminosyresekvens er Tyl-15-sekvensen.
8. 57. Fusionsprotein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, at den anden aminosyresekvens er immunologisk reaktivt med et antistof, som produceres som respons på et infektiøst agens hos pattedyr.
9. 8. Partikel som omfatter en flerhed af fusionsproteiner, kendetegnet 10 ved, hvert fusionsprotein omfatter en første aminosyresekvens og en anden aminosyresekvens, hvor den første aminosyresekvens er i det væsentlige homolog med et partikeldannende protein, som kodes for af et retrotransposon eller et RNA-retrovirus, hvor den anden aminosyresekvens ikke er i det væsentlige homolog med et HIV-antigen, og hvor 15 den anden aminosyresekvens er biologisk aktiv og ikke naturligt fusioneret til den første aminosyresekvens ved hjælp af retrotrans-posonet eller RNA-retroviruset.
10. 9. Partikel ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den omfatter fusionsproteiner i en i det væsentlige ren form.
11. 10. Partikel, kendetegnet ved, at den omfatter en flerhed af fusio nerede proteiner ifølge krav l.
12. 11. Partikel ifølge krav 8, 9 eller 10, kendetegnet ved, at den anden aminosyresekvens i fusionsproteinerne alle er ens.
13. 12. Vaccine, kendetegnet ved, at den som antigen omfatter en partikel 25 ifølge krav 8, 9, 10 eller 11.
14. 13. Nukleinsyre, kendetegnet ved, at den omfatter en første nukleo-tidsekvens og en anden nukleotidsekvens, hvor den første nukleotid-sekvens er i det væsentlige homolog med eller komplementær med genetisk materiale i et retrotransposon eller et RNA-retrovirus, som 30 koder for et partikeldannende protein, og hvor den anden nukleotidsekvens ikke koder for eller ikke er komplementær med en nukleotidsekvens, som koder for et HIV-antigen, og hvor den anden nukleotidsekvens koder for, eller er komplementær med, en nukleotidsekvens, som koder for en anden aminosyresekvens, idet nukleinsyren er i stand til 35 at blive udtrykt i en enkelt læseramme til dannelse af et fusionsprotein, som ikke naturligt produceres af retrotransposonet eller RNA-retroviruset, og hvor, når den anden nukleotidsekvens indeholder mere IRJ 23 DK 172990 B1 end 90 baser de første 90 baser ikke udgør en nukleotidsekvens, som udtrykkes som en del af et fusionsprotein, som naturligt produceres af retrotransposonet eller ENA-retroviruset.
15. 14. Nukleinsyre, kendetegnet ved, at den koder for et fusionsprotein 5 ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7.
16. 15. Nukleinsyre ifølge krav 13, kendetegnet ved, at den anden nukleotidsekvens ikke indeholder en linkersekvens, som koder for en spaltelig aminosyresekvens.
17. 16. Nukleinsyre ifølge krav 13, kendetegnet ved, at den anden nukleo-10 tidsekvens omfatter en linkersekvens, som koder for en spaltelig aminosyresekvens, der støder op til den første nukleotidsekvens.
18. 17. Ekspressionsvektor, kendetegnet ved, at den omfatter en nukleinsyre ifølge et hvilket som helst af kravene 13-16.
19. 18. Ekspressionsvektor ifølge krav 17, kendetegnet ved, at den er en 15 bakterie-, gær-, pattedyr- eller insekt-ekspressionsvektor.
20. 19. Ekspressionevektor ifølge krav 18, kendetegnet ved, at den indeholder TYA-genet med et restriktionsenzymspaltningssted i TYA-aenet. hvori den anden nukleotidsekvens er indsat.
21. 20. Ekspressionsvektor ifølge krav 18 eller 19, kendetegnet ved, at 20 den indeholder de første 381 kodoner af TYA-aenet.
22. 21. Bakterie-, gær-, pattedyr- eller insektcelle, kendetegnet ved, at den omfatter en ekspressionevektor ifølge et hvilket som helst af kravene 17-20.
23. 22. Fremgangsmåde til fremstilling af ét i det væsentlige rent bio-25 logisk aktivt peptid, kendetegnet ved, at den omfatter, at partikler ifølge et hvilket som helst af kravene 8-11 separeres fra associerede urenheder, og at et biologisk aktivt peptid efterfølgende spaltes fra fusionsproteinerae i partiklerne.
24. 23. Diagnostisk reagens, kendetegnet ved, at den omfatter en partikel 30 ifølge et hvilket som helst af kravene 8-11, eller et fusionsprotein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, som er dispergeret på et fast underlag, hvilken partikel eller fusionsprotein er immmunologisk reaktivt med et antistof, som produceres som respons på infektiøse angentia hos pattedyr.