CN105985968A - 改进的广谱核酸内切酶及其工业生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可在酵母细胞中高效表达的编码改进的广谱核酸内切酶的DNA、由该DNA编码的改进的广谱核酸内切酶、以及利用基因工程和蛋白质工程技术构建所述DNA和广谱核酸内切酶的方法；本发明还涉及生产该改进的广谱核酸内切酶的工业发酵方法。利用该工业发酵方法，使所述编码改进的广谱核酸内切酶的DNA在真核宿主酵母细胞中表达，所生产的改进的广谱核酸内切酶比活性高且产率高，解决了现有技术中产率低、纯化困难的问题。此外，本发明的改进的广谱核酸内切酶不含细菌内毒素，可有利地用于医药和生物工程领域。同时，本发明的改进的广谱核酸内切酶还可被制备为冻干粉剂型，从而使得产品的运输、保存和工业化应用更为便利。

Description

改进的广谱核酸内切酶及其工业生产方法

技术领域

本发明涉及一种编码广谱核酸内切酶的DNA、由该DNA编码的广谱核酸内切酶、以及利用基因工程和蛋白质工程技术对所述DNA和广谱核酸内切酶进行构建的方法；本发明还涉及生产该广谱核酸内切酶的工业发酵方法。具体而言，本发明涉及编码改进的灵杆菌核酸酶的DNA、由该DNA编码的改进的灵杆菌核酸酶、以及利用基因工程和蛋白质工程技术对所述DNA和灵杆菌核酸酶进行构建的方法；本发明还涉及生产该改进的灵杆菌核酸酶的工业发酵方法。

背景技术

灵杆菌核酸酶作为一种广谱核酸内切酶，是一种来源于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens，又称灵杆菌)的非限制性广谱核酸内切酶，可被灵杆菌分泌至胞外，非特异性地切割核酸中的磷酸二酯键。与其它广谱核酸内切酶类似，灵杆菌核酸酶对核酸碱基序列无特异性要求，可在核酸链内的任意核苷酸间进行切割；并且，它可切割任意形式的核酸(单链、双链、线状、环状或超螺旋形式的DNA、RNA)；此外，它对核酸的消化效率远高于其它核酸酶，其活性是牛胰DNase I的34倍、金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)核酸酶的6倍。

天然的灵杆菌核酸酶由266个氨基酸组成，包括21个氨基酸的信号肽及245个氨基酸的成熟核酸酶(SEQ ID NO.1，Swiss-Prot：P13717.2)。由于其出色的切割效率，可将灵杆菌核酸酶用作降低细胞培养物上清液和细胞裂解液粘度的首选酶制剂。在疫苗工业以及基于蛋白类和多糖类产品的制药工业中，应用灵杆菌核酸酶可使这些产品中的核酸污染降低到皮克(picogram，pg)量级。2010年，中国药监局参考国外生物疫苗和重组蛋白质新药的申报标准，颁布了每剂疫苗的核酸残留不得超过10pg的新标准。由于其它方法很难实现该核酸残留技术标准，应用灵杆菌核酸酶去除具有潜在致癌性的核酸成为必然选择。因此，采用灵杆菌核酸酶消化核酸并通过层析进行纯化已成为国内外企业在制备生物疫苗和重组蛋白质新药等产品的过程中的通用做法。

然而，灵杆菌是一种致病菌，在对其进行大规模培养和生产的过程中存在较大风险。迄今为止，国内外商品化的灵杆菌核酸酶均是利用大肠杆菌作为宿主发酵生产的。目前市场上的主导产品为由Merck公司开发的商品名为Benzonase的灵杆菌核酸酶。Benzonase同样是以大肠杆菌作为宿主，由其表达天然序列的灵杆菌核酸酶而获得。目前该产品已通过美国FDA的使用许可，广泛用于去除生物制品中的核酸。然而，由于Benzonase对大肠杆菌宿主细胞具有毒性且纯化方法复杂，因此产量低且价格高。每1百万单位(相当于约1毫克蛋白)国外产品的售价高达3至8万元人民币(Sigma及Merck)，国产类似产品的售价也高于1万元，如此高昂的价格限制了灵杆菌核酸酶的广泛应用。此外，由于不易将原核表达系统自身的细菌内毒素从制得的灵杆菌核酸酶产品中去除，限制了灵杆菌核酸酶在工业生产中的应用。

发明内容

为克服现有技术中的上述缺点，发明人借助基因工程和蛋白质工程技术，在DNA水平对编码天然灵杆菌核酸酶的基因序列(SEQ ID NO.2，编码成熟灵杆菌核酸酶的DNA序列)进行优化，使得本发明的改进的灵杆菌核酸酶能够在真核酵母细胞中高效表达、正确折叠，获得了产率和活性均十分出色的改进的灵杆菌核酸酶(在本文中，本发明的改进的灵杆菌核酸酶也可称为“广谱核酸内切酶”、“Binuclease”或“SMnuclease”)。

在第一方面，本发明提供了一种可在酵母细胞中高效表达的编码广谱核酸内切酶的DNA，该DNA的序列为在进行优化设计后通过用酵母的偏好密码子替换天然灵杆菌核酸酶基因中的相应密码子而获得，其特征在于，所述编码广谱核酸内切酶的DNA的序列如SEQ ID NO.3所示：

为提高纯化效率和收率等，还可进一步在所述编码广谱核酸内切酶的DNA末端连接附加序列，所述附加序列包括编码纯化标签的DNA序列和编码间隔序列的DNA序列，还包括编码将广谱核酸内切酶从宿主细胞中分泌出的分泌信号肽的DNA序列。

在第二方面，本发明提供了由第一方面所述的编码广谱核酸内切酶的DNA在酵母细胞中表达而得到的广谱核酸内切酶，该广谱核酸内切酶的比活性可提高至天然灵杆菌核酸酶的2.1倍。

在第三方面，本发明提供了包含第一方面所述的编码广谱核酸内切酶的DNA的表达载体。

在第四方面，本发明提供了导入第三方面所述的表达载体的转化细胞。

在第五方面，本发明提供了利用第四方面所述的转化细胞进行工业发酵生产本发明的改进的广谱核酸内切酶的方法。

在第六方面，本发明提供了利用第五方面所述的方法获得的广谱核酸内切酶制剂。

有益效果

本发明的改进的广谱核酸内切酶不但在功能上保持了天然灵杆菌核酸酶降解各种形式的DNA和RNA(单链、双链、线状、环状或超螺旋形式的DNA和RNA)的能力，而且，成熟的酶能够分泌到细胞外，避免了对宿主胞内核酸的消化，从而大大降低了对宿主细胞的毒性，并由此提高了产量。同时，由于使用真核生物酵母作为宿主，本发明的改进的广谱核酸内切酶不具有细菌内毒素，在用于医药产品的中间处理步骤时更加安全。

此外，本发明的生产方法可用于进行大规模工业发酵，廉价高效地获得本发明的改进的广谱核酸内切酶，该方法的生产成本可以降到同类产品的1％-10％，产量则可以达到使用原核细胞宿主时的100-500倍；与天然灵杆菌核酸酶的市售产品(Merck)相比，本发明的改进的广谱核酸内切酶产品的比活性可提高至2.1倍。同时，本发明的改进的广谱核酸内切酶不仅可被制备为传统的液体剂型，还可被制备为冻干粉剂型，从而使得产品的运输、保存和工业化应用更为便利。

具体实施方式

下文将详细阐述本发明。

编码广谱核酸内切酶的DNA及由其得到的广谱核酸内切酶

根据本发明的一些实施方式，本发明第一方面所述的编码广谱核酸内切酶的DNA可进一步在其末端连接有编码纯化标签的DNA序列，所述编码纯化标签的DNA序列包括但不限于编码组氨酸(His)标签或谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签的DNA序列。根据本发明的另一些实施方式，还可利用编码间隔序列的DNA序列将所述编码纯化标签的DNA序列连接至所述编码广谱核酸内切酶的DNA。

在涉及本发明第一方面所述的编码广谱核酸内切酶的DNA的各种实施方式中，就术语“在其末端连接有”而言，当提及“在其3’端连接有”时，是指在其3′端的终止密码子前添加所需序列；当提及“在其5’端连接有”时，是指在其5′端前添加所需序列。

在一个优选的实施方式中，本发明的编码广谱核酸内切酶的DNA(SEQ ID NO.3)可进一步在其3’端连接有编码六聚组氨酸(6XHis)标签的DNA序列，如SEQ ID NO.4所示：

由SEQ ID NO.4所示的DNA序列表达所得到的广谱核酸内切酶在其C端带有六聚组氨酸(6XHis)标签，因而下文也可将其称为Binuclease-6XHis，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在另一个优选的实施方式中，本发明的编码广谱核酸内切酶的DNA(SEQ ID NO.3)可进一步在其5’端连接有编码六聚组氨酸(6XHis)标签的DNA序列、并利用编码甘氨酸-丝氨酸(GS)间隔序列的DNA序列连接所述编码六聚组氨酸(6XHis)标签的DNA序列与所述编码广谱核酸内切酶的DNA，如SEQ ID NO.6所示：

由SEQ ID NO.6所示的DNA序列表达所得到的广谱核酸内切酶在其N端带有六聚组氨酸(6XHis)标签和间隔序列GS，因而下文也可将其称为6XHis-Binuclease，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

在上述实施方式中，通过使本发明的编码改进的广谱核酸内切酶的DNA在真核宿主酵母细胞中表达，所得到的改进的广谱核酸内切酶具有提高的比活性，可达到天然灵杆菌核酸酶比活性的约2.1倍；同时，通过在本发明的改进的广谱核酸内切酶的末端(C端或N端)加入六聚组氨酸(6XHis)标签，可简化蛋白纯化过程，而表达和纯化策略的改进能够使得产率提高100倍至500倍；另外，间隔序列GS的加入还可使得本发明的改进的广谱核酸内切酶的产率进一步提高。

根据本发明的一些实施方式，为了使本发明的改进的广谱核酸内切酶在表达过程中更好地分泌至胞外，可用宿主细胞特异的分泌信号肽序列替换灵杆菌核酸酶的天然信号肽序列。本发明可使用的宿主细胞特异的分泌信号肽包括但不限于α因子信号肽、酸性磷酸酶(PHO5)信号肽和蔗糖酶(SUC2)信号肽。在一个优选的实施方式中，本发明的分泌信号肽可为酿酒酵母的α因子信号肽。

在一个实施方式中，可通过化学合成的方式获得本发明的编码广谱核酸内切酶的DNA(带有或不带有编码纯化标签的DNA序列及任选的编码间隔序列的DNA序列)。

表达载体

本发明第三方面所述的表达载体是用于在酵母细胞中表达本发明的改进的广谱核酸内切酶的载体。根据本发明一些优选的实施方式，可将控制DNA表达的启动子序列可操作地连接至本发明第一方面所述的编码广谱核酸内切酶的DNA序列的上游；此外，还可将终止子序列可操作地连接至本发明第一方面所述的编码广谱核酸内切酶的DNA序列的下游。

可使用本领域技术人员熟知的多种酵母细胞表达载体，包括但不限于pPICZ、pPICZα、pGAPZ、pGAPZα、pGAPZαA和pPIC9K。从拷贝数和稳定性的角度来看，优选pPIC9K。

根据本发明一些优选的实施方式，可将用于挑选重组子的选择标记基因或用于检测导入基因表达的报告基因插入本发明的表达载体中。选择标记基因的实例包括但不限于潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。报告基因的实例包括但不限于β-葡糖醛酸酶(GUS)基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、荧光素酶(LUC)基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因。

转化细胞及筛选

本发明第四方面所述的转化细胞是导入本发明第三方面所述的表达载体的细胞，该细胞能表达本发明的改进的广谱核酸内切酶。该转化细胞可以是原核细胞、或可以是真核细胞，但从表达效率和产物活性等多方面考虑，该转化细胞优选为真核细胞。

所述真核细胞的实例包括但不限于酵母细胞。根据本发明一个优选的实施方式，所述真核细胞为酵母细胞。更优选地，所述酵母细胞为毕赤酵母(Pichia)细胞、假丝酵母(Candida)细胞、多型汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)细胞、球拟酵母(Torulopsis)细胞、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)细胞和克鲁维酵母(Kluyveromyces)细胞。

根据本发明一个尤其优选的实施方式，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞。由于目前对毕赤酵母的发酵条件有着更深入的研究，且毕赤酵母细胞在发酵制备中成本最低，能够满足技术需求和产品市场化的需求，因而毕赤酵母细胞被认为是广谱核酸内切酶生产中最为优选的转化细胞。

可根据转化细胞的类型适当选择将表达载体导入转化细胞的方法。这些方法都是本领域技术人员已知的。

根据本发明的一个实施方式，可通过以下方法获得毕赤酵母转化子：采用电击转化的方法，将线性化的表达载体转化到毕赤酵母感受态细胞中。随后将菌体悬液涂布于平板上，该平板含有鱼精DNA并加有0.01％的甲基绿，显示为蓝色。成功导入并表达广谱核酸内切酶的毕赤酵母能够将核酸酶分泌到培养基中并消化其周围的DNA，从而导致蓝色消失并在培养平板上的菌落周围出现大小不一的透明圈。透明圈直径越大，表明该菌落分泌核酸酶的能力越强，选择直径大的透明圈里的菌落作为下一步筛选的目标。

利用转化细胞进行工业发酵生产广谱核酸内切酶的方法

根据本发明的一个实施方式，可在实验室条件下用摇瓶筛选高效表达本发明的改进的广谱核酸内切酶的基因工程菌株，过程如下：

挑取酵母单菌落至YPD培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)中培养。离心收集菌体。用MM培养基(13.4g/L酵母基础氮源(YNB)，4×10^-4g/L生物素，0.5％(v/v)甲醇)重悬菌体后振荡培养，开始诱导表达。每约24小时向诱导表达的发酵液中补加终浓度为0.5％(v/v)的甲醇。在诱导表达的不同时间取样，测定发酵液上清(培养基上清液)中广谱核酸内切酶的含量，选取表达量最高的菌株作为工业化培养的基因工程菌株。

根据本发明的一个实施方式，在30升发酵罐水平进行工程菌株培养基配方、培养时间、溶氧、诱导时间和诱导剂用量优化等试验，找到适合工业生产放大的条件，从而在发酵罐中高密度培养筛选出的菌株，高效表达本发明的改进的广谱核酸内切酶。随后，对高密度发酵菌体和发酵液分离、微滤澄清发酵液、超滤浓缩发酵液及发酵液脱色、以及随后的精细纯化技术进行选择。经过多次正交试验和层析介质(金属螯合层析和阳离子交换层析)、条件的筛选，得到可行纯化方案。

根据本发明的一些实施方式，本发明的改进的广谱核酸内切酶可以制成液体制剂或冻干粉制剂。在冻干粉制剂的实施方式中，通过寻找合适的低温冷冻保护剂的组成和冻干曲线，获得酶活性合格的成品酶冻干粉制剂。

根据本发明的一个实施方式，可将30升发酵罐得到的技术方案移植到5吨自动发酵罐生产线。通过对各个发酵参数进行修正，适应5吨工业化生产设备条件下的高密度发酵要求，调整生产工艺使重组酶产量和酶活高于中试水平。产品下游处理工艺放大至4吨级发酵液处理水平，扩大相应的微滤、超滤、亲和柱层析和离子交换柱层析规模，制备出纯品液体酶制剂和固体冻干粉酶制剂。

附图说明

图1是市售酵母表达载体pPIC9K载体的图谱。

图2示出了插入有本发明的编码广谱核酸内切酶的DNA的酵母表达载体pPIC9K-SMnuclease质粒中编码6XHis-Binuclease的DNA序列(SEQID NO.6)的测序结果，该编码广谱核酸内切酶的DNA在其5’端连接有编码六聚组氨酸(6XHis)标签的DNA序列、并利用编码甘氨酸-丝氨酸(GS)间隔序列的DNA序列连接所述编码六聚组氨酸(6XHis)标签的DNA序列与所述编码广谱核酸内切酶的DNA。

图3示出了插入有本发明的编码广谱核酸内切酶的DNA的酵母表达载体pPIC9K-SMnuclease质粒中编码Binuclease-6XHis的DNA序列(SEQID NO.4)的测序结果，该编码广谱核酸内切酶的DNA在其3’端连接有编码六聚组氨酸(6XHis)标签的DNA序列。

图4示出对表达6XHis-Binuclease的GS115/pPIC9K-SMnuclease酵母转化子进行菌落PCR鉴定、并用琼脂糖凝胶电泳进行检测的结果。其中，第1泳道为DNA分子量标准，第2-4泳道分别为#1至#3克隆。

图5示出利用SDS-PAGE对本发明的广谱核酸内切酶(6XHis-Binuclease)在摇瓶条件下的表达水平进行检测的结果。

图6示出利用琼脂糖凝胶电泳对在摇瓶条件下获得的本发明的广谱核酸内切酶(6XHis-Binuclease)消化λDNA的能力进行定性检测的结果。

图7示出利用SDS-PAGE对本发明的广谱核酸内切酶6XHis-Binuclease(图7a)和Binuclease-6XHis(图7b)在30L发酵罐培养条件下的表达水平进行检测的结果。

图8示出利用SDS-PAGE对经两步层析纯化后的本发明的广谱核酸内切酶(6XHis-Binuclease)的液体酶制剂和固体酶制剂的纯度进行检测的结果。

图9a和图9b分别示出利用琼脂糖凝胶电泳对经两步层析纯化后的本发明的广谱核酸内切酶(6XHis-Binuclease)消化λDNA、质粒DNA和RNA的能力进行定性检测的结果。

实施例

借助于下述实施例可更好地理解本发明，这些实施例仅用于举例说明本发明，不应被解释为对本发明的限制。

在以下实施例中，所有基因操作均可根据Molecular Cloning(ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989))的教导进行。

实施例中所使用的溶液及培养基成分如下所示。

MM液体培养基：

酵母基础氮源 13.4g/L，

生物素 0.4mg/L，

甲醇 0.5％(v/v)。

MM平板用固体培养基：

YPD液体培养基：

酵母提取物 10g/L，

蛋白胨 20g/L，

葡萄糖 20g/L。

配制1L YPD液体培养基时，首先加入酵母提取物10g、蛋白胨20g，加水定容至900毫升，115℃灭菌20min。可事先配制10×葡萄糖溶液(200g/L)，无菌过滤，4℃保存。接种前无菌取用100毫升，加入900毫升YP培养基中，得到YPD培养基。

PTM₁微量元素溶液：

混匀过滤除菌，4℃避光保存。

BSM无机盐发酵培养基：

加浓氨水将pH调节至4～5，115℃灭菌20min。灭菌后接种前加入4.35mL/L的PTM₁微量元素溶液，接种前用氨水将pH调节至5.0。

甘油补料培养基：50％的甘油115℃灭菌20min后，加入4.35mL/L的PTM₁微量元素溶液。

甲醇补料培养基：100％的甲醇，加入4.35mL/L的PTM₁微量元素溶液后，过滤除菌。

实施例1：广谱核酸内切酶表达载体pPIC9K-SMnuclease质粒的构建

通过优化设计，将天然(野生型)灵杆菌核酸酶的DNA编码序列(SEQID NO.2)替换为由毕赤酵母的偏好密码子组成的DNA序列(SEQ ID NO.3)。同时，进一步在其3′端的终止密码子TAA前添加编码六聚组氨酸标签的DNA序列(SEQ ID NO.4)；或者，进一步在其5′端添加编码六聚组氨酸标签的DNA序列、并在两者间加入编码甘氨酸-丝氨酸(GS)间隔序列的DNA序列(SEQ ID NO.6)。随后，在上述带有六聚组氨酸标签编码序列和任选的间隔序列编码序列的广谱核酸内切酶(SMnuclease)编码序列SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6的5′端添加EcoR I酶切位点GAATTC，并在其3′端的终止密码子TAA后添加Not I酶切位点GCGGCCGC，用化学方法合成这些DNA序列。

将合成的DNA序列用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，并连接至同样进行双酶切的pUC57载体的EcoR I和Not I位点之间，得到携带SMnuclease编码序列的pUC57-SMnuclease质粒，扩增该质粒后，用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，将pUC57-SMnuclease中的SMnuclease编码序列切下，连接至同样进行双酶切的pPIC9K载体(美国Invitrogen公司)。用连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取克隆，扩增质粒，并用EcoR I和Not I进行双酶切鉴定。

通过上述步骤，将编码本发明的改进的广谱核酸内切酶的DNA片段(带有编码六聚组氨酸标签的DNA序列和任选的编码间隔序列的DNA序列)克隆至酵母表达载体pPIC9K(如图1所示)中，从而得到广谱核酸内切酶表达载体pPIC9K-SMnuclease质粒。

测序结果表明，在其5′端连接有编码6XHis纯化标签和间隔序列GS的DNA序列(图2)以及在其3′端连接有编码6XHis纯化标签的DNA序列(图3)的编码广谱核酸内切酶的DNA片段均已分别被正确插入pPIC9K载体中，从而获得了分别携带有编码6XHis-Binuclease的DNA片段和编码Binuclease-6XHis的DNA片段的重组pPIC9K-SMnuclease质粒。

实施例2：转化酵母菌株GS115/pPIC9K-SMnuclease的获得

本实施例中所述的转化酵母菌株GS115/pPIC9K-SMnuclease为导入实施例1中所得到的表达载体pPIC9K-SMnuclease的毕赤酵母GS 115菌株，所述pPIC9K-SMnuclease携带有编码6XHis-Binuclease的DNA片段或编码Binuclease-6XHis的DNA片段。

用限制性内切酶Sal I对实施例1中得到的重组pPIC9K-SMnuclease质粒进行酶切，使之线性化，用TE缓冲液(pH 8.0)将质粒浓度调整为1μg/μL，取20μL质粒与毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转移至冰预冷的电转杯(两极间隙0.1cm)中，冰浴5min。采用电转的方法，利用电转仪预设的毕赤酵母转化参数进行电穿孔，将该表达载体转化到毕赤酵母GS115感受态细胞中。

电转完毕后，迅速向电转杯中加入1mL冰预冷的1M山梨醇溶液，轻轻混匀，转至1.5mL EP管中。将菌体悬浮液涂布于添加有0.2g/L鱼精DNA和0.01％甲基绿的MM平板上，每块平板涂布500μL菌液。由于该平板含有鱼精DNA并加有0.01％的甲基绿，显示为蓝色。导入有本发明的编码广谱核酸内切酶的DNA序列并正确表达广谱核酸内切酶的毕赤酵母转化子能够将灵杆菌核酸酶分泌到培养基中，消化周围DNA，从而蓝色将消失、并在培养平板上的菌落周围出现大小不一的透明圈，透明圆圈直径越大，表明该菌落分泌灵杆菌核酸酶的能力越强。选择周围透明圈大的菌落进行进一步筛选。

在该实验中发现，导入编码6XHis-Binuclease的DNA片段的转化子和导入编码Binuclease-6XHis的DNA片段的转化子周围的透明圈都很明显，但是导入编码Binuclease-6XHis的DNA片段的转化子所形成的透明圈直径相比导入编码6XHis-Binuclease的DNA片段的转化子而言明显小许多，提示导入编码Binuclease-6XHis的DNA片段的转化子所分泌的酶的活性低于导入编码6XHis-Binuclease的DNA片段的转化子。后续测量两种酶的表达量和比活也证明了这点。

图4显示了对经透明圈大小筛选获得的导入编码6XHis-Binuclease的DNA片段的毕赤酵母转化子菌落进行菌落PCR鉴定的结果，该结果表明，目的片段确实已经正确插入表达载体中。

实施例3具有N端6XHis标签和间隔序列GS的广谱核酸内切酶(6XHis-Binuclease)在酵母细胞中的表达和检测

对于具有N端6XHis标签和间隔序列GS的广谱核酸内切酶，将实施例2中通过透明圈大小筛选获得的分泌该广谱核酸内切酶能力最强的GS115/pPIC9K-SMnuclease的单菌落接种于10mL YPD培养基中，于30℃在250rpm培养24h。1500g离心收集菌体，并用10mL MM培养基重悬菌体。随后在1L摇瓶中以1:1000的比例接种毕赤酵母转化子，于30℃在250rpm诱导表达。每天至少一次从培养基中取样离心，得到不同诱导时间的含有广谱核酸内切酶的上清液，保存于-70℃以备检测。适时向诱导液中补加终浓度为0.5％(v/v)的甲醇，共连续培养120小时。

利用SDS-PAGE对培养基上清液中广谱核酸内切酶的表达水平进行检测，并检验上清液中的广谱核酸内切酶消化λDNA的活性，选出广谱核酸内切酶表达水平最高的GS115/pPIC9K-SMnuclease转化子。

1.SDS-PAGE检测广谱核酸内切酶的表达水平

依照如下实验方案进行SDS-PAGE检测：

1.1制备SDS-PAGE凝胶：

1.1.1分离胶的制备：

在小烧杯中依次加入所需溶液成分，灌入预先装配好的双层玻璃板的间隙中，室温放置20min以上，直至凝胶聚合完全。

1.1.2浓缩胶的制备：

在小烧杯中依次加入所需溶液成分，灌入双层玻璃板间已凝聚的分离胶上方的间隙，室温放置20min以上，直至凝胶聚合完全。

1.2将分别得到的GS115/pPIC9K-SMnuclease的培养基上清液由-70℃取出，冰上融化后以沸水浴处理10min。12,000g离心1min，吸取上清加入到如上制备的凝胶的加样孔道中，上样量为20μL。同时加入蛋白质分子量标准(Unstained Protein Molecular Weight Marker，Fermentas)。

1.3 200V恒压电泳1.5h。

1.4卸下凝胶。按下表所示配制染色液和脱色液，进行考马斯亮蓝染色，观察样品中的目的蛋白条带。

结果如图5所示。对于表达具有N端6XHis标签和间隔序列GS的广谱核酸内切酶的转化子，摇瓶发酵培养的第8小时即可在发酵液上清(培养基上清液)中观察到明显的目的蛋白条带；诱导表达2天(约53小时)后表达量最高，随后表达量逐渐下降；3天后，SDS-PAGE检测不到目的蛋白条带。

图5中，各泳道中的样品如下：

第1道：蛋白质分子量标准；

第2道：诱导表达8小时的培养基上清液；

第3道：诱导表达21小时的培养基上清液；

第4道：诱导表达29小时的培养基上清液；

第5道：诱导表达35小时的培养基上清液；

第6道：诱导表达53小时的培养基上清液；

第7道：诱导表达59小时的培养基上清液；

第8道：诱导表达69小时的培养基上清液；

第9道：诱导表达77小时的培养基上清液；

第10道：诱导表达93小时的培养基上清液。

其中，第1道中的蛋白质分子量标准(Unstained Protein MolecularWeight Marker，Fermentas)的13条蛋白条带分别表示200kD、150kD、120kD、100kD、85kD、70kD、60kD、50kD、40kD、30kD、25kD、20kD及15kD的蛋白大小。

2.由广谱核酸内切酶消化λDNA的定性实验确证其活性

用按照本实施例的方式对GS115/pPIC9K-SMnuclease转化子进行摇瓶培养所获得的培养基上清液消化λDNA，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

具体步骤如下：

在10μl反应体系中，加入2μg DNA、50mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mMMgCl₂，1μL摇瓶发酵的培养基上清液。37℃水浴令其反应3min。反应完毕后立即置于冰上，并加入1μL 0.5M EDTA。再加入2μL 5×上样缓冲液，全部上样于1％琼脂糖凝胶，80V电泳30min。

如图6所示，在λDNA中加入含有本发明的广谱核酸内切酶的GS115/pPIC9K-SMnuclease转化子的发酵培养基上清液后，观测到DNA的有效降解。与图5中的SDS-PAGE结果示出的表达水平相对应地，在约80小时的诱导时间内，酶表达量越高，DNA降解越彻底；3天后，则观测不到明显的DNA降解。未加入培养基上清液的对照中DNA未降解。其中，各泳道中的样品如下：

第1道：加入诱导表达8小时的培养基上清液的反应样品；

第2道：加入诱导表达21小时的培养基上清液的反应样品；

第3道：加入诱导表达29小时的培养基上清液的反应样品；

第4道：加入诱导表达35小时的培养基上清液的反应样品；

第5道：加入诱导表达53小时的培养基上清液的反应样品；

第6道：加入诱导表达59小时的培养基上清液的反应样品；

第7道：加入诱导表达69小时的培养基上清液的反应样品；

第8道：加入诱导表达77小时的培养基上清液的反应样品；

第9道：加入诱导表达93小时的培养基上清液的反应样品；

第10道：加入诱导表达120小时的培养基上清液的反应样品；

第11道：未加入培养基上清液。

上述结果表明，本发明的具有N端6XHis标签和间隔序列GS的广谱核酸内切酶(6XHis-Binuclease)可在酵母细胞中有效表达，且获得的广谱核酸内切酶粗制品具有明显的DNA酶活性。

通过本轮筛选获得的毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-SMnuclease，其广谱核酸内切酶表达量超过500mg/L发酵液(摇瓶条件)。

实施例4具有C端6XHis标签的广谱核酸内切酶(Binuclease-6XHis)在酵母细胞中的表达和检测

对于具有C端6XHis标签的广谱核酸内切酶，采用与实施例3相同的方法，利用SDS-PAGE对培养基上清液中广谱核酸内切酶的表达水平进行检测，并检验上清液中的广谱核酸内切酶消化λDNA的活性，选出该广谱核酸内切酶表达水平最高的GS115/pPIC9K-SMnuclease转化子。

实施例5广谱核酸内切酶的大规模工业发酵生产及检测

将实施例3中筛选出的广谱核酸内切酶表达量最高的GS115/pPIC9K-SMnuclease菌株用于进行中试放大试验。参考美国Invitrogen公司的毕赤酵母培养方案(www.invitrogen.com)，在30升发酵罐水平进行基因工程菌株最佳培养条件探索，包括培养基配方、溶氧量、诱导时间和诱导剂甲醇的用量等。本实施例采用与摇瓶发酵中相同的培养基。

具体发酵培养步骤如下：

1.种子培养阶段

将实施例3筛选得到的高效表达本发明的广谱核酸内切酶的GS115/pPIC9K-SMnuclease菌株接种至加入了种子培养基(YPD液体培养基)的摇瓶中，在30℃于250rpm振荡培养20h后，得到种子。

2.甘油分批培养阶段

按5％～10％的比例将上述种子接种至装有10L发酵培养基的30L发酵罐(已预先在115℃灭菌20min)中，将参数设定为搅拌转速300rpm、一定通气量、发酵温度30℃、pH 5.0，开始发酵培养。通过调节搅拌速度、通气量、罐压等措施使DO维持在20％～35％左右，当DO陡然上升接近100％时，说明培养基中甘油已经消耗殆尽，此时菌体浓度达到90～150g/L。本阶段持续约15～20h。

在甘油分批培养阶段，每4h取样一次，测定酵母菌发酵液的光密度和菌体湿重。

3.甘油补料分批培养阶段

甘油分批培养阶段实现菌体扩增后，进行短时间的甘油补料分批培养阶段。

在发酵罐中慢速流加甘油补料培养基，同时通过提高搅拌速度、通气量、罐压等措施使DO维持在20％～35％左右。至菌体湿重增加到180～220g/L时，停止补加甘油，观察DO值上升至100％后，继续维持“甘油饥饿”状态0.5h。本阶段持续约5～10h。

在甘油补料分批培养阶段，每2h取样一次，测定酵母菌发酵液的光密度和菌体湿重。

4.甲醇补料分批诱导表达阶段

甘油补料分批培养阶段实现菌体扩增后，进行甲醇诱导表达阶段。诱导过程中流加氨水维持pH恒定，同时氨水也用作氮源。

“饥饿”期间调温度至28℃，pH维持5.0，先以1mL/h/L维持低速流加甲醇补料培养基4h，使工程菌适应以甲醇作为唯一碳源的环境，再根据溶氧的变化提高甲醇流加速度，并通过调节搅拌速度、通气量、罐压等措施使DO值维持在20％～35％左右，此时菌体浓度达到350～450g/L。

开始诱导表达后，每4h取样一次，测定酵母菌发酵液的光密度OD₆₀₀和菌体湿重，并留上清用于蛋白分析。

为检测蛋白表达的目的，在30L发酵罐水平下，用甲醇诱导187小时，溶氧量控制在30％，控制发酵罐中诱导剂甲醇的浓度为1％(v/v)，诱导后每隔约8小时取样，通过SDS-PAGE分析酶蛋白表达量。

图7a显示了检测30L发酵罐水平下不同诱导时间时培养基上清液中广谱核酸内切酶(具有N端6XHis标签和间隔序列GS的广谱核酸内切酶6XHis-Binuclease)含量的SDS-PAGE结果。

可以看出，发酵罐条件下的蛋白表达量比摇瓶条件下明显提高，在诱导约94小时时达到最高峰。

图7a中各泳道的样品如下：

1.Thermo 26614#蛋白marker；

2.诱导前的培养基上清液；

3.诱导24h的培养基上清液；

4.诱导46.5h的培养基上清液；

5.诱导73h的培养基上清液；

6.诱导93.5h的培养基上清液；

7.诱导117.5h的培养基上清液；

8.诱导140h的培养基上清液；

9.诱导163h的培养基上清液；

10.诱导187h的培养基上清液。

同样地，根据本实施例中的发酵培养方法，将实施例4中筛选出的广谱核酸内切酶表达量最高的GS115/pPIC9K-SMnuclease菌株用于进行中试放大试验。结果如图7b所示。可以看出，对于表达具有C端6XHis标签的广谱内切酶Binuclease-6XHis的转化子，在30L发酵罐的中试水平下，也可有效实现目的蛋白的表达。

图7b中各泳道的样品如下：

第1道：诱导前的培养基上清液；

第2道：诱导前的培养基上清液；

第3道：诱导24小时的培养基上清液；

第4道：诱导24小时的培养基上清液；

第5道：诱导48小时的培养基上清液；

第6道：诱导48小时的培养基上清液；

第7道：蛋白marker。

上述结果表明，本发明的广谱核酸内切酶不仅可在摇瓶条件下高效表达，还可在发酵罐水平下高效表达，具备大规模工业发酵生产的潜能。

实施例6广谱核酸内切酶的分离和纯化

1.层析纯化过程

由实施例3-实施例5可以看出，本发明的广谱核酸内切酶能够被成功分泌到培养基的上清液中。因此，培养完成后经过离心、微滤得到澄清液体，随后经过两步层析(金属螯合层析和SP阳离子交换层析柱层析)，便可以从培养基上清液得到纯化的酶蛋白。具体步骤如下：

首先进行金属螯合层析，层析过程参照Qiagen公司产品手册进行。

金属螯合层析所使用的试剂和材料如下：

收集洗脱峰，经过透析除盐后，进行第二步SP阳离子交换层析柱层析。SP阳离子交换层析柱层析的操作过程参照GE公司产品说明书进行。所使用的试剂和材料如下：

2.液体酶制剂的制备

将由上述SP阳离子交换层析柱层析过程收集到的洗脱峰通过透析除盐。使用截留分子量为10KD的透析袋，将其在1mM EDTA溶液中煮沸30min，用ddH₂O清洗后装入需要透析的洗脱组分。所使用的透析液为20mM Tris-HCl，pH7.5。在4℃环境中，透析液每8小时换液一次，连续换液三次以上。

透析完成后，检测蛋白质浓度、电泳纯度和酶活性，然后过滤除菌，添加甘油至浓度50％，-20℃保存。

3.固体酶制剂(冻干粉)的制备

在经过透析的液体酶制剂的基础之上，加入冻干保护剂20mMTris-HCl(pH7.4)、10％海藻糖(也可使用山梨醇或甘露糖)和1mM CaCl₂，使得广谱核酸酶的终浓度为2-10％。-55℃冷冻干燥过夜。该冻干粉形式的固体酶制剂为现有国内外市场中首次开发，可极大促进运输和储存。

利用SDS-PAGE对纯化后的本发明的广谱核酸内切酶的液体酶制剂和固体酶制剂(6XHis-Binuclease)的纯度进行检测的结果见图8。从图8可以看出，在两步层析纯化后，无论是液体酶制剂、还是固体酶制剂，SDS-PAGE电泳均呈现单一蛋白条带。

将两步层析纯化制备的酶(6XHis-Binuclease)稀释2000倍后，取1微克λDNA加入1微升经过稀释的酶中，分别在37℃消化2分钟和5分钟，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。观察底物λDNA的消化情况，结果见图9a。

图9a中各泳道的样品如下：

1.未加酶的反应样品；

2.消化2分钟的反应样品；

3.消化5分钟的反应样品。

另外，为检测本发明的广谱核酸内切酶对其它类型核酸的消化作用，将两步层析纯化制备的酶(6XHis-Binuclease)稀释2000倍后，取1微克质粒DNA和酵母RNA，分别加入1微升经过稀释的酶中，在37℃消化30分钟，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。观察底物质粒DNA和酵母RNA的消化情况，结果见图9b。

图9b中各泳道的样品如下：

1.未加酶的质粒DNA样品；

2.经本发明的广谱核酸内切酶消化后的质粒DNA样品；

3.未加酶的酵母RNA样品；

4.经本发明的广谱核酸内切酶消化后的酵母RNA样品。

可见，根据本发明的纯化方法获得的广谱核酸内切酶纯度高(图8)且对各种类型的核酸样品均显示出明显的核酸酶活性(图9a-图9b)。

实施例7广谱核酸内切酶比活性的定量检测

通过如下方法检测实施例6中经两步层析纯化后的本发明的广谱核酸内切酶的液体酶制剂和固体酶制剂的比活性。

检测所采用的试剂及配制方法如下：

溶液A：50mM Tris-HCl+1mM氯化镁和0.1％(w/v)牛血清蛋白(pH8.0)。根据终浓度在去离子水中加入Trizma Base(Sigma，产品编号T-1503)、六水合氯化镁(Sigma，产品编号M-0250)、牛血清蛋白(Sigma，产品编号A-4503)。在37℃用1M HCl调节pH到8.0，定容至100mL。

溶液B：0.1％(w/v)鲑鱼精DNA钠盐。根据终浓度，用如上配制的溶液A溶解鲑鱼精DNA钠盐(Sigma，产品编号D-1626)，定容至25mL。

溶液C：4％HClO₄。根据终浓度用去离子水配制10mL(Sigma，产品编号24425-2)。

溶液D：本发明的广谱核酸内切酶溶液(约40U/mL)。基于实施例6中经两步层析纯化后的本发明的广谱核酸内切酶的液体酶制剂和固体酶制剂，在临用时用预冷的溶液A配制和稀释而得。

检测步骤如下：

准备两个离心管，分别标注为测试管(T)和空白管(B)。分别将2.50mL溶液B加入测试管和空白管中，在37℃放置30min后，在测试管中加入0.125mL溶液D，在空白管中加入0.125mL溶液A，颠倒混匀，37℃恒温孵育30min后，从测试管和空白管中各吸取0.5mL，加入含有0.5mL溶液C的EP管中，冰上放置60min。随后12000rpm 4℃离心5min，用分光光度计(光程1cm)在260nm分别测定T和B上清的吸光度A_260nmT和A_260nmB，用溶液A作为对照。

广谱核酸内切酶的酶活性计算公式为：

式中，分析总体积为2.625mL，df为稀释倍数，分析用上清体积为0.5mL，所用酶的体积为0.125mL。

根据该检测方法，一个酶活性单位定义为在2.625mL的反应体系中，在37℃、pH 8.0的条件下，在30min内产出的寡核苷酸能够使260nm处的吸光度值变化1.0的量。

在2.625mL反应体系中，加入了终浓度为50mM的Tris-HCl、1mM的氯化镁、0.1％(w/v)的牛血清蛋白、0.095％的鲑鱼精DNA钠盐和5U的本发明的广谱核酸内切酶，所测得的酶活性和比活性如表1所示。

表1本发明的广谱核酸内切酶的酶活性和比活性测定

可见，由本发明的具有N端6XHis标签和间隔序列GS的广谱核酸内切酶制得的液体酶制剂和固体酶制剂的灵杆菌核酸酶比活性均好于商购的Benzonase产品；由本发明的具有C端6XHis标签的广谱核酸内切酶制得的液体酶制剂的灵杆菌核酸酶比活性也显示出可接受的水平。

工业实用性

本发明利用基因工程和蛋白质工程技术的结合，构建出在真核酵母细胞中高效表达且具有高比活性的广谱核酸内切酶。与天然灵杆菌核酸酶分子相比，本发明的改进的广谱核酸内切酶的比活性可提高至天然灵杆菌核酸酶的约2.1倍。同时，由于采用改进的真核细胞表达系统和优化的工业培养技术，宿主细胞中的酶蛋白表达水平提高了100-500倍，从每升发酵液表达几毫克大幅提升至几百毫克。进而，通过在下游纯化处理过程中引入金属螯合层析技术，提高了产品回收率，将相应生产成本降低至现有工艺的10％以下。此外，最终产品除了传统液体剂型，还可制备为冻干粉剂型，应用范围更广。

Claims (10)

1.一种编码广谱核酸内切酶的DNA，所述编码广谱核酸内切酶的DNA的序列如SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的编码广谱核酸内切酶的DNA，其特征在于，所述编码广谱核酸内切酶的DNA进一步在其3’端连接有编码六聚组氨酸标签的DNA序列，所得DNA的序列如SEQ ID NO.4所示。

3.如权利要求1所述的编码广谱核酸内切酶的DNA，其特征在于，所述编码广谱核酸内切酶的DNA进一步在其5’端连接有编码六聚组氨酸标签的DNA序列、并利用编码甘氨酸-丝氨酸间隔序列的DNA序列连接所述编码六聚组氨酸标签的DNA序列与所述编码广谱核酸内切酶的DNA，所得DNA的序列如SEQ ID NO.6所示。

4.如权利要求1-3中任一项所述的编码广谱核酸内切酶的DNA，其特征在于，所述编码广谱核酸内切酶的DNA进一步连接有编码分泌信号肽的DNA序列；

优选地，所述分泌信号肽为酿酒酵母的α因子信号肽。

5.如权利要求1-4中任一项所述的编码广谱核酸内切酶的DNA在酵母细胞中表达而得到的广谱核酸内切酶。

6.用于表达如权利要求1-4中任一项所述的编码广谱核酸内切酶的DNA的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求1-4中任一项所述的编码广谱核酸内切酶的DNA的序列；

优选地，所述表达载体选自于pPICZ、pPICZα、pGAPZ、pGAPZα、pGAPZαA和pPIC9K；

进一步优选地，所述表达载体为pPIC9K。

7.导入如权利要求6所述的表达载体的转化细胞；

优选地，所述转化细胞为毕赤酵母(Pichia)细胞、假丝酵母(Candida)细胞、多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞、球拟酵母(Torulopsis)细胞、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)细胞和克鲁维酵母(Kluyveromyces)细胞；

进一步优选地，所述转化细胞为毕赤酵母细胞。

8.生产如权利要求5所述的广谱核酸内切酶的工业发酵方法，其特征在于，所述工业发酵方法包括利用如权利要求7所述的转化细胞进行种子培养、甘油分批培养、甘油补料分批培养、甲醇补料分批诱导表达的步骤；以及对表达得到的广谱核酸内切酶进行分离纯化的步骤；

优选地，所述分离纯化的步骤通过金属螯合层析继以SP阳离子交换层析柱层析而进行。

9.如权利要求8所述的工业发酵方法获得的广谱核酸内切酶制剂，其特征在于，所述广谱核酸内切酶制剂为冻干粉固体酶制剂或液体酶制剂。

10.如权利要求9所述的广谱核酸内切酶制剂，其特征在于，所述广谱核酸内切酶制剂为冻干粉固体酶制剂，所述冻干粉固体酶制剂的冻干保护剂为20mM pH为7.4的Tris-HCl、10％海藻糖和1mM CaCl₂。