CN110616209A - 一种突变型RNAseA及其在酵母细胞的表达和纯化方法 - Google Patents

一种突变型RNAseA及其在酵母细胞的表达和纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种突变型RNAseA及其在酵母细胞的表达和纯化方法，所述表达方法如下：克隆突变型RNase A的基因；突变型RNase A重组质粒转化到毕赤酵母；突变型RNase A在酵母细胞中的表达及检测。所述纯化方法如下：取500毫升RNaseA发酵液即培养基上清，用NaOH+磷酸氢二钠液体调pH8.0沉淀；离心；将澄清液体连续上样平衡好的Ni Sepharose 6FF层析柱；用0.25M咪唑洗脱目的蛋白，按照流出图谱收集峰；将收集的洗脱峰，用截流分子量3.5KDa透析袋透析得到透析好的样品蛋白；将透析好的样品蛋白，进行第二次离子交换柱层析得到纯化蛋白。

Description

一种突变型RNAseA及其在酵母细胞的表达和纯化方法
技术领域
本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术生产重组突变型核糖核酸酶A的技术领域，具体为一种突变型RNAseA及其在酵母细胞的表达和纯化方法。
背景技术
突变型核糖核酸酶A(Ribonuclease A，突变型RNase A)是经过蛋白质工程技术改造的源于牛胰腺(bovine pancreas)的非特异性核糖核酸内切酶。突变型RNase A是一种核糖核酸内切酶，可以水解核苷上5’-核糖与相邻的嘧啶核苷3’-核糖上的磷酸基团之间的磷酸二酯键，产生的2’，3’-环磷酸可水解为相应的3’-核苷磷酸盐。因而可在C和U核苷酸残基位置特异性地降解单链RNA。突变型RNase A十分稳定。突变型RNase A作用于单链RNA时，效率最高。
目前商品化的生产核糖核酸酶A是提取、纯化自牛胰腺，其缺点是纯度低，来源于动物。而且纯化方法复杂，因此价格高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种突变型RNAseA及其在酵母细胞的表达和纯化方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种突变型RNAseA，其DNA序列如SEQ No.1所示。
一种突变型RNAseA在酵母细胞的表达方法如下：
1)克隆突变型RNase A的基因得到突变型RNase A重组质粒；
2)将步骤1)所述的突变型RNase A重组质粒转化到毕赤酵母得到GS115/pPIC9K-RNaseA的酵母单菌落；
3)突变型RNase A在酵母细胞中的表达及检测：
a)将步骤2)中得到的GS115/pPIC9K-RNaseA的酵母单菌落接种至10mLYPD培养基中，30℃，250rpm培养24h，1500g离心收集得到重悬菌体；
b)用10mL MM培养基培养步骤a)所述的基重悬菌体，随后在30℃，250rpm下摇瓶诱导表达；
c)向MM培养基中补加终浓度为0.5％(v/v)的甲醇，连续6天，共培养144小时，离心培养产物，从而得到含有上述突变型RNase A的培养基上清，进行SDS-PAGE检测和消化RNA活性检验。
优选地，步骤1)所述的克隆方法如下：
分别用限制性内切酶EcoRI、NotI将基因突变型RNaseA编码序列切下，与进行同样双酶切的pPIC9K载体连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，将基因突变型RNaseA的DNA片段亚克隆至酵母表达载体pPIC9K中，从而构建出基因突变型RNaseA的表达载体pPIC9K-RNaseA。
优选地，步骤2)所述转化到毕赤酵母的方法如下：
利用限制性内切酶Sal I酶切实步骤1)中所构建的重组质粒即pPIC9K-RNaseA，然后用TE缓冲液溶解至1μg/μL的浓度，取20μL溶解的重组质粒与GS115酵母感受态细胞混匀，转移至冰预冷的电转杯中，冰浴5min；采用电击转化的方法，利用电转化仪内置的毕赤酵母转化参数进行电击，将上述重组质粒转化到GS115酵母感受态细胞中。
优选地，所述TE缓冲液的pH值为8.0。
优选地，所述电转杯两极间隙为0.1cm。
一种突变型RNAseA在酵母细胞的表达方法中所述突变型RNase A的纯化方法如下：
A)取500毫升RNaseA发酵液即培养基上清，用NaOH+磷酸氢二钠液体调pH8.0沉淀；
B)离心：将步骤A)所述沉淀后的RNaseA发酵液经过0.22微米过滤，得到澄清液体；
C)将步骤B)所述的澄清液体连续上样平衡好的Ni Sepharose 6 FF层析柱，冲洗10个柱体积；
D)用0.25M咪唑洗脱步骤C)所述Ni Sepharose 6 FF层析柱上的目的蛋白，按照流出图谱收集峰；
E)将收集的洗脱峰，用截流分子量3.5KDa透析袋透析得到透析好的样品蛋白，透析外液为：10mM NaAc-HAc pH4.0；
F)将透析好的样品蛋白，进行第二次离子交换柱层析得到纯化蛋白。
优选地，步骤F)所述的样品蛋白上样于10mM NaAc-HAc pH4.0平衡好的SPSepharose Fast Flow层析柱，用0.45M NaCl+10mM NaAc-HAc pH4.0预洗脱，再用1M NaCl+10mM NaAc-HAc pH4.0梯度洗脱，收集各峰。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：采用了酵母作为宿主细胞，合成突变的目的基因，插入到酵母质粒，进而转化到酵母染色体中，诱导重组酶分泌到培养基中避免对宿主细胞产生毒性，因而大大提高了酶产量；另外我们还通过蛋白质工程技术改造了核糖核酸酶A的基因和蛋白序列，以提高比活性和纯化制备过程，使之易于规模化工业生产。30升发酵和5000升培养规模，酶产量可以达到原核细胞宿主的100至500倍；另外突变位点的引入，可提高酶的比活性到现有产品2-3倍，规模化生产后，生产成本可以降到同类产品1％-10％。剂型由单一液体型改为液体剂型和冻干粉剂型，提高保质期三倍，便于该产品的运输、保存和工业化应用。另外山重组真核生物毕赤酵母生产重组酶，产品不具有细菌内毒素。应用于医药产品中间处理和制备DNA更加安全。
附图说明
图1为pPIC9K表达载体图谱；
图2为6Xhis-RNase A序列测定图；
图3为突变型RNaseA菌株目的基因PCR鉴定图；
图4为RNase A在摇瓶条件下的表达SDS-PAGE图；
图5为RNase A消化图；
图6为RNA定性试验图；
图7为30L发酵罐培养重组酵母诱导表达RNase A的电泳图谱；
图8为突变型RNaseA经过Ni-Sepharose柱层析图谱；
图9为突变型RNaseA经过SP-Sepharose柱层析图谱；
图10为RNase A经过两步色谱纯化后的SDS-PAGE图谱；
图11为RNAseA产品纯化冻干后SDS-page检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
此外，所有的基因操作可按Molecular Cloning(Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))所记载的进行。
1、突变型RNase A的基因克隆
将野生型重组核糖核酸酶A(SEQ No.1)替换为毕赤酵母偏爱密码子组成的DNA序列(序列5 N-his)，在其5’端添加EcoRI酶切位点GAATTC，5’端顺次添加六聚组氨酸标签CACCATCACCACCATCAC、终止密码子TAA及Not I酶切位点GCGGCCGC，利用化学方法合成上述DNA序列，见SEQ No.1。
扩增携带核酸酶基因的pUC57/RNaseA质粒，分别用限制性内切酶EcoRI、NotI将RNaseA编码序列切下，与进行同样双酶切的pPIC9K载体(购自美国Invitrogen公司)连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取克隆，扩增质粒，分别用限制性内切酶EcoRI、NotI鉴定质粒。
通过上述方法，将编码重组核糖核酸酶A的DNA片段亚克隆至酵母表达载体pPIC9K中(如图1所示)，从而构建出重组核糖核酸酶A表达载体pPIC9K-RNaseA。
DNA测序结果表明，目标片段均正确插入上述表达载体中。结果见附图2。
2、突变型RNase A重组质粒转化到毕赤酵母
利用限制性内切酶Sal I酶切所构建的重组质粒，使之线性化，然后用TE缓冲液(pH 8.0)溶解至1μg/μL的浓度，取20μL溶解的质粒与GS115酵母感受态细胞混匀，转移至冰预冷的电转杯(两极间隙0.1cm)中，冰浴5min。采用电击转化的方法，利用电转化仪内置的毕赤酵母转化参数进行电击，将上述表达载体转化到GS115酵母感受态细胞中。
电击完毕后，迅速向电转杯中加入1mL冰预冷的1M山梨醇溶液，轻轻混匀，转至1.5mL EP管中。将菌体悬液涂布于MM平板(13.4g/L酵母基础氮源；0.4mg/L生物素；0.5％ml/L甲醇，1.5％琼脂)上，每500μL涂布一块平板。随后将菌体悬液涂布于平板上，选择直径大的菌落作为下一步筛选的目标。挑取菌落进行PCR鉴定，插入目的基因的片段为887bp，利用特定于引物扩增正确的克隆保存，进行蛋白表达试验，见图3。
3、突变型RNase A在酵母细胞中的表达及检测
将筛选得到的GS115/pPIC9K-RNaseA的酵母单菌落接种至10mL YPD培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)中，30℃，250rpm培养24h。1500g离心收集菌体。用10mL MM培养基(13.4g/L YNB，4×10-4g/L生物素，5mL/L甲醇)重悬菌体。随后在30℃，250rpm下摇瓶(1L)诱导表达。每隔24个小时从培养基中取样以备检测，并向诱导表达的培养基中补加终浓度为0.5％(v/v)的甲醇，连续6天，共培养144小时，离心培养产物，从而得到含有上述重组核糖核酸酶A的培养基上清，进行SDS-PAGE检测和消化RNA活性检验。
SDS-PAGE检测突变型RNase A的表达水平
依照如下实验方案进行SDS-PAGE检测：
1.1 制备SDS-PAGE凝胶：
1.1.1 分离胶的制备：
在小烧杯中依次加入所需溶液成分，灌入预先装配好的双层玻璃板的间隙中，室温放置20min以上，直至凝胶聚合完全。
1.1.2 浓缩胶的制备：
在小烧杯中依次加入所需溶液成分，灌入双层玻璃板间已凝聚的分离胶上方的间隙，室温放置20min以上，直至凝胶聚合完全。
1.2 将GS115/pPIC9K-突变型RNase A的培养基上清由-70℃取出，冰上融化后以沸水浴处理10min。12 000g离心1min，吸取上清加入到如上制备的凝胶的样品孔道中，上样量为20μL。同时加入蛋白质分子量标准(Unstained Protein Molecular Weight Marker，Fermentas)。
1.3 200V恒压电泳1.5h。
1.4 卸下凝胶。按下表所示配制染色液和脱色液，进行考马斯亮蓝染色，以观察样品中的目的蛋白条带。
结果如图4所示，培养24小时即可在发酵液上清(摇瓶发酵)中观察到最明显的目的蛋白条带，诱导表达随时间增加酶的表达量逐渐提高。各泳道中的样品如下：
第1道：蛋白质分子量标准；(170，130，100，70，55，40，35，25，15，10kDa)
第2道：诱导表达24小时；
第3道：诱导表达48小时；
第4道：诱导表达72小时；
其中，蛋白质分子量标准目的条带在15KD左右。
2 突变型RNase A酶活性定性检测
所得到的摇瓶培养发酵液上清，用以检测是否可以消化RNA。消化完成后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的消化情况。
反应体系为10μl缓冲液中加入2μg RNA。缓冲液50mM Tris-Cl(pH 8.0)、1mMMgCl2，最后加入1μl摇瓶培养发酵液上清。37℃水浴3min；反应完后立即置冰上，加入1μl0.5M EDTA。再加入2μL 5×上样缓冲液，全部上样琼脂糖1％凝胶，80V电泳30min。观察结果并拍照记录。见图5、6。
4 生物反应器条件下发酵培养重组酵母和诱导表达突变型RNase A
选取一株酶表达量最好的菌株进行中试放大试验。在30升发酵罐水平进行基因工程菌株最佳培养条件探索，包括培养基配方、溶氧量、诱导时间和诱导剂甲醇的用量等。条件选择参考美国Invitrogen公司的毕赤酵母培养方案(www.invitrogen.com)，采用与摇瓶发酵中相同的培养基，甲醇诱导时间为187小时，溶氧量控制在30％，诱导剂甲醇的用量为1％(v/v)，诱导后每8小时取样，电泳分析酶蛋白表达量。图6是不同诱导时间突变型RNaseA的表达产物SDS-PAGE电泳，其蛋白表达产量比摇瓶明显提高，其中在诱导144小时时达到最高峰。具体如下：
4.1 培养基组成：
种子培养基：YPD液体培养基(g/L)：酵母提取物10g，蛋白胨20g，加水定容至900毫升，115℃，20min灭菌。葡萄糖20g(葡萄糖可以事先配成10*D：1升含200克，无菌过滤，4℃保存。接种前无菌取用100毫升，加入900毫升YP培养基中)。
加浓氨水调pH4～5之间灭菌，115℃，灭菌20min。灭菌后接种前无菌加PTM I：4.35ml/L，接种前用氨水调pH 5.0。
PTM1微量元素溶液(g/L)：
CuSO4·5H2O 6.0，KI 0.08，MnSO4·H2O 3.0，Na2MoO4·2H2O 0.2，
H3BO3 0.02，CoCl2 0.5，ZnCl2 20.0，FeSO4 7H2O 65.0，
Biotin 0.2，H2SO4 5.0ml，混匀过滤除菌，4℃避光保存。
甘油补料培养基：甘油50％，115℃，灭菌20min，+PTM I4.35ml/L。
甲醇补料培养基：甲醇100％，PTM I 4.35ml/L。
4.2.培养方法
4.2.1 种子培养
YPD液体培养基摇瓶中，30℃，250rpm振荡培养20h后，得到种子。
4.2.2 发酵罐灭菌：
30L发酵罐115℃，灭菌20min。
4.2.3 甘油分批培养阶段扩增菌体
将上述种子按5～10％接入装有10L无机盐发酵培养基的30L发酵罐中，设定参数：搅拌转速300rpm，一定通气量，温度30℃，pH 5.0，开始发酵培养。通过调节搅拌速度、通气量、罐压等措施使DO维持在20％～35％左右，当DO陡然上升接近100％时，说明培养基中甘油已经消耗殆尽，开始转入短时间甘油补料分批阶段培养菌体(菌体浓度达到90～150g/L)。本阶段约15～20h。
上述培养阶段每4h取样一次，测定发酵液中酵母菌体细胞光密度和菌体湿重。
4.2.4 甘油补料分批培养阶段扩增菌体
慢速流加50％甘油(含PTM I)到发酵罐中，同时提高搅拌速度、通气量、罐压等措施使DO维持在20％～35％左右。至菌体湿重到180～220g/L时，停止补加甘油，观察DO值上升至100％后，继续维持“甘油饥饿”状态0.5h，然后转入甲醇诱导表达阶段，诱导过程中流加氨水维持pH恒定，同时氨水也用作氮源。本阶段约5～10h。
上述培养阶段每2h取样一次，测定发酵液中酵母菌体细胞光密度和菌体湿重。
4.2.5 甲醇补料分批诱导表达阶段
“饥饿”期间调温度至28℃，pH还是5.0，先以1ml/h/L维持低速流加4h，以使工程菌适应以甲醇为唯一碳源的环境，再根据溶氧的变化提高甲醇流加速度，并通过调节搅拌速度、通气量、罐压等措施使D0值维持在20％～35％左右(菌体浓度达到350～450g/L)。本阶段约48～60h。
开始诱导表达后，每4h取样一次，测定发酵液中酵母菌体细胞光密度OD600和菌体湿重，并留上清用于蛋白分析。
根据本发明一个最为优选的实施方式，甲醇诱导时间为94小时。各时段诱导表达的核酸酶电泳照片见图7。上样顺序：
蛋白标准：170，130，100，70，55，40，35，25，15，10kDa
5 突变型RNase A的分离和纯化
突变型RNase A分泌到培养基上清经过离心、微滤得到澄清液体，然后经过两步层析得到纯化的酶蛋白。纯化过程如下：
取500毫升RNaseA发酵液，用NaOH+磷酸氢二钠液体调pH8.0，沉淀过夜。
离心，0.22微米过滤，澄清液体。
连续上样平衡好的Ni Sepharose 6 FF层析柱，冲洗10个柱体积。
用0.25M咪唑洗脱目的蛋白，按照流出图谱收集峰。
收集的洗脱峰，用截流分子量3.5KDa透析袋透析，去除咪唑和盐，透析外液为：10mM NaAc-HAc pH4.0。
透析好的样品，进行第二次离子交换柱层析。样品上样于10mM NaAc-HAcpH4.0平衡好的SP Sepharose Fast Flow层析柱，用0.45M NaCl+10mM NaAc-HAc pH4.0预洗脱，再用1M NaCl+10mM NaAc-HAc pH4.0梯度洗脱，收集各峰，15％的SDS-PAGE检测蛋白纯度。
SDS-PAGE上样顺序为：
RNaseA发酵诱导前；
RNaseA发酵诱导5天；
RNaseA Ni-sepharose，洗脱峰，如图8所示；
RNaseA SP-sepharose柱层析的流穿组分，如图9所示；
RNaseA SP-sepharose梯度洗脱峰1；
RNaseA SP-sepharose梯度洗脱峰2左；
RNaseA SP-sepharose梯度洗脱峰2右；
Thermo 26616#marker(130；110；100；75；55；40；35；25；15；10KDa)
结果显示：经过两步柱层析得到的终产物RNaseA纯度高于90％，如图10所示。图11为RNAseA产品纯化冻干后SDS-page检测图。
6 突变型RNase A活性的检测
原理：
RNA+H2O 突变型RNase A>Oligonucleotides；
采用方法：酵母RNA法；
25℃，300nm波长，纯水调零；
0.5毫克/毫升酵母RNA：2毫升(100mM Sodium Acetate，pH 5.0溶解)(Ribonucleic Acid，Type XI，Sigma-Aldrich Product Number R6750)；水：1.9毫升；待测酶液：0.1毫升，共4毫升，置于一个合适密闭管内，立即混匀，计时开始，放入紫外检测仪中，300nm读数。
300nm测定吸光度A随时间的变化，每隔30秒读一次A值，共读3分钟，得到一组对应于时间t(min)的At的数据。当样品管反应进行3h后，测定300nm的Af，以Af为最终的A，分别求得一组对应于t的lg(At-Af)，以lg(At-Af)对t作图，得到一条直线，求出直线的斜率为S，将S带入下列公式中，可求出酶的活力。
Kunitz units/mg＝S×(-2.3)×4/(样品管中含酶的量)；
酶活测定数值为66.9(Kunitz Units/mg蛋白)。
活性单位定义：
一个酶活力单位为在37℃，pH 8.0条件下在30min之内产出寡核苷酸相当于使260吸收变化1.0的量(反应体积2.625ml)。
化学合成突变型RNase A基因优化后的全长序列：
为提高重组蛋白在宿主细胞内的表达效率，可将野生型的核糖核酸酶A的的DNA编码序列替换为酵母细胞偏爱的密码子组成的DNA序列再进行化学合成。引入突变位点的编码全长核酸内切酶基因序列的合成。
本发明的表达载体是用于表达本发明的突变型RNase A的表达载体。根据本发明一个优选的实施方式，所述表达载体可具有如下的结构：控制所述DNA表达的启动子序列连接到编码本发明的重组核糖核酸酶A的DNA的上游。此外，还可以将终止子连接到所述DNA的下游。
作为酵母细胞中的表达载体，可使用pPICZ、pPICZα、pGAPZ、pGAPZα、pGAPZαA和pPIC9K中的任何类型。从拷贝数和稳定性的角度来看，优选pPIC9K。
根据本发明一个优选的实施方式，用于挑选重组体的选择标记基因或用于检测导入基因表达的报告基因也可插入本发明的表达载体中。选择标记基因的实例包括但不限于潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。报告基因的实例包括但不限于β-葡糖醛酸酶(GUS)基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、荧光素酶(LUC)基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因。
根据本发明另一个优选的实施方式，为了分泌表达本发明的重组突变型RNase A、或为了便于纯化所表达的酶，本发明的表达载体中可包含附加序列。在这种情况下，本发明的突变型RNase A以融合蛋白的形式表达。所述附加序列的实例包括但不限于编码信号肽或前肽的核苷酸序列；以及编码His标签或GST标签的核苷酸序列。正确插入目的基因的测序结果见图2。
本发明的转化细胞是导入表达载体的细胞，该细胞能生产本发明的突变型RNaseA。尽管该转化细胞可以是原核细胞或可以是真核细胞，优选为真核细胞酵母。
所述真核细胞的实例包括但不限于酵母细胞。根据本发明一个优选的实施方式，所述真核细胞为酵母细胞。根据本发明再一个优选的实施方式，所述酵母细胞为毕赤酵母(Pichia)细胞、假丝酵母(Candida)细胞、多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞、球拟酵母(Torulopsis)细胞、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)细胞和克鲁维酵母(Kluyveromyces)细胞。
所述酵母细胞为毕赤酵母细胞。由于目前对毕赤酵母的发酵条件有着更深入的研究，且所述毕赤酵母细胞在发酵制备中成本最低，能够满足技术需求和产品市场化的需求，因而毕赤酵母细胞被认为是突变型RNase A生产中最为优选的转化细胞。
可根据转化细胞的类型适当选择将表达载体导入转化细胞的方法。这些方法都是本领域技术人员已知的。
可通过以下方法获得毕赤酵母的转化体：采用电击转化的方法，将线性化表达载体转化到酵母感受态细胞中。
培养所述毕赤酵母转化体的方法的实例如下所述：
挑取酵母单菌落至YPD培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)中培养。离心收集菌体。用MM培养基(13.4g/L YNB，4×10-4g/L生物素，5mL/L甲醇)重悬菌体后振荡培养，开始诱导表达。每24小时向诱导表达的发酵液中补加终浓度为0.5％(v/v)的甲醇。酶分子氨基酸构成和制备工艺：野生型由124个氨基酸组成(SEQ ID1)；本发明采用了酿酒酵母的α因子为分泌信号肽而非核糖核酸酶A的信号肽，并在该核酸酶的C或N端加上六聚组氨酸标签，并以甘氨酸和丝氨酸为间隔。采用酵母优化表达密码子，合成了目的基因并在真核表达系统毕赤酵母细胞表达成功。突变型的核酸内切酶可以分泌到发酵液，经过离心分离、发酵液超滤、金属螯合层析和阳离子交换层析，最后制成液体酶和冻干粉酶制剂。
本发明的具体内容还包括编码上述核酸酶的DNA序列和载体的结合即表达载体序列以及用于表达该酶的宿主细胞即携带该基因的重组毕赤酵母菌株。
本发明解决了以下几个技术问题：
一、突变型核糖核酸酶A高效表达酵母菌株的构建：
需要解决的是克服大肠杆菌表达和纯化后酶的产率低、纯化困难的问题。从每升发酵液酶产量几毫克级水平，提升到几百毫克水平。关键技术是设计适合酵母表达的目的基因序列，添加分泌信号序列和筛选突变位点。基因克隆和细胞转化完成后高表达酵母克隆的筛选。具体技术包括化学方法合成目的基因，然后克隆到酵母表达质粒pPIC9K中，转化毕赤酵母细胞，得到转化子，从挑取的转化子克隆中得到突变型核酸内切酶表达量超过500毫克/升发酵液的菌株。
二、高密度培养发酵工艺和酶蛋白纯化、冻干工艺研究；
关键技术是挑选到的重组菌株在发酵罐中高密度培养、高效表达重组酶的发酵参数优化。首先在30升发酵罐水平进行工程菌株培养基配方、培养时间、溶氧、诱导时间和诱导剂用量等试验，找到适合工业生产放大的条件。然后需要解决高密度发酵菌体和发酵液分离、微滤澄清发酵液、超滤浓缩发酵液及发酵液脱色，以及随后的精细纯化技术选择。经过多次正交试验和层析介质、条件筛选得到可行纯化方案，最后摸索低温冷冻保护剂的组成和冻干曲线，获得酶活性合格的成品酶。
三、工业化放大过程技术研究和成品质量控制技术研究：
将30升发酵罐得到的技术方案，移植到5000升自动发酵罐生产线并修正各个发酵参数，适应3000-5000升工业化生产设备条件下重组酵母的高密度发酵要求，调整生产工艺使重组酶产量和酶活高于中试水平。产品下游处理工艺放大至4吨级发酵液处理水平，扩大相应的微滤、超滤、亲和柱层析和离子交换柱层析规模，制备出纯品液体核酸内切酶制剂和固体冻干粉型酶制剂。成品经过蛋白纯度、比活性、蛋白酶残留等质检指标检验，达到或超过国际同种产品的质量标准。
利用蛋白质工程技术创新酶蛋白分子结构和生产技术。由天然分子变成高效突变型分子，宿主细胞将酶蛋白表达水平提高100-500倍，从每升发酵液表达几毫克变成几百毫克。下游处理引入金属螯合层析技术，提高产品回收率和相应生产成本降低至十分之一以下。最终产品除了传统液体型，创新出冷冻干燥剂型，使之应用范围更广
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
SEQ No.1
RNase A (120 aa)

Claims (8)

1.一种突变型RNAseA，其特征在于：其DNA序列如SEQ No.1所示。
2.权利要求1所述一种突变型RNAseA在酵母细胞的表达方法，其特征在于所述方法如下：
1)克隆突变型RNase A的基因得到突变型RNase A重组质粒；
2)将步骤1)所述的突变型RNase A重组质粒转化到毕赤酵母得到GS115/pPIC9K-RNaseA的酵母单菌落；
3)突变型RNase A在酵母细胞中的表达及检测：
a)将步骤2)中得到的GS115/pPIC9K-RNaseA的酵母单菌落接种至10mL YPD培养基中，30℃，250rpm培养24h，1500g离心收集得到重悬菌体；
b)用10mL MM培养基培养步骤a)所述的基重悬菌体，随后在30℃，250rpm下摇瓶诱导表达；
c)向MM培养基中补加终浓度为0.5％(v/v)的甲醇，连续6天，共培养144小时，离心培养产物，从而得到含有上述突变型RNase A的培养基上清，进行SDS-PAGE检测和消化RNA活性检验。
3.根据权利要求2所述的一种突变型RNAseA在酵母细胞的表达方法，其特征在于步骤1)所述的克隆方法如下：
分别用限制性内切酶EcoRI、NotI将基因突变型RNaseA编码序列切下，与进行同样双酶切的pPIC9K载体连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，将基因突变型RNaseA的DNA片段亚克隆至酵母表达载体pPIC9K中，从而构建出基因突变型RNaseA的表达载体pPIC9K-RNaseA。
4.根据权利要求2所述的一种突变型RNAseA在酵母细胞的表达方法，其特征在于步骤2)所述转化到毕赤酵母的方法如下：
利用限制性内切酶Sal I酶切实步骤1)中所构建的重组质粒即pPIC9K-RNaseA，然后用TE缓冲液溶解至1μg/μL的浓度，取20μL溶解的重组质粒与GS115酵母感受态细胞混匀，转移至冰预冷的电转杯中，冰浴5min；采用电击转化的方法，利用电转化仪内置的毕赤酵母转化参数进行电击，将上述重组质粒转化到GS115酵母感受态细胞中。
5.根据权利要求4所述的一种突变型RNAseA在酵母细胞的表达方法，其特征在于所述TE缓冲液的pH值为8.0。
6.根据权利要求4所述的一种突变型RNAseA在酵母细胞的表达方法，其特征在于所述电转杯两极间隙为0.1cm。
7.权利要求2所述的一种突变型RNAseA在酵母细胞的表达方法中所述突变型RNase A的纯化方法，其特征在于所述纯化方法如下：
A)取500毫升RNaseA发酵液即培养基上清，用NaOH+磷酸氢二钠液体调pH8.0沉淀；
B)离心：将步骤A)所述沉淀后的RNaseA发酵液经过0.22微米过滤，得到澄清液体；
C)将步骤B)所述的澄清液体连续上样平衡好的Ni Sepharose 6 FF层析柱，冲洗10个柱体积；
D)用0.25M咪唑洗脱步骤C)所述Ni Sepharose 6 FF层析柱上的目的蛋白，按照流出图谱收集峰；
E)将收集的洗脱峰，用截流分子量3.5KDa透析袋透析得到透析好的样品蛋白，透析外液为：10mM NaAc-HAc pH4.0；
F)将透析好的样品蛋白，进行第二次离子交换柱层析得到纯化蛋白。
8.根据权利要求7所述的一种突变型RNAseA在酵母细胞的纯化方法，其特征在于步骤F)所述的样品蛋白上样于10mM NaAc-HAc pH4.0平衡好的SP Sepharose Fast Flow层析柱，用0.45M NaCl+10mM NaAc-HAc pH4.0预洗脱，再用1M NaCl+10mM NaAc-HAc pH4.0梯度洗脱，收集各峰。
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