CN103773793A - 一种高效表达人血清白蛋白的方法 - Google Patents
一种高效表达人血清白蛋白的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103773793A CN103773793A CN201210403248.3A CN201210403248A CN103773793A CN 103773793 A CN103773793 A CN 103773793A CN 201210403248 A CN201210403248 A CN 201210403248A CN 103773793 A CN103773793 A CN 103773793A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- serum albumin
- human serum
- sequence
- expression
- hsa
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种高效表达人血清白蛋白的方法。本发明人在综合考虑各种影响表达的因素后，优化了人血清白蛋白cDNA序列，采用菜豆凝集素信号肽编码序列和人血清白蛋白信号肽编码序列构建成的人血清白蛋白表达盒，表达人血清白蛋白。本发明的方法大幅度地提高了蛋白表达的效率。本发明的方法表达的蛋白接近天然，且操作简单、成本低廉。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及一种高效表达人血清白蛋白的方法。
背景技术
人血清白蛋白是血浆中的主要蛋白成分，由585个氨基酸组成，分子量为66kD。人血清白蛋白在血液中主要作用是维持正常渗透压，与钙离子、脂肪酸、氨基酸、胆红素和各种药物相结合，并起到转运载体的作用。临床上人血清白蛋白常用于外科手术、出血性休克、烫伤、肾病综合征导致的白蛋白缺乏症、肿瘤肝腹水等疾病的治疗。一直以来，人血清白蛋白是从人血液中纯化得到的。由于血源匮乏和病毒(肝炎、AIDS)污染等原因，基因重组人血清白蛋白在近十年中得到了国内外大型制药公司的重视。近年来，采用基因重组的方法，已经在酵母菌(USP5,330,901、JP11-509525、JP6-100592)、大肠杆菌(Lawn,R.M.Construction of DNA sequences and their use for microbial production ofproteins,in particular 2 0human serum albumin“European Patent Appl.”(1983)73,p646)、转基因牛奶(WO9602573A 1SEPARATION OF HUMAN SERUMALBUMIN)、转基因水稻(CN200510019084利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组人血清白蛋白)中表达人血清白蛋白。
尽管现有技术中已经在酵母等菌株中成功表达过人血清白蛋白，然而表达的效率以及表达的规模仍然不够理想。一般情况下，除了使用强启动子来提高目的蛋白的表达水平外，研究人员还经常使用一些其它方法，最常用的方法是提高插入到酵母基因组的目的蛋白表达盒拷贝数，此法可以提高表达量。但是这个策略也有局限，提高拷贝数不一定必然伴随着目的蛋白表达量的增高。即使有所增高，也不呈现着和表达盒的拷贝数成正相关的状况。蛋白表达量受很多因素的制约，有转录阶段的调控，翻译阶段的制约，以及翻译后的蛋白修饰等，因此特定的蛋白，需要找到合适的策略并结合大量的研究试验工作来优化表达。
综上，本领域还有必要进行进一步的研究，以提高人血清白蛋白的表达效率，使得人血清白蛋白真正实现高效地大规模工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效表达人血清白蛋白的方法。
在本发明的第一方面，提供一种重组表达人血清白蛋白的方法，所述方法包括：
(1)提供一重组表达载体，其包含5’→3’操作性连接的以下元件：启动子，菜豆凝集素信号肽编码序列，人血清白蛋白成熟肽编码序列(不含有天然情况下自带的信号肽编码序列)；
(2)将(1)的重组表达载体转化毕赤酵母，获得重组毕赤酵母细胞；和
(3)培养(2)的重组毕赤酵母细胞，从而表达人血清白蛋白。
在一个优选例中，所述的人血清白蛋白成熟肽编码序列的3’端，包括：翻译终止子序列。
在另一优选例中，所述的启动子是酵母表达启动子。
在另一优选例中，所述的菜豆凝集素信号肽编码序列如SEQ ID NO:5所示；或
所述的人血清白蛋白成熟肽编码序列是经密码子优化的序列，如SEQ IDNO:3中第73-1830位所示。
在另一优选例中，所述的菜豆凝集素信号肽编码序列与所述的人血清白蛋白成熟肽编码序列连接而成的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在另一优选例中，所述的启动子是AOX1启动子或GAP启动子。
在另一优选例中，所述的重组表达载体的骨架载体是：pHIL-D2表达载体；和/或
所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。
在另一优选例中，步骤(3)中，表达条件为：采用YPD培养基培养重组毕赤酵母，之后在添加甲醇的YP培养基中诱导培养；培养条件为30±2℃，200±50rpm。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(4)分离(纯化)所述的人血清白蛋白。
在另一优选例中，所述的重组表达载体中，所述的人血清白蛋白编码序列还连接一纯化标签的编码序列。
在另一优选例中，利用离子交换和/或分子筛进行人血清白蛋白的分离纯化。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示，所述的多核苷酸表达人血清白蛋白。
在本发明的另一方面，提供一种重组表达载体，其包含5’→3’操作性连接的以下元件：启动子，菜豆凝集素信号肽编码序列，人血清白蛋白编码序列。
在本发明的另一方面，提供一种重组酵母细胞，所述的重组酵母细胞中包括所述的重组表达载体。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、pHIL-D2-PHA-HSA(optimized)载体的结构示意图(右图)与pHIL-D2-PHA-HSA载体的结构示意图(左图)。
图2、pPIC9-HSA载体的结构示意图(左图)与pPIC9-HSA(optimized)载体的结构示意图(右图)。
图3、两种不同白蛋白表达克隆的5L发酵罐中的发酵结果。克隆在含甘油的培养基中生长27小时，然后流加甲醇，诱导的时间为72小时。含pHIL-D2-PHA-HSA(optimized)载体克隆表达的白蛋白明显高于含pPIC9-HSA载体或含pPIC9-HSA(optimized)载体的克隆所表达的白蛋白，也高于含pHIL-D2-PHA-HSA载体的克隆所表达的白蛋白。
具体实施方式
本发明人在综合考虑各种影响表达的因素后，优化了人血清白蛋白cDNA序列，采用菜豆凝集素(Phaseolus vulgaris agglutinin)信号肽编码序列和人血清白蛋白信号肽编码序列构建成的人血清白蛋白表达盒，表达人血清白蛋白。本发明的方法大幅度地提高了蛋白表达的效率。本发明的方法表达的蛋白接近天然，且操作简单、成本低廉。
术语
如本文所用，所述的“信号肽”是分泌蛋白新生肽链N端的一段氨基酸残基组成的肽段，其长度一般为15～30个氨基酸残基。信号肽将分泌蛋白引导进入内质网，同时这个肽段被切除。信号肽对分泌性重组蛋白的表达有很大影响，一个合适的信号肽可以使目的蛋白的表达量成倍提高。
如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(本发明中为颗粒溶解素或其活性片段)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括一下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。
如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
如本文所用，所述的“操作性相连”，“可操作地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的蛋白(本发明中为人血清白蛋白)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括一下元件：启动子、编码蛋白的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件时操作性相连的。
信号肽优化
在生物技术领域中，异源蛋白的重组表达是一个重要研究课题。为了提高重组蛋白的表达率，需大量时间和大量的实验室工作，经多次试验、再试验的努力才能达到最后的成功。有很多因素可以影响重组蛋白表达率。重组蛋白为分泌表达时，信号肽就是一个重大的影响因素。同样，重组蛋白本身的DNA序列也起了重要作用。
本发明人对人血清白蛋白的毕赤酵母表达进行了大量的研究，发现应用其自带的信号肽的表达效率不高。因此，本发明人收集了相当多的信号肽进行表达研究。目前常用的信号肽有酿酒酵母α交配因子(α-MF)和毕赤酵母酸性磷酸酶(PHO1)信号肽，其中前者在应用上更为广泛。尽管α-MF信号肽是一个强信号肽，重组蛋白在此信号肽的引导下可以获得高表达，但是有些蛋白用α-MF信号肽可见到部分重组蛋白的N-端带有9-11个α-MF信号肽氨基酸残基，这给纯化工艺造成很大的难题。且用α-MF信号肽会使得异源蛋白质的氨基末端有所延伸。
大量研究后，本发明人意外地发现，来源于菜豆凝集素的信号肽PHA能够大大地提高人血清白蛋白的表达效率，显著优于人血清白蛋白天然所带的信号肽；并且与PHA信号肽融合的人血清白蛋白，其氨基末端能被正确加工，未见信号肽中的任何氨基酸残基与目的蛋白的N-端相连。
本发明人首次用菜豆凝聚素信号肽取代通常使用的酵母α因子信号肽，同时应用密码子精细优化的人血清白蛋白cDNA序列来构建的表达人血清白蛋白的毕赤酵母表达载体，这种策略使得成熟的白蛋白表达的效率大幅度地提高。
密码子优化
重组蛋白的DNA序列有时可起到关键作用。影响因素包括整个基因DNA中的GC/AT比例；碱基AT富集区的大小和分布；翻译起始区域的二级结构；GC簇(GC cluster)或者是G簇(G cluster)的分布；酵母偏好密码子和稀有密码子的分布等。DNA序列中高GC比例或高AT比例可以使得目的基因的表达量降低，较佳的GC/AT比例应在50:50左右，这种比例可以提高重组蛋白的表达量；过多的AT富集区域可以明显地影响酵母的重组基因表达，酵母对于聚腺苷信号的专一性没有高级真核细胞那样特异，较长的AT序列就可被酵母识别为聚腺苷信号，使得目的基因的mRNA提前终止转录，得到的mRNA比正常的mRNA短，重组蛋白的C-端序列缺失；GC簇或者是G簇(G cluster)的富集，直接影响DNA的转录；翻译起始区域的二级结构的强度可影响核糖体翻译的效率；酵母稀有密码子的存在，目的蛋白的翻译速度被也使得目的蛋白的表达受到影响。
因此，在研究过程中，本发明人综合考虑毕赤酵母偏爱的密码子、AT:GC的比例设计、碱基AT富集区的大小和分布、GC簇(GC cluster)或者是G簇(Gcluster)的分布、mRNA二级结构优化、翻译起始区域的二级结构等因素的基础上，对天然人血清白蛋白cDNA序列进行了优化。
针对多种序列优化策略，本发明人一一进行了反复试验，最终确定了如SEQ ID NO:4所示的人血清白蛋白编码序列。这一序列并非仅遵循已经报导的毕赤酵母优选密码子设计，而是综合考虑了多种影响因素，以及综合了重组表达实验结果。
重组表达载体
本发明构建了由酵母偏好的启动子驱动的用菜豆凝集素的信号肽PHA引导的，用毕赤酵母偏好的密码子优化人血清白蛋白cDNA序列构建的人血清白蛋白表达盒，转染到酵母细胞中表达。
作为本发明的优选方式，所述的酵母偏好的启动子可以是AOX1启动子，也可以是GAP启动子或其它酵母偏好的启动子。用相应的启动子连接菜豆凝集素信号肽序列和用毕赤酵母偏好的密码子优化人血清白蛋白cDNA序列构建的人血清白蛋白表达盒。为了便于表达产物分泌胞外，所述的表达盒中还需带有本发明优选的信号肽序列。
作为本发明的优选方式，本发明所述的人血清白蛋白的表达盒中，从5’至3’依次包括：启动子序列，菜豆凝集素信号肽核苷酸编码序列，密码子优化后的人血清白蛋白成熟肽编码序列，翻译终止子序列，这些序列是操作性相连的。
重组表达的细胞
本发明用于重组表达人血清白蛋白的细胞是酵母细胞。多种酵母细胞都可用于本发明，所述的酵母例如毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)、假丝酵母(Candida)或球拟酵母(Torulopsis)等。
作为本发明的优选方式，所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。所述的外源基因表达框架包括启动子、外源基因克隆位点、信号肽、外源基因表达盒、终止序列、筛选标记等。表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；由于毕赤酵母可以以甲醇为唯一的碳源和能源，绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源，因此在发酵过程中可以减少杂菌的污染，而且大规模工业发酵技术相对比较成熟。包括培养基、发酵方法等已经经过详尽研究，使得发酵的重现性和自动化程度都极为良好。更优选地，所述的毕赤酵母是GS115株。
作为本发明的一个优选实施方式，提供了一种人血清白蛋白(HSA)在毕赤氏酵母(Pichia)中的重组表达方法。本发明的方法特征在于重组表达质粒pHIL-D2-PHA-HSA(optimized)的构建，本发明特征一表现为在宿主细胞内转染由酵母强启动子驱动的用毕赤酵母偏好的密码子优化人血清白蛋白成熟肽cDNA序列构建的HSA。本发明特征二表现为用毕赤酵母偏好的密码子优化人血清白蛋白成熟肽cDNA序列构建HSA的N端前面为菜豆凝集素信号肽序列。具体操作是宿主细胞用GS115pHIL-D2-PHA-HSA(optimized)载体转录，以不含组氨酸的培养基进行筛选，在此基础上进一步用测定白蛋白表达量的方法选择高表达克隆。经50次传代确认稳定高表达后选择其中表达量最高的一株作为工程细胞株。为了比较菜豆凝集素信号肽和酵母α因子信号肽对白蛋白表达的影响，也为了比较天然人血清白蛋白成熟肽cDNA和毕赤酵母偏好的密码子优化人血清白蛋白成熟肽cDNA序列对白蛋白表达的影响，本专利还构建了pHIL-D2-PHA-HSA和pPIC9-HSA(optimized)两个白蛋白表达载体，分别转录GS115宿主细胞，以不含组氨酸的培养基进行筛选，在此基础上进一步用测定白蛋白表达量的方法选择高表达克隆，这些高表达克隆也需经50次传代，确认稳定高表达后选择其中表达量最高的一株来进行比较。
细胞培养和蛋白分离纯化
本发明的方法中，对于培养毕赤酵母的方法和培养基没有特别的限制，可以采用本领域常规使用的方法和培养基。在培养重组细胞分泌表达出人血清白蛋白后，还可包括步骤：从培养产物(培养基或发酵液)中分离白蛋白。从培养产物中分离或纯化白蛋白可采用本领域技术人员熟知的技术。例如可采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose离子交换、凝胶过滤法纯化、分子筛、或采用亲和层析法纯化。
本发明的主要优点在于表达量高：采用本发明构建的重组表达系统进行表达，可获得非常高的血清白蛋白表达量；表达的蛋白接近天然：采用本发明的方法表达、纯化的重组人血清白蛋白在分子量测定、N-端15个氨基酸序列、C-末端2个氨基酸序列、肽图、CD等实验中均与天然的人血清白蛋白没有区别；本发明另外一个优点是操作、培养简单：采用本发明的构建的表达系统和方法，在简单合成培养基中可实现高密度培养，操作简单、能有大规模发酵设备进行表达，生产成本低廉。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料及其来源
K1enow片段多聚酶和所有使用的内切酶均为NEB公司产品。pPIC9、pGAPZα、毕赤酵母(Pichia pastoris)GSl15株为Invitrogen公司产品。Trizol RNA抽提试剂盒购自Promega公司，YNB(W/O amino acid)购自Sigma公司。
实施例方法简述
根据酵母偏爱的密码子和cDNA序列的GC/AT比例；碱基AT富集区的大小和分布；翻译起始区域的二级结构；GC簇(GC cluster)或者是G簇(G cluster)的分布等因素综合考虑后设计一条DNA序列，此序列的5’端有一个EcoRI酶切位点，紧接着为菜豆凝集素信号肽序列，然后为白蛋白成熟肽序列最后为终止密码子EcoRI酶切位点。人工合成此序列，该DNA插入到PUC18载体中，定名为PUC 18-PHA-HSA(optimized)。将PUC 18-PHA-HSA(optimized)克隆载体中插入的PHA-HSA(optimized)片段用EcoRI酶切下，1%琼脂糖电泳分离，回收DNA片段。将约1.8Kb的PHA-HSA(optimized)基因回收片段与用EcoRI酶切并经碱性磷酸酶处理过的Phil-D2载体连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，以含有Ampicillin LB琼脂板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA。用5’-AOX1primer和优化后白蛋白cDNA内部的一个引物作为一对引物，与所得到的重组载体进行PCR反应，PCR反应产物用1%琼脂糖电泳分离，如PCR产物为700bp DNA片段的，则表明PHA-HSA(optimized)插入的方向正确。插入正确的重组载体分别用5’AOXl primer和3’AOXl primer进行测序，确认插入的PHA-HSA(optimized)的序列完全正确，此载体用于转录毕赤酵母GS115细胞。
pHIL-D2-PHA-HSA载体的构建为PHA信号肽序列与天然白蛋白成熟肽序列(SEQ ID NO:2)的5’端连接后插入到pHIL-D2的EcoRI位点。pPIC9-HSA(optimized)载体的构建为HSA(optimized)成熟肽序列插入到pPIC9的XhoI和EcoRI位点。
实施例1、含有人血清白蛋白编码序列的载体构建
人血清白蛋白cDNA的序列如SEQ ID NO:1(编码SEQ ID NO:2的蛋白)。用人工合成方法合成。
合成的cDNA在5’端加上了部分酵母α信号肽3’端的编码序列CTCGAG AAG AGA(SEQ ID NO:7)(引入XhOI酶切位点)，3’端添加了翻译终止信号TAA和EcoRI酶切位点的序列GAATTC，该DNA插入到PUC18载体(购自New England Biolabs)的EcoRI酶切位点中，定名为PUC18-HSA。
实施例2、人血清白蛋白优化序列构建
在综合考虑毕赤酵母偏爱的密码子、AT:GC的比例设计、碱基AT富集区的大小和分布、GC簇(GC cluster)或者是G簇(G cluster)的分布、mRNA二级结构优化、翻译起始区域的二级结构等因素的基础上，本发明人对天然白蛋白cDNA序列(SEQ ID NO:1)进行优化，优化后的白蛋白成熟肽cDNA序列为(SEQ ID NO:3)，其中第1-24位为信号肽编码序列。
菜豆凝集素信号肽序列来自EMBLX02408所公布的序列(SEQ ID NO:6)。人工合成PHA-HSA(optimized)DNA序列(SEQ ID NO:5)，其顺序为EcoRI酶切位点序列紧接着为PHA信号肽序列(SEQ ID NO:4)其后为序列优化后的白蛋白成熟肽序列随后为终止子序列，最后为EcoRI酶切位点序列。
将两端带有EcoRI酶切位点的SEQ ID NO:4插入到PUC18载体(购自NewEngland Biolabs)中，构建成PUC18-PHA-HSA(optimized)载体。
实施例3、菜豆凝集素信号肽-天然白蛋白cDNA序列的构建
合成引物SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
以PUC 18-HSA作为模板，以引物SEQ ID NO:8和引物SEQ ID NO:10进行PCR扩增；获得PCR产物提纯后再作为模板，再以引物SEQ ID NO:9和引物SEQ ID NO:10进行PCR反应，获得的PCR产物插入到PUC18的EcoRI位点中，构建成PUC18-PHA-HSA载体(引物SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9中含有PHA的序列，经过两次PCR反应，PHA序列就可以加在天然的白蛋白成熟肽序列的5‘端)。此载体进行插入片段PHA-HSA全长DNA测序，测序结果证明所有序列完全正确，PCR反应没有引入任何突变。
实施例4、毕赤酵母表达载体的构建
(1)pHIL-D2-PHA-HSA(optimized)表达载体构建
pHIL-D2载体(购自Invitrogen)用EcoRI酶切，获得的线性DNA片段用碱性磷酸酶处理脱去5’-端磷酸基团；PUC18-PHA-HSA(optimized)载体用EcoRI酶切，1%琼脂糖电泳获得1.7kb片段；将1.7kb片段与EcoRI酶切、经碱性磷酸酶处理脱去5’-端磷酸基团的pHIL-D2线性化DNA相连，转染E.coli DH5α细胞，用含Ampicillin的LB板筛选，挑取生长的克隆，直接与5’-AOX1primer(SEQ ID NO:11)和优化后白蛋白cDNA内部的一个引物(SEQ ID NO:12)进行PCR反应。如PCR反应产物为700bp左右时，则证明PHA-HSA(optimized)已插入到pHIL-D2载体中，而且PHA-HSA(optimized)的插入方向正确。挑选此克隆，扩增获得10微克以上pHIL-D2-PHA-HSA(optimized)质粒DNA备用。该表达载体的图谱如图1右图。
(2)pHIL-D2-PHA-HSA酵母表达载体构建
将PUC18-PHA-HSA质粒用E.coRI酶切，用1%琼脂糖电泳，分离1.7kb片段，将此片段与经碱性磷酸酶处理脱去5’-端磷酸基团的pHIL-D2线性化DNA相连，转染E.coli DH5α细胞，用含Ampicillin的LB板筛选，挑取生长的克隆，直接与5’-AOX1primer(SEQ ID NO.13)和白蛋白cDNA内部的一个引物(SEQ ID NO:14)构成的引物对进行PCR反应，如PCR反应产物为700bp左右时，则证明PHA-HSA已插入到pHIL-D2载体中，而且PHA-HSA的插入方向正确。挑选此克隆用于酵母转录。该表达载体的图谱如图1左图。
(3)pPIC9-HSA(optimized)载体构建
pPIC9(购自Invitrogen)用XhoI和EcoRI酶切，酶切产物用1%琼脂糖电泳分离，回收DNA片段；合成引物SEQ ID NO:15；将此引物和3’AOX1引物(SEQID NO:16)组成引物对，以pHIL-D2-PHA-HSA(optimized)为模板，进行PCR反应，获得的DNA直接和XhoI和EcoRI酶切后的线性pPIC9DNA连接，转染E.coli DH5α感受态细胞，用含有Ampicillin的LB板筛选。挑选阳性克隆，用5’AOX1引物(SEQ ID NO.11)和3’AOX1引物(SEQ ID NO.16)为引物对，以阳性克隆为模板，进行PCR反应，产物为2kb的克隆为插入正确的克隆，此克隆进行插入DNA的全长序列测定，DNA序列测定证明无PCR反应引入的突变，含完全正确的阅读框。此克隆作为酵母转录用。该表达载体的图谱如图2右图。
(4)pPIC9-HSA载体构建
pPIC9用XhoI和EcoRI酶切，酶切产物用1%琼脂糖电泳分离，回收DNA片段；将引物SEQ ID NO:15和3’AOX1引物(SEQ ID NO.16)组成引物对，以pHIL-D2-PHA-HSA为模板，进行PCR反应，获得的DNA直接和XhoI和EcoRI酶切后的线性DNA连接，转染E.coli DH5α感受态细胞，用含有Ampicillin的LB板筛选。挑选阳性克隆，用5’AOX1引物和3’AOX1引物为引物对，以阳性克隆为模板，进行PCR反应，产物为2kb的克隆为插入正确的克隆，此克隆进行插入DNA的全长序列测定，DNA序列测定证明无PCR反应引入的突变，含完全正确的阅读框。此克隆作为酵母转录用。该表达载体的图谱如图2左图。
实施例5、HSA在巴斯德毕赤酵母中的表达
(1)pHIL-D2-PHA-HSA(optimized)载体转染巴斯德毕赤酵母
取一个含pHIL-D2-PHA-HSA(optimized)载体的大肠杆菌克隆，在含Ampicillin的LB培养基中生长过夜。第二天，离心收集菌体，采用碱裂解法制备质粒DNA。取抽提纯化的pHIL-D2-PHA-HSA(optimized)载体DNA 20微克，用SalI酶切使之线性化。线性化后的DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、沉淀DNA在室温中干燥去除乙醇后溶于20微升纯水中。
毕赤酵母GS115细胞株(购自Invitrogen)在5毫升YPD中于30℃、200rpm生长过夜，取其中0.5毫升加到500毫升新鲜YPD培养基中生长过夜，直至培养液的OD600在1.3-1.5之间，离心去上清。细胞重悬于500毫升无菌冰纯水，混合物离心去上清。沉淀加250毫升无菌冰纯水重悬后再离心去上清，沉淀重悬于20毫升冰的1M 山梨糖醇(sorbitol)，混合物离心去上清，最后细胞重悬于1毫升冰的1M 山梨糖醇置冰浴备用。取10微升线性化DNA(10微克)和80微升重悬GS115细胞置于0.2cm电击杯中，混匀后将电击杯在冰浴中放置5分钟后电击将DNA转染入GS 115细胞内。电击后立即加1毫升冰的1Msorbitol，然后转移到1.5毫升无菌管，30℃静止培养1-2小时，分别取100微升、200微升酵母细胞液均匀涂布到RDB(无组氨酸)平板，置30℃培养直至克隆生长。选择200个克隆分别接种到5毫升YPD培养基，30℃，200rpm生长2天，离心弃去上清，加5毫升YPM培养基(甲醇浓度为0.5%)30℃，200rpm诱导，每隔24小时补加培养体积为0.5%的甲醇，补加2次，第二次补加24小时后，离心取10微升培养上清用SDS-PAGE检测白蛋白的表达。选择表达量最高的1株克隆为pHIL-D2-PHA-HSA(optimized)阳性克隆。
(2)pHIL-D2-PHA-HSA载体转染巴斯德毕赤酵母
取一个含pHIL-D2-PHA-HSA载体的大肠杆菌克隆，在含Ampicillin的LB培养基中生长过夜。第二天，离心收集菌体，采用碱裂解法制备质粒DNA。取抽提纯化的pHIL-D2-PHA-HSA载体DNA 20微克，用SalI酶切使之线性化。线性化后的DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、沉淀DNA在室温中干燥去除乙醇后溶于20微升纯水中。
毕赤酵母GS115细胞株(购自Invitrogen)在5毫升YPD中于30℃、200rpm生长过夜，取其中0.5毫升加到500毫升新鲜YPD培养基中生长过夜，直至培养液的OD600在1.3-1.5之间，离心去上清。细胞重悬于500毫升无菌冰纯水，混合物离心去上清。沉淀加250毫升无菌冰纯水重悬后再离心去上清，沉淀重悬于20毫升冰的1M 山梨糖醇(sorbitol)，混合物离心去上清，最后细胞重悬于1毫升冰的1M 山梨糖醇置冰浴备用。取10微升线性化DNA(10微克)和80微升重悬GS115细胞置于0.2cm电击杯中，混匀后将电击杯在冰浴中放置5分钟后电击将DNA转染入GS 115细胞内。电击后立即加1毫升冰的1Msorbitol，然后转移到1.5毫升无菌管，30℃静止培养1-2小时，分别取100微升、200微升酵母细胞液均匀涂布到RDB(无组氨酸)平板，置30℃培养直至克隆生长。选择200个克隆分别接种到5毫升YPD培养基，30℃，200rpm生长2天，离心弃去上清，加5毫升YPM培养基(甲醇浓度为0.5%)30℃，200rpm诱导，每隔24小时补加培养体积为0.5%的甲醇，补加2次，第二次补加24小时后，离心取10微升培养上清用SDS-PAGE检测白蛋白的表达。选择表达量最高的1株克隆为pHIL-D2-PHA-HSA阳性克隆。
(3)pPIC9-HSA(optimized)载体转染GS115细胞
取一个含pPIC9-HSA(optimized)载体的大肠杆菌克隆，在含Ampicillin的LB培养基中生长过夜。第二天，离心收集菌体，采用碱裂解法制备质粒DNA。取抽提纯化的pPIC9-HSA(optimized)载体DNA 20微克，用SalI酶切使之线性化。线性化后的DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、沉淀在空气中干燥除去乙醇后溶于20微升纯水中，-20℃保存备用。
毕赤酵母GS 115克隆在5毫升YPD中生长过夜，取其中0.5毫升加到500毫升新鲜YPD培养基中生长过夜，直至培养液的OD600在1.3-1.5之间，离心去上清。细胞重悬于500毫升无菌冰纯水，混合物离心去上清。沉淀加250毫升无菌冰纯水重悬后再离心去上清，沉淀重悬于20毫升冰1M sorbitol，混合物离心去上清，最后细胞重悬于1毫升冰1M sorbitol，置冰浴备用。取10微升线性化DNA(10微克)和80微升重悬GS115细胞置于0.2cm电击杯中，混匀后将电击杯在冰浴中放置5分钟后电击将DNA转染入GS 115细胞内。电击后立即加1毫升冰1M sorbitol，然后转移到15毫升无菌管，30℃静止培养1-2小时，200微升酵母细胞液均匀涂布到RDB(无组氨酸)平板，置30℃培养直至克隆生长。选择200个克隆分别接种到5毫升YPD培养基，30℃，200rpm生长2天，离心弃去上清，加5毫升YPM培养基(甲醇浓度为0.5%)30℃，200rpm诱导，每隔24小时补加培养体积为0.5%的甲醇，补加2次，第二次补加24小时后，离心取10微升培养上清用SDS-PAGE检测白蛋白的表达。选择表达量最高的1株克隆为pPIC9-HSA(optimized)阳性克隆。
实施例6、高表达克隆的比较
(1)DNA水平上的确认
为了进一步确认重组克隆的基因组内插入了目的蛋白表达盒，提取上述实施例5中(1)获得的pHIL-D2-PHA-HSA(optimized)克隆株(选择5株)的基因组DNA，同时也提取了上述实施例5中(2)和(3)获得的各1株最高表达细胞株的基因组DNA，以及GS115的基因组DNA。这8株细胞的基因组DNA作为模板，分别用5’AOX1primer/3’AOX1 primer引物对(SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.16)进行PCR。PCR结果显示除GS115细胞株外，其它7株用5’AOX1primer/3’AOX1primer引物对均能获得插入的目的基因信号，而且信号强度相同。
(2)蛋白表达水平上的确认
为了验证PHA-HSA(optimized)要比PHA-HSA、α-信号肽-HSA(optimized)转染时的目的蛋白的表达量高。设计了几组实验。
第一组：
9个克隆(包括GS115、实施例3中(1)获得的pHIL-D2-PHA-HSA(optimized)克隆株(选择5株)、pPIC9-HSA阳性克隆、pPIC9-HSA(optimized)阳性克隆和pHIL-D2-PHA-HSA克隆对照株)在30℃，200rpm条件下，5毫升YPD培养基中生长2天，离心取沉淀，加含0.5%(v/v)甲醇的YP培养基，使各株的细胞密度相同，体积均为5毫升，仍置于30℃，200rpm条件下培养，每隔24小时补加0.5%(v/v)甲醇，共补加2次，第3天末，取上清检测白蛋白的含量。
这个实验的结果，GS115没有目的蛋白的表达，pPIC9-HSA阳性克隆株的表达量为107毫克/升，pPIC9-HSA(optimized)克隆株的表达量为152毫克/升、pHIL-D2-PHA-HSA克隆株表达量为185毫克/升、5株工程细胞候选株的表达量在250-280毫克/升之间，明显高于pPIC9-HSA、pPIC9-HSA(optimized)、pHIL-D2-PHA-HSA等对照克隆株。
第二组：
实施例3中(1)获得的pHIL-D2-PHA-HSA(optimized)克隆株、pPIC9-HSA、pPIC9-HSA(optimized)、pHIL-D2-PHA-HSA克隆株进行5升发酵罐培养。发酵条件按照Invitrogen的Pichia Fermentation Process Guidelines所述，甘油生长期约27小时，待甘油消耗殆尽，启动甲醇诱导，共诱导72小时。
诱导结束后检测各克隆的表达量，结果如图3所示，pPIC9-HSA、pPIC9-HSA(optimized(图中简写为opt))、pHIL-D2-PHA-HSA克隆株的白蛋白表达量分别为2.1克/升、3.3克/升、3.9克/升，pHIL-D2-PHA-HSA(optimized)(图中简写为pHIL-D2-HSA(opt))克隆株的表达量为5.2克/升，高于对照克隆。
实施例7、工程细胞株表达的白蛋白确认
为了在蛋白分子结构水平上确认与天然的人血白蛋白一致。一株pHIL-D2-PHA-HSA(optimized)克隆株(克隆1)在200毫升YPD培养基中生长2天，然后添加200毫升含2%(v/v)甲醇的YP培养基继续生长3天，培养条件为30℃，200rpm。培养结束后离心，收集培养上清。上清液用醋酸调pH至3.5，过pH 3.5，20mM醋酸钠缓冲液平衡过的SP-Sepharose FF离子交换柱，目的蛋白用pH 7.0，含500mM氯化钠，20mM磷酸钠缓冲液洗脱。洗脱蛋白过用pH 7.0，含50mM氯化钠，20mM磷酸钠缓冲液平衡的Sephadex G-25凝胶柱，进行缓冲液交换。交换了缓冲液后的SP-Sepharose FF洗脱蛋白过pH 7.0，含50mM氯化钠，20mM磷酸钠缓冲液平衡过的DEAE-Sepharose FF层析柱，白蛋白为pH 7.0，含500mM氯化钠，20mM磷酸钠缓冲液洗脱下来的组分。DSD-PAGE显示其纯度大于98%。
纯化的重组白蛋白用TRYPSIN消化后用C18柱进行肽图分析，结果与人血清白蛋白的TRYPSIN酶切肽图完全一致。N-端15个氨基酸序列测定结果为Asp-Ala-His-Lys-Ser-Glu-Val-Ala-His-Arg-Phe-Lys-Asp-Leu-Gly (SEQ ID NO:17)，C-末端两氨基酸的序列测定结果为Gly-Leu，与人血清白蛋白的C-末端两个氨基酸相同。纯化的重组白蛋白还进行了园二色谱检测，检测的结果与人血清白蛋白一致。
上述实验确认本发明的方法可以高效正确地表达人血白蛋白。
实施例8、工程细胞株的发酵罐发酵工艺研究
将一株pHIL-D2-PHA-HSA(optimized)克隆株(克隆1)接种到YPD平板生长2天，挑取单克隆接种到装有400毫升YPD培养基的摇瓶中，30℃250-300rpm条件下生长16-24个小时直到OD600在2-6之间。
发酵罐内加含4%(v/v)甘油的基础盐培养液8升，加热高压灭菌。设置发酵温度30℃、pH控制5.6、转速200-1500rpm、通气条件为0.1-1.0ppm空气，用28%(w/v)氢氧化铵调节基础培养盐培养液pH到5.6，每升培养液加4.35mlPTM1痕量盐。待发酵罐内基础盐培养液的温度降至30℃后，将400毫升来自摇瓶中培养的OD600在2-6之间的种子液加入发酵罐。启动发酵罐温度、pH、通气和搅拌等装置使酵母细胞生长，继续细胞生长直到甘油消耗完毕。一旦所有的甘油都消耗完毕，启动甘油流加步骤来增加细胞的量，甘油补料中甘油的浓度为50%(v/v)，每升甘油补料内需含有12毫升PTM1痕量盐溶液，设置补料速度为18.15 ml/hr/liter(起始体积)，甘油流加持续4小时。甘油流加结束后开始流加甲醇，流加的甲醇补料含100%甲醇，每升甲醇添加12毫升PTM1痕量盐。设置流加速度为3ml/hr每升起始发酵体积。4小时后甲醇流加速度增加至6ml/hr每升发酵体积，以此速度补加2小时后甲醇补加速度调整至9ml/hr每升起始发酵体积，此补料速度一直维持到发酵结束，整个甲醇流加时间为60小时。
发酵结束后，放罐收集发酵液，发酵液通过陶瓷过滤膜过滤方法分离发酵上清，含重组白蛋白的发酵上清用离子交换，分子筛等方法进行进一步处理。结果显示，重组白蛋白的产量为7.5克/升。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种重组表达人血清白蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供一重组表达载体，其包含5’→3’操作性连接的以下元件：启动子，菜豆凝集素信号肽编码序列，人血清白蛋白成熟肽编码序列；
(2)将(1)的重组表达载体转化毕赤酵母，获得重组毕赤酵母细胞；和
(3)培养(2)的重组毕赤酵母细胞，从而表达人血清白蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的菜豆凝集素信号肽编码序列如SEQ ID NO:5所示；或
所述的人血清白蛋白成熟肽编码序列是经密码子优化的序列，如SEQ IDNO:3中第73-1830位所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的菜豆凝集素信号肽编码序列与所述的人血清白蛋白成熟肽编码序列连接而成的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的启动子是AOX1启动子或GAP启动子。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组表达载体的骨架载体是：pHIL-D2表达载体；和/或
所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，表达条件为：采用YPD培养基培养重组毕赤酵母，之后在添加甲醇的YP培养基中诱导培养；培养条件为30±2℃，200±50rpm。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：
(4)分离所述的人血清白蛋白。
8.一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述的多核苷酸表达人血清白蛋白。
9.一种重组表达载体，其包含5’→3’操作性连接的以下元件：启动子，菜豆凝集素信号肽编码序列，人血清白蛋白编码序列。
10.一种重组酵母细胞，其特征在于，所述的重组酵母细胞中包括权利要求9所述的重组表达载体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210403248.3A CN103773793B (zh) | 2012-10-19 | 2012-10-19 | 一种高效表达人血清白蛋白的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210403248.3A CN103773793B (zh) | 2012-10-19 | 2012-10-19 | 一种高效表达人血清白蛋白的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103773793A true CN103773793A (zh) | 2014-05-07 |
| CN103773793B CN103773793B (zh) | 2018-02-13 |
Family
ID=50566558
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210403248.3A Active CN103773793B (zh) | 2012-10-19 | 2012-10-19 | 一种高效表达人血清白蛋白的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103773793B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110819653A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-02-21 | 上海赛伦生物技术股份有限公司 | 一种重组马血清白蛋白及其制备方法和应用 |
| WO2024045153A1 (zh) * | 2022-09-02 | 2024-03-07 | 通化安睿特生物制药股份有限公司 | 一种提高重组人白蛋白表达量的方法和细胞和蛋白 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0773296A1 (en) * | 1995-02-03 | 1997-05-14 | Asahi Glass Company Ltd. | Secretory signal gene and expression vector having the same |
| WO2004050695A2 (en) * | 2002-12-05 | 2004-06-17 | Novozymes A/S | Expression of polypeptides in filamentous fungi |
| CN101974587A (zh) * | 2010-11-19 | 2011-02-16 | 上海安睿特生物医药科技有限公司 | 一种高效表达人血清白蛋白的方法 |
| CN102190722A (zh) * | 2010-03-16 | 2011-09-21 | 上海安睿特生物医药科技有限公司 | 一种纯化重组人血白蛋白的方法 |
-
2012
- 2012-10-19 CN CN201210403248.3A patent/CN103773793B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0773296A1 (en) * | 1995-02-03 | 1997-05-14 | Asahi Glass Company Ltd. | Secretory signal gene and expression vector having the same |
| WO2004050695A2 (en) * | 2002-12-05 | 2004-06-17 | Novozymes A/S | Expression of polypeptides in filamentous fungi |
| CN102190722A (zh) * | 2010-03-16 | 2011-09-21 | 上海安睿特生物医药科技有限公司 | 一种纯化重组人血白蛋白的方法 |
| CN101974587A (zh) * | 2010-11-19 | 2011-02-16 | 上海安睿特生物医药科技有限公司 | 一种高效表达人血清白蛋白的方法 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| GEOFF P LIN CEREGHINO等: "Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris", 《CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY》 * |
| HYUN AH KANG等: "Development of Expression Systems for Production of Recombinant Human Serum Albumin Using the MOX Promoter in Hansenula polymorpha DL-1", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 * |
| MINCHIOTTI, L.等: "Homo sapiens albumin (ALB) mRNA", 《GENBANK》 * |
| ROMAAN J. M. RAEMAEKERS等: "Functional phytohemagglutinin (PHA) and Galanthus nivalis agglutinin (GNA) expressed in Pichia pastoris", 《EUR. J. BIOCHEM.》 * |
| 余占桥等: "毕赤酵母优化表达外源蛋白策略", 《微生物学通报》 * |
| 孙战胜: "重组人血清白蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 * |
| 郭美锦等: "重组人血清白蛋白表达研究进展", 《生物工程进展》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110819653A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-02-21 | 上海赛伦生物技术股份有限公司 | 一种重组马血清白蛋白及其制备方法和应用 |
| WO2024045153A1 (zh) * | 2022-09-02 | 2024-03-07 | 通化安睿特生物制药股份有限公司 | 一种提高重组人白蛋白表达量的方法和细胞和蛋白 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103773793B (zh) | 2018-02-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101974587A (zh) | 一种高效表达人血清白蛋白的方法 | |
| CN87100465A (zh) | 在酵母中生产乙型肝炎病毒蛋白质的方法 | |
| EP2128262A1 (en) | Improved yeast strains for organic acid production | |
| CN1210145A (zh) | 表皮生长因子工程菌及使用该菌制备表皮生长因子的方法 | |
| CN102482675A (zh) | 新型脂酶原-牛胰蛋白酶原融合蛋白 | |
| CN100529085C (zh) | 重组人纤溶酶原Kringle 5(hk5)生产方法 | |
| CN104278017A (zh) | 一种重组表达人溶菌酶的方法 | |
| CN112359035A (zh) | 一种蛋白酶k多拷贝菌种构建方法 | |
| CN113136349B (zh) | 一种高效表达不同来源肌红蛋白/血红蛋白毕赤酵母重组菌株的构建 | |
| CN101665798B (zh) | 一种制备重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的方法 | |
| CN104232611A (zh) | 一种重组布氏白僵菌蛋白酶k及其工业化生产与纯化方法 | |
| CN107778365B (zh) | 一种多点整合的重组蛋白表达方法 | |
| CN102559730B (zh) | 一种提高cp4-epsps在汉逊酵母中表达量的方法 | |
| CN103773793A (zh) | 一种高效表达人血清白蛋白的方法 | |
| CN102776215B (zh) | 优化的乳糖酶基因及其分泌表达方法和应用 | |
| CN103275942B (zh) | 一种葡萄糖氧化酶godj4a及其基因和应用 | |
| CN102181413B (zh) | 一种α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用 | |
| US5866371A (en) | Process for using the yeast ADH II promoter system for the production of heterologous proteins in high yields | |
| CN1958797B (zh) | 南极假丝酵母脂肪酶的制备方法 | |
| CN114196688A (zh) | 在酵母中表达原核碱性磷酸酶 | |
| CN102533841B (zh) | 一种提高Bt杀虫蛋白在汉逊酵母中表达量的方法 | |
| CN115725634A (zh) | 一种豆血红蛋白的表达盒、含其的表达载体、基因工程菌及其应用 | |
| EP0339567A1 (en) | Expression of Hepatitis B PreS 2 Protein in Methylotrophic Yeasts | |
| CN110527690A (zh) | 一种耐热型单宁酶及其应用 | |
| CN101285045B (zh) | 一种重组克鲁维酵母菌及其构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201104 Address after: No.2177 Tuanjie Road, kuaidamao Town, Tonghua County, Tonghua City, Jilin Province Patentee after: Tonghua anruite biopharmaceutical Co.,Ltd. Address before: 201203, A, block 2, building 8, building 200, Newton Road, Zhangjiang hi tech park, Shanghai, Pudong New Area, -03 Patentee before: SHANGHAI ANRUITE BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. |