CN101285045A - 一种重组克鲁维酵母菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组克鲁维酵母菌及其构建方法和应用。本发明是将乳酸克鲁维酵母菌中的α－1，6－甘露糖转移酶基因和/或α－1，3－甘露糖转移酶基因灭活得到乳酸克鲁维酵母菌株。本发明首先构建重组载体，然后将重组载体导入克鲁维酵母菌中获得突变菌。本发明构建的重组克鲁维酵母菌有两个特别明显的优点：一是所敲除的酵母菌甘露糖转移酶基因的编码区80％以上缺失，不易产生回复突变，突变株稳定性明显高。二是本发明构建的重组克鲁维酵母菌表达的糖蛋白不存在过度糖基化现象。本发明的构建重组克鲁维酵母菌的方法，能成功高效的重组克鲁维酵母，从8个克隆中即可得到4个阳性克隆，阳性率约50％。

Description

一种重组克鲁维酵母菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种重组克鲁维酵母菌及其构建方法和应用。

背景技术

克鲁维酵母是单细胞低等真核生物，它既具有原核生物易于培养、培养成本低廉、繁殖快、便于大规模培养和高密度发酵等特性，同时又具有真核生物的糖链加工系统，还能将外源蛋白分泌到培养液中，利于纯化。克鲁维酵母广泛用于生产商业、食品或者医疗上的重要异源蛋白质的历史已经超过了50年。目前为止，该酵母用于生产来自不同物种的蛋白质也超过了50种。此外，克鲁维酵母生产异源蛋白时的培养基简单，不需要像甲醇型酵母(如：Pichia pastoris)添加甲醇，工业生产更安全，而且易于规模工业化。其中，乳酸克鲁维酵母被认为是一种安全，易于操作，基因组序列清楚，并且能高效表达异源蛋白的一类极具吸引力的酵母菌宿主。乳酸克鲁维酵母工业生产重组牛凝乳酶的时间超过了50年，规模已经达到100m³(Bart W.Swinkels et al.The yeast Kluyveromyceslactis as an efficient host for heterologous gene expression.Antonievan Leeuwenhoek，64(2)：187-201，1993)。

克鲁维酵母属于低等真核生物，可进行很多典型的高等真核生物的蛋白翻译后修饰，包括对表达蛋白进行N-糖基化修饰。克鲁维酵母细胞生产重组蛋白药物已日益受到人们的青睐，它具有像原核细胞系统生长快，便于基因操作和可大规模培养等优点，同时又具有真核细胞翻译后加工、能产生糖蛋白和具有生物活性的重组蛋白的特点。目前，已有越来越多的药用重组蛋白通过克鲁维酵母表达系统被制备，如巨噬细胞集落刺激因子(Macrophagecolony stimulating factor)、生长激素(Growth hormone，GH)等(Albertvan Ooyen et al.Heterologous protein production in the yeastKluyveromyces lactis.FEMS Yeast Res，6：381-292，2006)。但是克鲁维酵母的N-糖基化修饰与哺乳动物具有明显区别，往往产生由大量甘露糖组成的过度糖基化修饰，其每个糖链的甘露糖数一般高达数百个(AriHelenius et al.Roles of N-linked glycans in the endoplasmicreticulum.Annu.Rev.Biochem.73：1019-1049，2004)

糖基化对蛋白质的正确折叠、稳定性和生物活性至关重要。在人体内，糖基化是影响蛋白质的药物动力学特性(如组织分布和在血液中的清除)的原因之一(郭振楚，《糖类化学》，化学工业出版社，2005)。

这种庞大的糖基化外链通常具有强免疫原性，因而这种过度糖基化的糖蛋白不适合用于治疗目的。而且，庞大的糖化外链可以掩盖治疗性蛋白质的活性位点及预防用疫苗的抗原表位。例如，被含30-40个甘露糖的N-多糖糖基过度糖基化的流感神经氨酸酶(NA)，由于位于其分子顶部的可变且免疫优势的表位被N-多糖掩盖，使其在小鼠中的免疫原性降低(Wim Martinet，Protection of MiceAgainst a Lethal Influenza Challenge by Immunization with Yeast-DerivedRecombinant Influenza Neuraminidase.European Journal of Biochemistry，247：332-338，1997)。过度糖基化通常还导致重组蛋白质产物在碳水化合物组成和分子量上的不均匀性，这使蛋白质纯化变得复杂，碳水化合物部分的增加还导致过度糖基化的蛋白的比活性(单位/重量)降低。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组克鲁维酵母菌及其构建方法和应用。

本发明所提供的重组克鲁维酵母菌，是能作为表达如下低糖基化糖蛋白的宿主的重组菌，所述低糖基化糖蛋白的50％以上的N-糖链上的单糖数不大于20个，较优的是不大于16个，最优的是不大于11个的糖蛋白。

所述重组克鲁维酵母菌具体可为将克鲁维酵母菌中的α-1，6-甘露糖转移酶基因或/和α-1，3-甘露糖转移酶基因灭活得到的重组菌。

上述α-1，6-甘露糖转移酶(OCH1)基因和/或α-1，3-甘露糖转移酶(MNN1)基因的灭活可以通过突变基因一个或者多个核苷酸序列或者通过缺失部分或完整基因序列来实现、也可以利用插入核苷酸破坏原有阅读框、提前终止蛋白质合成等方式来实现灭活该基因或该基因编码的蛋白质。上述突变、缺失和插入等可以用常规的诱变、敲除等方法获得。这些方法已有许多文献报道，如J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。也可用本领域已知的其它方法来构建基因灭活的酵母菌。其中较优的是通过敲除甘露糖转移酶基因的部分序列获得。该序列至少大于三个碱基，较优的是大于100个碱基，更优的是包括50％以上的编码序列，最优的是缺失OCH1 80％和MNN1 100％编码序列。这种通过敲除甘露糖转移酶基因的部分序列获得的菌株不易产生回复突变，菌株的稳定性比利用点突变等方法构建的稳定性更高，更有利于应用于医疗和工业。

用于构建本发明的重组克鲁维酵母菌的出发菌株可以是克鲁维属的任何酵母菌，如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、鹰嘴豆克鲁维酵母、保加利亚克鲁维酵母、耐温克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母菌株。乳酸克鲁维酵母被认为是一种安全，易于遗传操作，基因组序列清楚，能高效表达异源蛋白并且具备工业规模的发酵特性，已成为用于食品工业和药用蛋白生产的最佳宿主酵母之一。

因此，本发明中的出发菌株优选乳酸克鲁维酵母菌ATCC8585。

本发明的重组克鲁维酵母菌具体可为KLGE02或KLGE03。所述KLGE02已于2008年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC No.2400；所述KLGE03已于2008年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC No.2401。

本发明中构建的重组载体也属于本发明的保护范围。

本发明构建的重组载体，是能够敲除克鲁维酵母菌的甘露糖转移酶基因的重组酵母表达载体，所述甘露糖转移酶为α-1，6-甘露糖转移酶或α-1，3-甘露糖转移酶。

其中，所述重组酵母表达载体是在酵母表达载体的多克隆位点插入有所述甘露糖转移酶基因的上游侧翼同源区和下游侧翼同源区的重组酵母表达载体；

当所述甘露糖转移酶为α-1，6-甘露糖转移酶时，所述甘露糖转移酶基因的上游侧翼同源区为如下a)或b)的DNA片段，所述甘露糖转移酶基因下游侧翼同源区为如下c)或d)的DNA片段，

a)大小为至少200bp的DNA片段，该DNA片段选自α-1，6-甘露糖转移酶基因的起始密码子上游的染色体DNA序列；

b)在严格条件下与a)限定的DNA片段杂交的片段；

c)大小为至少200bp的DNA片段，该DNA片段选自α-1，6-甘露糖转移酶基因的终止密码子下游的染色体DNA序列；

d)在严格条件下与c)限定的DNA片段杂交的片段。

当所述甘露糖转移酶为α-1，3-甘露糖转移酶时，所述甘露糖转移酶基因的上游侧翼同源区为如下1)或2)的DNA片段，所述甘露糖转移酶基因的下游侧翼同源区为如下3)或4)的DNA片段，

1)大小为至少200bp的DNA片段，该DNA片段选自α-1，3-甘露糖转移酶基因的起始密码子上游的染色体DNA序列；

2)在严格条件下与1)限定的DNA片段杂交的片段；

3)大小为至少200bp的DNA片段，该DNA片段选自α-1，3-甘露糖转移酶基因的终止密码子下游的染色体DNA序列；

4)在严格条件下与3)限定的DNA片段杂交的片段。

本发明中当所述甘露糖转移酶为α-1，6甘露糖转移酶时，所述甘露糖转移酶基因的上游侧翼同源区优选为如下A)或B)的DNA片段，所述甘露糖转移酶基因的下游侧翼同源区优选为如下C)或D)的DNA片段，

A)序列表中序列1的自5′末端第121-2119位脱氧核糖核苷酸组成的DNA分子；

B)在严格条件下与A)限定的DNA片段杂交的片段；

C)序列表中序列1的自5′末端第3276-5469位脱氧核糖核苷酸组成的DNA分子；

D)在严格条件下与C)限定的DNA片段杂交的片段。

当所述甘露糖转移酶为α-1，3-甘露糖转移酶时，所述甘露糖转移酶基因的上游侧翼同源区优选为如下I)或II)的DNA片段，所述甘露糖转移酶基因的下游侧翼同源区优选为如下III)或IV)的DNA片段，

I)序列表中序列2的自5′末端第102-1480位脱氧核糖核苷酸组成的DNA分子；

II)在严格条件下与I)限定的DNA片段杂交的片段；

III)序列表中序列2的自5′末端第3897-5436位脱氧核糖核苷酸组成的DNA分子；

IV)在严格条件下与III)限定的DNA片段杂交的片段；

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

本发明所用的酵母表达载体优选为pYES2酵母表达载体。

所述重组载体上还带有URA3(orotidine-5′-phosphate decarboxylase)基因作为筛选标记。

本发明的另一个目的是提供一种构建所述重组克鲁维酵母菌的方法。

本发明提供的构建所述重组克鲁维酵母菌的方法，是将构建的所述重组载体导入克鲁维酵母菌中获得重组菌。

灭活甘露糖转移酶基因的方法可以用本领域已知的各种方法，但常规方法的效率很低，较难获得灭活甘露糖转移酶基因的菌株。本发明所述构建克鲁维酵母菌的方法能高效灭活甘露糖转移酶基因。

本发明所述的重组克鲁维酵母可在生产外源糖蛋白中的应用。

其中，所述的外源糖蛋白包括：细胞因子、凝血因子、免疫球蛋白、内皮生长因子、生长激素释放因子、生长因子、人血管抑制素、组织纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂、尿激酶、流感病毒神经氨酸酶、血细胞凝集素、唾液酸转移酶、HIV胞膜蛋白、肠激酶、疱疹病毒I型糖蛋白D，以及这些蛋白的融合蛋白。

本发明构建的重组克鲁维酵母菌有两个特别明显的优点：一是所敲除的酵母菌甘露糖转移酶基因的编码区80％以上缺失，不易产生回复突变，相比于通过插入终止子等破坏原有读码框失活等方法构建的菌种而言(如Wouter Vervecken etal.In Vivo Synthesis of Mammalian-Like，Hybrid-Type N-Glycans inPichia pastoris.Applied and Environmental Microbiology，5：2639-2646，2004)，突变株稳定性明显高。二是本发明构建的重组克鲁维酵母菌表达的糖蛋白不存在过度糖基化现象，本发明表达的两种低糖基化的HSA-GM/CSF中，一种的每个N-糖链上50％以上的单糖为15-16个，另一种的每个N-糖链上50％以上的单糖为11-13个。

本发明的构建重组克鲁维酵母菌的方法，能成功高效的得到α-1，6-甘露糖转移酶或α-1，3-甘露糖转移酶基因单缺陷、α-1，6-甘露糖转移酶和α-1，3-甘露糖转移酶基因双缺陷酵母菌，从8个克隆中即可得到4个阳性克隆。

本发明的重组克鲁维酵母菌表达的低糖基化糖蛋白，与野生型克鲁维酵母菌表达的过度糖基化蛋白相比，N-糖链上的单糖数明显减少。该低糖基化糖蛋白避免了过度糖基化引起的高免疫原性、对活性位点的遮蔽等问题，且消除了不均一性，因而在临床医疗和工业上有广泛的应用前景。

附图说明

图1为用于灭活α-1，3-甘露糖转移酶基因的重组载体pYES2-mnn1。

图2为以OCH1为例阐明灭活甘露糖转移酶基因的原理。

图3为PCR鉴定α-1，6-甘露糖转移酶基因的的灭活

泳道1：以重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2400基因组DNA为模板扩增的产物；泳道2：以乳酸克鲁维酵母ATCC8585的基因组DNA为模板扩增的产物；M：分子量标准，自上而下分别为15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp。

图4为PCR法鉴定α-1，3-甘露糖转移酶基因的的灭活

泳道1&2：以重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2401基因组DNA为模板扩增的产物，3.2kb；泳道3：以乳酸克鲁维酵母ATCC8585的基因组DNA为模板扩增的产物5.6kb，M：分子量标准，15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500bp。

图5为pKLAC1-HSA-GM/CSF结构示意图。

图6为重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2400，CGMCC No.2401和乳酸克鲁维酵母ATCC8585表达的HSA-GM/CSF的分析。

图7为荧光辅助糖电泳方法显示重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2400、CGMCCNo.2401和乳酸克鲁维酵母ATCC8585表达的HSA-GM/CSF的糖链变化。

具体实施方式

本发明的重组克鲁维酵母菌，具体可按照如下方法构建：1)构建能够敲除克鲁维酵母菌的α-1，6-甘露糖转移酶或α-1，3-甘露糖转移酶基因的重组酵母表达载体；2)将该重组酵母表达载体导入克鲁维酵母菌中，得到能作为表达低糖基化糖蛋白的宿主的重组菌。

其中，所用的α-1，6-甘露糖转移酶或α-1，3-甘露糖转移酶的上游侧翼同源区和下游侧翼同源区的多聚核苷酸序列可以从公开的美国国立生物技术信息中心(NCBI)获得。该上游侧翼同源区和下游侧翼同源区可按照如下方法制备：利用PCR方法，以乳酸克鲁维酵母菌ATCC8585基因组DNA为模板，获得所述基因或基因片段两侧所需的一定长度的侧翼同源区，分别包括OCH1基因和MNN1基因编码区上游和下游侧翼同源区，并在引物部分添加合适的酶切位点。根据序列获得多聚核苷酸可以用本领域周知的方法，如PCR、RT-PCR方法、人工合成的方法、基因组DNA和构建筛选cDNA文库的方法等获得(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)。若需要可用本领域公知的方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入、和与其它多聚核苷酸连接等。将分别得到的上游(上游称之为5′臂)和下游(下游称之为3′臂)侧翼区同源臂片段进行融合，在保持各自片段大小不变的前提下，可以用本领域周知的各种方法，如通过重叠PCR的方法，所用标准的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)的叙述。可用本领域公知的方法分别将含OCH1或MNN1基因侧翼区同源臂融合片段的核酸克隆到各种适用于酵母的载体中去，或者利用各自侧翼区同源臂上酶切位点分别插入载体特定区域。所用标准的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)的叙述。

用于构建本发明的重组载体的原始载体可以带有复制位点，筛选标记，营养缺陷型标记(如URA3，HIS4，ADE1，LEU2，ARG4)等，这些载体的构建方法已在许多文献公开(如J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995)，也可以从各种公司购得(如Invitrogen life technologies，Carlsbad，California 92008，USA)，优先的载体有pPICZαA、pYES2酵母表达载体。所述重组载体都是穿梭载体，先在大肠杆菌中复制扩增，然后被导入宿主酵母细胞，载体应该带有抗性标记基因，或者营养缺陷型标记基因，以利于后期转化子的筛选。

本发明的重组载体线性化后，可按照常规方法转化宿主细胞，如制备感受态细胞、电穿孔、醋酸锂法等(A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)。成功转化的细胞，即含有欲灭活基因或基因片段的同源区的细胞，可以通过人们熟知的技术加以鉴定，如细胞经收集并裂解，提取DNA，然后PCR方法鉴定基因型；而之前选择正确的表型可以通过营养缺陷型或者抗性标记的筛选而得以实现。第一次重组正确的转化子，经过在酵母完全培养基培养后，涂布在含尿嘧啶的5-氟乳清酸平板(第二次重组)上筛选，长出的克隆，再进一步进行基因型的PCR鉴定。分别筛选到正确缺失了预期的OCH1或(和)MNN1编码区的转化子，获得灭活OCH1或(和)MNN1基因的乳酸克鲁维酵母。

本发明的重组克鲁维酵母可以用于生产各种医疗和工业用的糖蛋白，如细胞因子(例如干扰素、G-CSF、GM-CSF等)、凝血因子(例如因子VIII、因子IX、人C蛋白)、免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM等)、内皮生长因子、生长激素释放因子、HIV包膜蛋白、流感病毒A血细胞凝集素、流感神经氨酸苷酶、葡聚糖酶、α-淀粉酶、冬氨酸蛋白酶、转化酶、唾液酸转移酶(trans-sialidase)、肠激酶活化剂、疱疹病毒I型糖蛋白D、人血管抑制素、人B7-1、B7-2和B-7受体CTLA-4、人组织因子、生长因子(例如血小板衍生生长因子)、人α-抗胰蛋白酶、人红细胞生成素、组织纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活抑制剂-1、尿激酶、α-半乳糖苷酶、纤溶酶原、凝血酶，以及这些蛋白的融合蛋白。

上述蛋白的氨基酸及核苷酸序列均已公开，可以从美国国立生物技术信息中心NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或者欧洲分子生物实验室EMBL(http://www.embl.org)公开的数据库中获得，或者从各种相关文献中获得。根据序列获得这些基因可以用本领域周知的方法，如PCR、RT-PCR方法、人工合成的方法、基因组DNA和构建筛选cDNA文库的方法等获得(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)。这些蛋白在低糖化的乳酸克鲁维酵母菌株中的表达可以用本领域已知的各种方法来实现(A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)。其中这些蛋白的表达优选的是由启动子控制的，这些启动子可以是乳酸克鲁维酵母中各种启动子，优选的是LAC4(Paul A.Colussi et al.Kluyveromyces lactis LAC4 promoter variantsthat lack function in bacteria but retain full function in yeast.Applied and Environmental Microbiology，71(11)：7092-7098，2005)、PGK(Gerd Gellissen et al.Application of yeasts in gene expression studies：a comparison of Saccharomyces cerevisiae，Hansenula polymorpha andKluyveromyces lactis.Gene，190(1)：87-97，1997)、PHO5(EncarnacionFerminan et al.The KlPHO5 gene encoding a repressible acid phosphatasein the yeast Kluyveromyces lactis：cloning，sequencing andtranscriptional analysis of the gene，and purification and propertiesof the enzyme.Microbiology，143：2615-2625，1997)、ADH4(MicheleSaliola et al.Use of the KlADH4 promoter for ethanol-dependentproduction of recombinant human serum albumin in Kluyveromyces lactis.Applied and Environmental Microbiology，65(1)：53-60，1999)。编码这些蛋白的核酸，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存在。这些蛋白可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，优选的是从宿主中分泌出来。分泌所用的信号肽，可以为酵母α交配因子信号肽、人血白蛋白信号肽等，优选的是用酵母α交配因子信号肽。并且可以用本领域常用的方法培养这些酵母，并纯化产生的糖蛋白，可以根据待纯化特定蛋白的性质决定纯化方案。例如，可以用典型的分离技术纯化目标蛋白的方法，如沉淀、免疫吸附或各种层析法。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、α-1，6-甘露糖转移酶灭活的重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2400的构建

1.灭活α-1，6-甘露糖转移酶基因的重组载体的构建

实验中所使用的Pyrobest酶、LA Taq酶、dNTPs、限制性内切酶、T4连接酶等购自大连宝生物工程有限公司，pfu酶、试剂盒、DH5α感受态细胞、引物合成、测序等由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。

用玻璃珠制备法(A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)提取乳酸克鲁维酵母ATCC8585(American Type Culture Collection，美国典型微生物菌种保藏中心，Manassas，VA 20108USA)的基因组DNA，以该基因组DNA为模板扩增α-1，6-甘露糖转移酶(OCH1)基因(序列表中序列1)两侧的同源臂，OCH1两侧的同源臂分别为2kb，中间缺失约1.1kb的编码基因。扩增OCH1上游侧翼区同源臂(OCH1 5′同源臂)所用的引物为KLOCH01和KLOCH02，引物序列分别为：5′-ACTGCTAGCATGTGGAAGTGATCTGTGGAGA-3′(划线部分为NheI识别位点)和5′-ATCTAGGTACCTGAGAGCTCGTTGGAAAGACTGAAGATGAAAGCA-3′；扩增OCH1下游侧翼区同源臂(OCH1 3′同源臂)所用的引物为KLOCH03和KLOCH04，引物序列分别为：5′-CCAACGAGCTCTCAGGTACCTAGATCCATCAAATGATCACCGT-3′和5′-GATACGCGTGTCACATACCGATTGATCGATAC-3′(划线部分为MluI识别位点)。

两个同源臂的PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸2min30sec进行30次循环，最后72℃延伸10min；目的片段大小在2kb左右。将PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收(购自鼎国生物技术有限公司，北京)。利用重叠延伸PCR的方法融合OCH1 5′同源臂和3′同源臂(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995)，以OCH1 5′同源臂和3′同源臂PCR产物为模板，以KLOCH01/04为引物，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性1min、55℃复性1min、72℃延伸4min30sec进行30次循环，最后72℃延伸10min；目的片段大小在4kb左右。PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。

NheI/MluI双酶切(本试验所用的限制性内切酶均购自宝生物工程有限公司，大连)嵌合体片段，酶切后的嵌合体片段插入同样双酶切处理的载体pYES2(购自Invitrogen Corp.USA)中，T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上筛选阳性克隆。用NheI/MluI双酶切鉴定阳性克隆，将NheI和MluI酶切得到4200bp左右和3000bp左右片段的重组载体命名为pYES2-och1(图1A)。测序结果表明，嵌合体片段中的OCH1 5′同源臂的序列是序列表中序列1中的自5′末端121-2119位脱氧核糖核苷酸，其中，自5′末端115-120脱氧核糖核苷酸为NheI酶识别位点；OCH1 3′同源臂的序列是序列表中序列1中的自5′末端3276-5469位脱氧核糖核苷酸，其中，自5′末端4024-4029位脱氧核糖核苷酸为SalI酶识别位点。

2、重组载体pYES2-och1对乳酸克鲁维酵母ATCC8585的转化

采用电转化法将重组载体转化入乳酸克鲁维酵母ATCC8585中，电转化的方法为本领域所共知(如A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)。电转化前，先用SalI酶切重组载体pYES2-och1进行线性化，然后电转入制备好的乳酸克鲁维酵母ATCC8585感受态细胞中，涂布于MD培养基(YNB1.34g/100mL，生物素4×10^-5g/100mL，葡萄糖2g/100mL，琼脂1.5g/100mL)平板上。25℃培养3-5天，待培养基上长出克隆后，随机挑取几个克隆提取基因组DNA，通过PCR的方法鉴定重组载体是否正确整合到了染色体上的目标位点，PCR反应所用的两对引物分别是：KLOCH03和染色体上OCH1基因3′同源臂外围引物KLOCH08，引物KLOCH03和KLOCH08的序列分别为：

5′-CCAACGAGCTCTCAGGTACCTAGATCCATCAAATGATCACCGT-3′和

5′-AAATCAATACCTTCTTCAACGG-3′。

PCR反应所用的酶为LA Taq(购自宝生物工程有限公司，大连)，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸3min进行30次循环，最后72℃延伸10min。通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物条带的大小，所扩增的条带在2.2kb左右，证明了随机挑选的几个克隆中，重组载体已经正确整合到了染色体上的目标位点。

将重组载体已经正确整合到了染色体上的一个克隆接种于YPD培养基(1g/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，2g/100ml葡萄糖)中，25℃摇床培养12小时后，将菌液涂布于含尿嘧啶的5-FOA培养基(YNB 1.34g/100ml，生物素4×10^-5g/100ml，葡萄糖2g/100ml，琼脂1.5g/100ml，尿嘧啶100mg/ml，5-FOA0.1g/100ml)(其中，YNB，为无氨基酸酵母氮源，购自北京欣经科生物技术有限公司，5-FOA为5-氟乳清酸，购自Sigma-aldrich P.O.BOX14508，St.Louis，MO63178USA)，置于25℃培养。

3.PCR鉴定阳性克隆

在5-FOA培养基上长出克隆后，提取这些克隆的基因组DNA，进行PCR鉴定：以基因组DNA为模板，鉴定引物为KLOCH07和染色体上OCH1基因3′同源臂外围引物KLOCH08，引物KLOCH07和KLOCH08的序列分别为：

5′-TGCTTTCATCTTCAGTCTTTCC-3′和5′-AAATCAATACCTTCTTCAACGG-3′。

同时以乳酸克鲁维酵母ATCC8585基因组DNA为模板的PCR反应体系设为阴性对照。PCR反应所用的酶为LA Taq，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸4min进行30次循环，最后72℃延伸10min。将产物进行琼脂糖凝胶电泳，乳酸克鲁维酵母ATCC8585基因组DNA为模板的PCR产物大小在3.4kb左右，以待鉴定的克隆基因组为模板的PCR产物大小在2.3kb左右，证明了OCH1基因灭活的菌株(OCH1基因的编码区缺失1.1kb)构建正确。电泳图见图3。结果通过两次同源重组，在8个转pYES2-och1线性片段的克隆中，获得了4株灭活OCH1基因的突变型菌株，将其中的一株命名为KLGE02。该菌株已于2008年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC No.2400。

实施例2、α-1，3-甘露糖转移酶灭活的重组乳酸克鲁维酵母的构建

1.灭活α-1，3-甘露糖转移酶基因的重组载体的构建

用玻璃珠制备法(A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)提取乳酸克鲁维酵母ATCC8585的基因组DNA，以该基因组DNA为模板扩增α-1，3-甘露糖转移酶基因(序列表中序列2)两侧的同源臂，α-1，3-甘露糖转移酶基因(MNN1)两侧的同源臂分别为1.4kb和1.5kb，中间缺失2.4kb的编码基因，扩增MNN1上游侧翼区同源臂所用的引物为KLMNN01和KLMNN02，引物序列分别为：5′-TAAGCTAGCTGACCAATGACGCATCCGAACT-3′(划线部分为NheI识别位点)和5′-ATTAAGCTTATGGCACGCTGGGTTACCTCC-3′(划线部分为HindIII识别位点)；扩增MNN1下游侧翼区同源臂所用的引物为KLMNN03和KLMNN04，引物序列分别为：5′-ATAGCTAGCTTAAGCTTACACTGCATAAAGTCTGCTCGTA-3′(划线部分分别为NheI和HindIII识别位点)和5′-CTGACGCGTAGCCGTTGAAGCCAAGAAGGT-3′(划线部分为MluI识别位点)。

两个同源臂的PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸2min进行30次循环，最后72℃延伸10min；目的片段大小在1.5kb左右。PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收(购自鼎国生物技术有限公司，北京)。NheI/MluI双酶切MNN1下游侧翼区同源区，酶切后的片段插入同样双酶切处理的载体pYES2(购自Invitrogen Corp.USA)中，T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，用含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板筛选阳性克隆。用NheI/MluI双酶切鉴定阳性克隆，将NheI和MluI酶切得到1.5kb左右和3.0kb左右片段的重组载体命名为pYES2-mnn1(3′arm)载体。NheI/HindIII双酶切MNN1上游侧翼区同源区后，酶切后的片段插入同样双酶切处理的重组载体pYES2-mnn1(3′arm)中，T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，用含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板筛选阳性克隆。用NheI/HindIII双酶切鉴定阳性克隆，将NheI和HindIII酶切得到1.4kb左右和4.5kb左右片段的重组载体命名为pYES2-mnn1，如图1所示。测序结果表明，嵌合体片段中的MNN1上游侧翼区同源臂的序列是序列表中序列2中的自5′末端102-1480位脱氧核糖核苷酸，其中，自5′末端96-101位脱氧核糖核苷酸为NheI酶识别位点；MNN1下游侧翼区同源臂的序列是序列表中序列2中的自5′末端3897-5436位脱氧核糖核苷酸，其中，自5′末端4395-4400位脱氧核糖核苷酸为BamHI酶识别位点。

2.重组载体pYES2-mnn1对乳酸克鲁维酵母ATCC8585的转化

采用电转化法将重组载体pYES2-mnn1转化入乳酸克鲁维酵母ATCC8585中，电转化的方法为本领域所共知(如A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)。电转化前，先用BamHI酶切重组载体pYES2-mnn1进行线性化，然后电转入制备好的乳酸克鲁维酵母ATCC8585感受态细胞中，涂布于MD培养基(YNB 1.34g/100ml，生物素4×10^-5g/100ml，葡萄糖2g/100ml，琼脂1.5g/100ml)平板上。25℃培养3-5天，待培养基上长出克隆后，随机挑取几个克隆提取基因组DNA，通过PCR的方法鉴定重组载体是否正确整合到了染色体上的目标位点，PCR反应所用的两对引物分别是：KLMNN07和MNN1基因3′同源臂外围引物KLMNN08，引物KLMNN07和KLMNN08的序列分别为：

5′-ACAGGTATGTTCCTATCGCAGTT-3′和5′-TTGATCTTGAATGGTGGGTTT-3′。

PCR反应所用的酶为LA Taq(购自宝生物工程有限公司)，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸3min进行30次循环，最后72℃延伸10min。通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物条带的大小，所扩增的条带在2.2kb左右，证明了随机挑选的几个克隆中，重组载体已经正确整合到了染色体上的目标位点。

将重组载体已经正确整合到了染色体上的一个克隆接种于YPD培养基(1g/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，2g/100ml葡萄糖)中，25℃摇床培养12小时后，将菌液涂布于含尿嘧啶的5-FOA培养基(YNB 1.34g/100ml，生物素4×10^-5g/100ml，葡萄糖2g/100ml，琼脂1.5g/100ml，尿嘧啶100mg/ml，5-FOA 0.1g/100ml)(其中，YNB，为无氨基酸酵母氮源，购自北京欣经科生物技术有限公司，5-FOA为5-氟乳清酸，购自Sigma-aldrich P.O.BOX14508，St.Louis，MO 63178USA)，置于25℃培养。

3.PCR鉴定阳性克隆

在5-FOA培养基上长出克隆后，提取这些克隆的基因组DNA，进行PCR鉴定：以基因组DNA为模板，鉴定引物为染色体上MNN1基因同源臂外的序列KLMNN09和KLMNN08，引物KLMNN09和KLMNN08的序列分别为：

5′-ACTCCATGTCCCAGAAAACGTC-3′和5′-TTGATCTTGAATGGTGGGTTT-3′。

同时将以乳酸克鲁维酵母ATCC8585基因组DNA为模板的PCR反应体系设为对照。PCR反应所用的酶为LA Taq，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸6min进行30次循环，最后72℃延伸10min。将产物进行琼脂糖凝胶电泳，乳酸克鲁维酵母ATCC8585基因组DNA为模板的PCR产物大小在5.6kb左右，以待鉴定的克隆基因组DNA为模板的PCR产物大小在3.2kb左右，证明了MNN1基因灭活的菌株(MNN1基因的编码区缺失2.4kb)构建正确。电泳图见图4。结果通过两次同源重组，在8个转pYES2-mnn1线性片段的克隆中，获得了4株灭活MNN1基因的突变型菌株。

实施例3：α-1，6-甘露糖转移酶基因和α-1，3-甘露糖转移酶基因均被灭活的重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2401的构建

利用重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2400作为宿主，按照实施例2的方法，灭活重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2400基因组中的α-1，3-甘露糖转移酶基因，在8个转pYES2-mnn1线性片段的克隆中，获得了4株α-1，6-甘露糖转移酶基因和α-1，3-甘露糖转移酶基因均被灭活的突变型菌株，将其中的一株命名为KLGE03。该菌株已于2008年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC No.2401。

实施例4、利用本发明的重组乳酸克鲁维酵母表达低糖基化的融合蛋白HSA-GM/CSF

HSA-GM/CSF是人血清白蛋白(HSA)与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的融合蛋白，具有两个N-糖基化的位点，是典型的糖蛋白。该融合蛋白可以刺激粒细胞、巨噬细胞增殖，具有重要的临床应用价值，但是普通乳酸克鲁维酵母表达的该融合蛋白为过度糖基化修饰的，这严重影响了其临床应用。本实施例提供了一种用重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2400或重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2401表达低糖化的HSA-GM/CSF的方法，具体方法如下：

1.HSA-GM/CSF的获得及表达载体的构建

用PCR的方法从人胎肝cDNA文库(购自Clontech Laboratories Inc.1290Terra Bella Ave.Mountain View，CA94043，USA)获得hGM-CSF cDNA(GenbankAccesion Number：NM 000758的自5′末端第84-464位脱氧核糖核苷酸组成的序列)，所用的引物为

GMCSF1：5′-ATGGATCCGCACCCGCCCGCTCGCCCAGC-3′和

GMCSF2：5′-ATGAATTC

CTCCTGGACTGGCTCCCAGCA-3′。

PCR方法为：100μl反应体系中加入1μl人胎肝cDNA文库，20mol/L的GMCSF1、GMCSF2引物各3μl，2mmol/L的dNTP 10μl，10×反应缓冲液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反应缓冲液、pfu DNA聚合酶均为上海生物工程技术服务有限公司产品)。PCR条件为94℃变性1min，52℃退火30sec，72℃延伸1.5min，循环35次后，再72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳回收hGM-CSF cDNA(约0.5kb)然后用BamHI和EcoRI酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳回收纯化。

用PCR方法从上述人胎肝cDNA文库获得带有信号肽和前肽编码序列的HSA cDNA(自Genbank Accesion Number：NM 000477的自5′末端第40-1863位脱氧核糖核苷酸组成的序列)，所用的引物为：

HSA1：5′-GCTTCGAAACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCT-3′和

HSA2：5′-TAGGATCCACCACCACCAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC-3′。

PCR条件为：100μl反应体系中，加入1μl人胎肝cDNA文库，20mol/L的HSA1和HSA2引物各3μl，2mmol/L的dNTP10μl，10×反应缓冲液10μl，Taq plusIDNA聚合酶5U。PCR条件为94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸3min，循环35次后，再72℃延伸10min。用DNA片段回收试剂盒回收纯化约1.8kb的HSA cDNA目标带，用NspV/BamHI切。(实验中的Taq plusI DNA聚合酶、内切酶、连接酶、试剂盒等购自大连宝生物工程有限公司)。

为了将HSA与GM-CSF以融合蛋白形式表达，首先选择pHIL-D2质粒作为载体(Invitrogen life technologies，carlsbad，california 92008，USA)。在该载体AOX启动子下游NspV与EcoRI位点间插入HSA-GM/CSF基因，因pHIL-D2载体上有两个NspV位点，为了方便操作，首先pHIL-D2载体用ClaI/SalI酶切成3段，回收4kb片段，自身连接后命名为pD3载体。pD3载体用NspV/EcoRI切，回收线性化载体，与上述用BamHI/EcoRI切的GM-CSF cDNA的片段，及用NspV/BamHI切的HSAcDNA的片段，用T4连接酶催化连接，转化大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆JM109(pD3HSAGMCSF)，测序正确，其编码融合蛋白的核苷酸序列及对应的氨基酸序列见序列表中序列3。将正确的重组载体命名为pD3HSAGMCSF。将pD3HSAGMCSF质粒，用ClaI/ScaI切，电泳回收线性化的6.3kb片段，pHIL-D2空载体用ClaI/ScaI切回收约4.2kb的片段。T4连接酶催化连接pD3HSAGMCSF的6.3kb片段与pHIL-D2的4.2kb片段，连接产物转化JM109后，涂于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平皿，挑选阳性克隆，抽提质粒，酶切鉴定，获得HSA-GM/CSF表达载体pD2HSAGMCSF。

设计引物HSA-GM-CSF01和HSA-GM-CSF02，引物序列分别为

5′-GTCCAAGCTTGAAAAAAATGAAGTGGGTAACCTTTATTTC-3′和

5′-TATGTCGACTTAGTGATGGTGATGGTGGTGACCTCCACCCTCCTGGACTGGCTCCCA-3′，

并在下游引物末端添加6个组氨酸标签，以便后期利用镍柱进行纯化。以pD2HSAGMCSF为模板，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸2min30sec，进行30次循环，最后72℃延伸10min；目的片段大小在2.2kb左右。将PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收(购自鼎国生物技术有限公司，北京)后用HindIII/SalI(本试验所用的限制性内切酶均购自宝生物工程有限公司，大连)双酶切，酶切后的片段插入同样双酶切处理的质粒pKLAC1(购自NEW ENGLAND Biolabs)中，T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，用含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板筛选阳性克隆。用HindIII和SalI酶切鉴定阳性克隆，将HindIII和SalI酶切得到2200bp左右和约8700bp左右片段的重组载体命名为pKLAC1-HSA-GM/CSF，即乳酸克鲁维酵母表达载体。该载体的结构见附图5。

制备重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2400、重组乳酸克鲁维酵母CGMCCNo.2401以及乳酸克鲁维酵母ATCC8585的感受态细胞，将上述表达载体pKLAC1-HSA-GM/CSF以SacII线性化后分别电转入酵母菌的感受态细胞中，将电击后的菌液涂布于含有5mmol/L乙酰胺YCB琼脂培养基(1mol/l磷酸钠，1.17g/100ml YCB，2g/100ml琼脂，5mmol/L乙酰胺，其中YCB为酵母基本碳源培养基，购自北京欣经科生物技术有限公司)平板上，30℃翻转培养3-4天直至克隆出现。含有整合表达片段的每一个菌株培养物，用无菌枪头刮取约2mm2的单克隆细胞，置于2ml YPGal培养液(1g/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，2g/100ml半乳糖)中重悬，30℃振荡培养(250-300rpm)，诱导72小时后离心取上清，用于融合蛋白的表达分析。

2.SDS-PAGE检测表达产物

将转入pKLAC1-HSA-GM/CSF的重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2400、重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2401以及乳酸克鲁维酵母ATCC8585的表达上清各取1L，经饱和度为80％的硫酸铵沉淀后，用100mL Tris-HCl缓冲液(20mmol/L pH7.5)溶解，按照下述文献中的方法进行纯化：D.R.马歇克等，《蛋白质纯化与鉴定实验指南》，科学出版社，1999。其中，先用镍亲和层析柱(Ni-affinitychromatography)进行纯化，所采用的洗脱液的组成为20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，pH7.5。再用AKTA色谱仪系统纯化(AmershamPharmacia Biotech AB，Sweden)，所采用的流动相的组成为20mmol/LTris-HCl，50mmol/L NaCl，pH7.5。纯化产物进行10％SDS-PAGE电泳检测。电泳结果如图6所示，表明乳酸克鲁维酵母ATCC8585的HSA-GM/CSF主带的表观分子量大于97kD(泳道1)。明显大于不被糖基化修饰的HSA-GM/CSF蛋白的理论分子量(81kD)(泳道2)，其糖基的分子量高达16kD以上，即单个糖基的分子量约为8000Da以上，且表达带产生了明显的拖尾现象，因而表达的HSA-GM/CSF为过度糖基化蛋白。重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2400和CGMCC No.2401表达的HSA-GM/CSF表观分子量约为84kD，且表达带清晰，没有拖尾现象，其单个糖基的分子量约为2000Da，与正常糖基的分子量相近，因而表达的HSA-GM/CSF为低糖基化的蛋白。图6中，泳道1为乳酸克鲁维酵母ATCC8585表达的HSA-GM/CSF，泳道2为用PNGase F酶(购自New England BioLabs，NEB，Ipswich，MA)切去除乳酸克鲁维酵母ATCC8585表达的HSA-GM/CSF的N-糖链的酶切产物，泳道3为重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2400表达的HSA-GM/CSF，泳道4为用PNGase F酶切去除重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2400表达的HSA-GM/CSF的N-糖链的酶切产物，泳道5为重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2401表达的HSA-GM/CSF，泳道6为用PNGase F酶切去除重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2401表达的HSA-GM/CSF的N-糖链的酶切产物，泳道7为PNGase F酶(33kD)。M：标准分子量，自上而下分别为97.4、66.7、43、31、21KD。

产生这种结果可能的原因是：融合蛋白HSA-GM/CSF有两个糖基化位点，乳酸克鲁维酵母ATCC8585表达的该蛋白由于不均一的糖基化及过度糖基化造成了分子量的不均一和表达带拖尾现象。重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2401由于α-1，6-甘露糖转移酶和α-1，3-甘露糖转移酶的缺失，使得蛋白的糖基化大部分停留在低甘露糖基化的结构，所以表达带清晰，没有拖尾，消除了不均一性且表观分子量比野生菌株的小。

3.糖蛋白糖链大小的检测

N-糖基分析是通过荧光辅助糖电泳(fluorophore-assisted carbohydrateelectrophoresis，FACE)(Ningguo Gao et al.Alternative sources ofreagents and supplies for fluorophore-assisted carbohydrateelectrophoresis(FACE)，13(1)：1G-3G，2003)的方法来实现。首先将纯化后的HSA-GM/CSF经PNGase F(New England Biolabs)酶切以便获得糖链，具体方法如下：糖蛋白HSA-GM/CSF在0.5g/100ml SDS和1ml/100ml β-巯基乙醇变性缓冲液中100℃变性5min，然后在如下溶液中37℃反应16hr：50mmol/L磷酸钠(pH7.5)，1ml/100ml NP-40，5-10μl(500,000units/ml)N-糖苷酶F(PNGaseF，NewEngland BioLabs，NEB，Ipswich，MA)。反应结束后，酶切体系中添加4倍体积-20℃预冷的丙酮沉淀糖链，13000g离心10min，弃上清，沉淀经由700uL-20℃预冷的60％甲醇两次萃提。然后将所提糖链低压冻干，利用ANTS(8-aminonaphtalene-1，3，6-trisulfonate)标记还原末端，经30％PAGE分离。最后电泳谱带在紫外光下分析并拍照(Peter Jackson，The Analysis ofFluorophore-Labeled Glycans by High-Resolution Polyacrylamide GelElectrophoresis.Analytical Biochemistry，216：243-252，1994)。FACE电泳结果如图7所示，表明乳酸克鲁维酵母ATCC8585表达的糖蛋白的糖链部分明显大于30个糖基，而重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2400表达的糖蛋白的糖链部分为Man_13~14GlcNAc₂，单糖数为15-16个，其中主带Man₁₃GlcNAc₂占主要成分，占50％以上，重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2401表达的糖链为Man_9-11GlcNAc₂，单糖数为11-13个，其中主带Man₉GlcNAc₂至少占50％。可见随着α-1，6-甘露糖转移酶(OCH1)基因和α-1，3-甘露糖转移酶(MNN1)基因的相继灭活，糖链也在逐渐降低。这证实通过OCH1基因和/或MNN1基因的灭活可以实现外源糖蛋白的低糖化，表现为过度糖基化的缺失。

图7中1为重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2400表达的HSA-GM/CSF的糖链；2为乳酸克鲁维酵母ATCC8585表达的HSA-GM/CSF的庞大糖链；3为重组乳酸克鲁维酵母CGMCC No.2401表达的HSA-GM/CSF的糖链，单糖数目不大于13个(Man_9~11GlcNAc₂)；M₁为多聚葡萄糖寡糖分子量标准，自下而上分别为3-16个葡萄糖基(指示11个以上单糖的大小)；M₂为来自牛核糖核酸酶B Man_5~9GlcNAc₂的分子量标准，自下而上分别为5-9个甘露糖基带两个N-乙酰葡糖胺(Man₅GlcNAc₂-Man₉GlcNAc₂)；

牛核糖核酸酶B Man_5~9GlcNAc₂的分子量标准参考如下文献的方法制备：WimMartinet，Protection of Mice Against a Lethal Influenza Challenge byImmunization with Yeast-Derived Recombinant Influenza Neuraminidase.European Journal of Biochemistry，247：332-338，1997。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120>一种重组克鲁维酵母菌及其构建方法和应用

<130>CGGNARW81147

<160>3

<210>1

<211>5742

<212>DNA

<213>克鲁维酵母属乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)

<400>1

aaatggcgct tttaacaaac ttggatacaa cgtttgacaa aatttacttg attgatctct   60

ctccatcgct atgtgaggtt gcaagaaaac gttgtaaaga gcatggatgg aaaagctagc  120

atgtggaagt gatctgtgga gatgcttgcg attttgaaat accagaggaa tcagctcagt  180

tgatcacatt ttcttattca ttgagcatga taccaagttt ctatgcggcc attgatcacg  240

cagtatcttt attggatgct aagaatggta tcatttcgtg tgttgatttt ggtgtcacta  300

atgaatctat gctagtcgga agaaccaaca ctttgggtgg tctagttaac agacatatac  360

cttggctatt ccgtacattc tggagattgt ggtttgaatt cgacaaagtg tttttggatc  420

cagctagaag agaatatctt gaatatagat tcgggacaat caaatcattg aattgttata  480

actacaagct tggtaaaatt ccctactaca tttggttggg ttgcaataaa gaccacgaac  540

aacatcttca agctagattt gttgaacttg caccaacatc tccatacctc gcacctataa  600

ccacgtcagc ttcctctaac gctcagccaa tgaccaaagc tatgattgca gcactagaaa  660

attctaaaaa aggtttacca tatccttctc tgttctatca aaaggagcat tggagagtgt  720

actatgatga agtgaaccct gagtacagcc aatttaagaa cagttatata tacgcattca  780

catgggaaga tcctagagaa gatgttaaca ttcttaatat tcaaccagaa gataccattt  840

tggctattac cagtgctggt gataatattt tgcactatgc cactttgcct aatccaccga  900

agagaattca tggggtggat ttaaatccat gtcaaggaca tttgacagaa ttaaaattag  960

cagcgattag aagcttgagt ttcacacagt tgtggcaaat gtttggtgaa ggtaagattg 1020

atagattcaa caatatttta ctgaataaat tggcgccata tctttcatca aacgcatttc 1080

aatactggtt cgaaaatgga acgaaaacat ttgatcctaa tggagccggg ttgtatgaca 1140

ctgggttcac aaagtgggca ttaagacttg caaaatgggt attcaaagtt gcaaatctta 1200

cagatgaagt taatatgcta tgcaaagcta agaccctaga ggagcaaaga tctatttggg 1260

ataaaaagat aaagccggtc cttttcaaca gagtagtggg taaaatcctc gttggaaacc 1320

cgttattttt atggagtgca cttggagtac cacgtaatca agcaaaaatg atgggctctt    1380

caacattgca atatattatt gacactttgg accctgttat tgataattct ttgatttccg    1440

atgataatta cttttattat ttgacattga agggaagata ttcgagtaga agttgtcctg    1500

attacctaaa agagggtgga ttcaagtctc tttctcgtga aagtcctgaa tctcctctag    1560

atagagttag acttcatact gacacgttga aggatgtctg tgagcgtttg tcgaagaaaa    1620

cagtttcgat tgctataatt atggatcaca tggattggtt tgatccacaa ggaactgatg    1680

ttgacgaaga aattcaggct ttgtggttgg ccctcaactc tcgcggtagg gtattattga    1740

gatctgcctc taaaagccca tggtatatca aaaacttcga aaagttcggc ttcagttgta    1800

aagcagtaag tgcaagatac cctggaaaat gtattgatag agttaacatg tatgccagta    1860

cctgggtttg tcaaaaaatc tccacggcat ctcagagcaa caaccgtaga ttaagttctc    1920

tcgatttgga gaataattaa ggaccataac aggcaaacaa tttcataaat agaacttgaa    1980

gatgagatgt aatataaata caaatgttga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gatacacaaa    2040

tgaaatgaat gaagtaatat gcttattttg tctctttgca ctgagttcgc tttttgcttt    2100

catcttcagt ctttccaacg agctctcagg taccttcctt caaaaatatg cttaacaaat    2160

gccatctcgt cgttgtcttc tttagcgccc attgttctga tacctggtga gaaagaagta    2220

atcggaagta ccatgatgtc gtccactaga ataggctctg tcatcaatga aaagaatccc    2280

cagaacaatg agggtttgtc gttttgtaaa tttttaacaa tgtctttata gaatctcata    2340

gttgtatcat gtttggatcc atgtttgttg ataacattaa gattatcatt gaaaattaaa    2400

atgtcatcat tcttctggat aacgttatta agatactgga aaataacatc tgaaaaaata    2460

cctggaccag tccagttcat aatatcggta ccatctgtat ttttggcggt tttcttttgt    2520

tgatgtttgt aatttttgtt gaacttcttt ttatccctca tgttgacatt ataatcatct    2580

gcaatgtctt ttaatacttc agcatcatct aaaggaatgc tgcttttaac atttgccacg    2640

ctctccaatg ttgttgcggt gatatttgtg atcaattcgc gcaataatgg atggccagat    2700

tttgattgta ttgtccactg acagaattgt attctcctgg cgtaccactc tgcccaatcg    2760

cttctatccg gatcagcctc gataccaatg acaaagccag gttctgaagc ttctagcgtt    2820

tcaaggttgt ccaaggaatt tctatacctt tgtggattct ttaaactaga aaagtaggac    2880

tgagaagtcg atggccatga cgacaatggc tttaatggga acgtatccat gtcagaatat    2940

ataccacctc ttgcataaag gatcaagtat ctgaaaaagt ctgctttaag aattggaagt    3000

ggcaaggatt caaaagcctt tatcacttgt gggaccccac catatagctg ctctagaagt    3060

ggtatcattt gatcatctgt gattaattgg tattgatatg gcggttcctc ggatgcactg    3120

aaatgtttcc aatcattctg gcattttgaa atggaagaaa cctgtgactt tgaactggga    3180

tcaatcttcc aggtctgcca tacctttttg gggatgggta ctcgagaatc gtaggggaat    3240

tgactagcca attgaactcg gagctctcag gtacctagat ccatcaaatg atcaccgtta    3300

ttgctcgtac ctgctaagtc caagtttttc aagttcaagt gatccacgcg agctgtactg    3360

ggaagcaccg tgccaatgct gttatagaaa tggtgattca ctttcgcagt attccattgc    3420

acagaaaaca ataagtacag tatcagcaca atgacaataa tgtacctcgt tcttcttgaa    3480

atctttggta accccattgt gcctgtaaaa ttaagaaaat gcccacaaat ttaatgtttt    3540

tgggatgttg tttgtgaatc aaacgattaa ttctctctat cgatccctaa gaacttttta  3600

tcattcaatg aagaaaaaaa caacaaacag caagaaaaaa ccaattttct aaacagtaaa  3660

cccaattaaa ttaatgtttc gcacacgctc caactgttgt taaaacctac acctcttgat  3720

ctatgatacg aatgtatata tgtacagaat gtatatatgt acagaatgcg tttttctttg  3780

cagtggtagt taatcatttg atgagatttc agcatgaaac tatatatgaa aaactgaaaa  3840

aaaaaggtct atacaacctt agcgaagtaa aaaatctaaa aaaagctttt gtactggcca  3900

gaatcgacag acgggcgata cggtcgtttg accaagagaa agaagatgca gagggcaagt  3960

aatggattca gggttcagtt caatgatatg agttcataga ggggttcata aatacaatca  4020

gcggtcgacg tgtacatagc gggtattata tgtcttgtgt atagttttga agtttcggtc  4080

catataacat gtccagatca gatggactct tgaactgaga cctcattttt ggccaattcc  4140

tggatgaacg attcaatcga ttgcaaatca tttgcgatag ctttagtata atccttgagt  4200

atagttacat ggtaaccaag gtttgcagcg cttattgctg agttttttac gcagaaatcg  4260

aatgcaagtc cgaccacata gatttcagta acatcattct ctttgaaaaa ggcgtcaagt  4320

tcagtgtgat gatcattcca gatatcgttg aatccggaat aatactcacg atccgataag  4380

taacctttat tgacaatctt atgtggcacc ttgagcttta aaatttcagc gagtaatttt  4440

tccggaacct cagagcccca tgtctcctgg acacaatgga ctggccataa cgtagcactt  4500

tgtttctcgg tgctcccagg aacgggtgag tcgtaggtga atgaactgaa atctggtaat  4560

ccatggttct ttgcaaaaga aatgtggtct ggcggatgcc agtctttagt catggcaaca  4620

cagtcccaat cctgatcttg caaaagctgg atgacaggat cgatgatagt atcaccatct  4680

tgaactgcca atgatccttt tggtggtaag aaatcgttct gaatatcaat tactaataac  4740

gcacgggctc ccatcgttaa caaatacgga gtctcgatta cttagtgatg tttgtgtctc  4800

acgttttttc accgttcctt tattatctcc ctaatttttc aaacggtttg ttttttcagt  4860

gcaattttcc cttcaagtat gtgctacttt atatactaaa tacctaccta accgagagca  4920

atgttcgtcg ttccgcagaa aatgaacagt caagacagtg gttggtgcta attgcctgcc  4980

ttgtatacat tggatacact gctgctttgt acggccgtag catttacaat ctgaaacata  5040

tctactttat actacgaact gatcaaccct tttttaattt ttcgatcctt ttttcgttat  5100

tgtctcatag tattgggcgt ctaaatcttg agaaaaaaga atcttctgaa actatataaa  5160

ctaaggggtt ttatcttgga tcttaatcaa gagaaataaa gtaatgatta tcccgaacgc  5220

cagaagtgac attacttcgg catattttgg agctttgatt gtaaaaaaaa gcaagctttc  5280

tttctggtaa agatggatgg catatcctca ataagtttac aaccaattca gaatttagat  5340

ggcttatttc ggatattggc ggctaaagag acagacgatt tacacaggat taatgtttgg  5400

tataaattac ttgaaatatt aagagtagcc gggaatcaag cggtatgtat cgatcaatcg  5460

gtatgtgaca cgcgtaattt attgtccaga ttattggttt ctgtttctat ggttgatgcc  5520

gttgaagaag gtattgattt gtttggagta gcgtttactt attgttccgt aaatgaatca  5580

cttcaaacac ttgtatttca attcattagt caacttgaag aaaattctaa tttgaattta  5640

ttattcctta agacttgcag tttacgaccc cataaagatc atgttcccgg gttctacgat  5700

ataattttcc aattacagac tttcaaaaca ttggatgcaa ag                     5742

<210>2

<211>5678

<212>DNA

<213>克鲁维酵母属乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)

<400>2

actccatgtc ccagaaaacg tcacttactc ccaactatct gctgcgatag catcgtacgt    60

caaggaatgt tcattcttgg cacacgacga accatgctag ctgaccaatg acgcatccga   120

actatacgac ccattattcg aagagttact agtacaagaa ccaacaaaac ctcgtttcaa   180

ggtcacttat aacatagtag acttggaacc tacaccaaga caccgtacct cttcaccaca   240

accagatatc tttgatttat tatctggtac aacaacgcaa gaactacaac aagaggcatc   300

cgcagtatcc aaacaacaac aaacacgtca cgaatacgcg ttgaacgttt ccgtcgccgt   360

tgacgaatcg ttaacggatg ccaagcaaag agcagaaaat ttcgttgccc aactatctaa   420

cttggaattg ttccaatgag taaaattacg acaagacata aagaggaaaa aaaaactaga   480

agaagccgaa gccaaatctt cttcgaaata ttcatgcccc gtccgcaagc tgtatagact   540

ggacttaaga gccggcagat atatatctat attatcagta taatagacaa aaaaacgaca   600

actcaagaat tcaaccaaac aggcacttca gacttcttta tggtcttggc acagtaaaga   660

agatcaaaaa gtaacatcaa aaattactgc atcatatttt cgcagaatac caacctggca   720

ccagtgccct attcagacta agcagctttc cattccaaaa ataccagtag cctaactaag   780

cgagatgcaa gcgaaatgcg agatgaaatg aaacccaaat aaaaaaaaaa agacacaaac   840

aaacaggaac aaaattgcgc gtttttcccc acagaacagc acgtaatgtg taccgttttt   900

tgtttttcgt ttcaagtaca aaaaaaacaa aaaacggtac gctgttcacg tgtctgaaaa   960

accaggaacc gtaaaaggat attccgttag ccaacaaaaa aataggtaaa aagggaaaaa  1020

aaaatccaag gcactgtatt ctgtatatgt taactctgca aatccaaatt caatctaaat  1080

tgggaaaaac gtgcctgtat ttttgtcctg gtgatgcccg ttttaatatc gcacgttgtc  1140

aagatatacg ctgtgagatt ttcttttcct tcactattat atatcaggaa aatacgaaaa  1200

aaatcacagg tatgttccta tcgcagttta aggggattca tttctcaaat ggtttcgtga  1260

gcatttaaat actgggttat gttttctcat gtatggagct attctattat tctagttatg  1320

aggctatgat tttgtgcaac tttttttttt tttagatctt cttattatgt gatttattaa  1380

catacatata tatttatata taattagcat cagcaatttt tttcggactg tcagaaggaa  1440

atctttaact gaagccttag gaggtaaccc agcgtgccat aagctttacc gtatttgccg  1500

ccgtttgaaa tactcaatat tcatgatggt tgtaaggcgt tttttatcag cttcgcgata  1560

taatatgcca tcttttaggt ccaggcccgt tctcttagct atctttggtg tctgtgctac  1620

cgtgatatgg tacctattct ttttccagtc taatctgaag atggcagatt tgaaaaaggt  1680

agcaacttca aggtatcttt cacaagaacc gtcgttatca gaacttatgt caaatgtgaa  1740

gatcaagcct attgaagaaa ccccggtttc gccattggag ttgattccag atatcgaaat  1800

atcgactaga aagaaatacg atgcgtcgtg ggatctgttg ttccgtggta gaaaatataa  1860

atcgttcaac gattatgatc ttcatacgaa atgtgagttt tatttccaga atttatacaa  1920

tttgaacgag gattggacca ataatattcg gacgttcact ttcgatatta acgatgtaga  1980

cacgtctacg aaaattgacg ctcttaaaga ttccgatggg gttcaattgg tggacgagaa  2040

ggctatacgt ttatacaaga gaacgcataa cgttgccttg gctacggaaa ggttacgtct  2100

ttatgataaa tgttttgtca atagtccagg ttcaaaccca ttgaaaatgg atcacctttt  2160

cagatcgaac aagaagagta agactacggc tttggatgac gaagtcactg ggaaccgtga  2220

tacttttacc aagacgaaga aaacttcgtt cttaagcgat atggacacga gtagtttcca  2280

gaagtacgat caatgggatt tcgaacatag aatgttcccc atgatcccat atttcgagga  2340

acacaatttc accaacgtga tgcctatttt caccggctca aacggtgggg aacctttacc  2400

tcaagggaaa ttcccggtat tagatccaaa atccggtgaa ttgttacgtg tagagacttt  2460

cagatatgat aaatcgaaat cgctttggaa gaactggaat gatatgtcct ctgcttctgg  2520

taaacgtggt attatcttgg ctgctggcga cggccaagtg gaccaatgca tccgtcttat  2580

tgctacgttg agagctcaag gaaacgctct acctattcaa attatccaca acaaccaatt  2640

gaatgagaaa tctgtgaaac tgttatcgga ggccgctaaa tctaccgaat tctcatccgg  2700

tagagctcaa tctctttggt tagtgaatgt gggccccacg ttggaatctt caatgaagag  2760

caattttggg agatttaaga ataagtggtt gtcagttatt ttcaacactt ttgaagaatt  2820

tatattcata gatacagatg ccatctccta cattaatatg gctgattatt tcaacttcaa  2880

ggagtacaaa tctactggaa cactcttctt taaggatagg tctttggcaa ttggaactga  2940

acagaaatgt ggtcctttgt tcgaaactct tgaaccaaga attcttgaaa tgtactattt  3000

caatacttta cctatgatca atggtgatta cgtggaacag caatgtatgg gcatgctcac  3060

cccagaggaa aaagtttaca aacgtttctt tgaagttggt catcaacaca acttggaaag  3120

tggattattg gccatcaaca aaaacgaaca catcatggga ttggttactg caacagtctt  3180

aaatatcgca ccaaaggtcg gaggttgcgg ttggggtgac aaagagtttt tctggcttgg  3240

tttgttggtt gctggccaac gctactcgat ctatgatata gatgcaagtg caattggtgt  3300

tcctcaacag aagcaatcta tcgctaacgg agacgaattt gatgaatata ggatttgttc  3360

tttacaagtg gcacatactt catacgacgg acatttacta tggataaatg gtggctctca  3420

gtactgtaag aaaccagaga cttttgaagg tgattggacc aacattaagg agcttcgtga  3480

atcgtattct gatgataaag aaaaggctct gaaggcttat agtgatacag ttaaggtgga  3540

agcagcaatc gtgccagatt ccagaagtaa tggttggggt agagacgatc aaagatgtaa  3600

aggctacttc tggtgcggca aatttacttc aaagctgaaa ccgtatactt ataacacggt  3660

ggtaactaaa ggtgatttga tccgtttcgg agacgaggaa atcgaaagta tctccaagat  3720

taataagatc tggaatgatg ctattattcc agacggagct taatttcacg gtttaaggat  3780

atagtcgcaa gaaacgtttt aaatttccct ttttttttct gttcgtttat atttccgtcg  3840

ccctatcttt ccacaatcga gcttgataac acacctccct cgagctagct taagcttaca  3900

ctgcataaag tctgctcgta caactcaaat cgcaataccc ccgagcatac ggttacatca  3960

ggtcattctt ttggtctaca tgtagccatt atttttatga gctgtcgtaa gtatttactg  4020

cgaactagta tctcaacatt caaatgttag ctttgatctt tagaaagcat ttttgtaata 4080

ttaaaacata catgtatagt accaagaggt attattaatc tgaatcacta cacaatacca 4140

tgggtagcac tcagcatatt ttcaatatta catggctttt acctagtagc ctgaatcttc 4200

aaatcgatgt gtttcttgat attttggttg ggtaattttg ttctgtacat taaaacatat 4260

atagatatat gattgaatta aagttcgtca ttttacagag atcagaattg gaaaaagcct 4320

tggtcttcca agaacaagac cactctttgt acaatgtgta agatgttctt gtcttcagtt 4380

tccagtggaa tatcggatcc cgattcttca cctatcttga acacgttagt gcccttcaaa 4440

gaggaagcat tttgtaagat tagaccggtt ccacttctaa cgaaatcagg gacaagagct 4500

agaatttctt cattgttgcc atgttccaaa accttgtagt gtctaccacc accatattgt 4560

aagaaagtag acaataaagc agtctttagt tgagccggta aagtttctga caagacaaga 4620

gcgaaacctt gtttaggtct tgaagggttt gattccctca aaatcttgac gacttctgga 4680

taagagaacc atgctggaat ttcaccacca tctctcaatc tgtttctcaa ttcagttcca 4740

ctgatattca aagttcttgt cttgtcagta tcaatttcat caattggagc atatctgtct 4800

tcatctggta ggtatgtaac cattctgaat ggaacaactt cgatatccaa ttcgtttttg 4860

taggattcga ctaattcttg agcgtcgtat ggaccataga agtcaacacc cttggagttc 4920

ttaccaggac cggcatggtc tctaccaacg atgaaatgtg aagcaccata attctttcta 4980

ataattgcat gccaaacagc ttctctgtca ccacccattc tcatagcaag tggcaacagg 5040

gacaattgag ccatgccgtt agggtatctt ttgatgattt cttggtagac cctaactctt 5100

gtatggtggt caatgtcacc tggtttcgtt agacccacca ctgggtgaat taggatctta 5160

gagttgtttg atctagcagc acgcacagtc aattctctgt gtgctctatg cattgggttt 5220

cttgtttgga aagccacgac acgatcccat tgcttggatt cgaattcaag tctcaattga 5280

gctggggtct ttctccaacc tggataatca taatgaacag gcaattgaat agcctctaaa 5340

gaaccaccga cataaaattc gccagcttgt tcgaataaat atttcacggc tggatgttct 5400

ggatcacctc tgaacacctt cttggcttca acggctacgc gtttatcagg ttgataaaca 5460

tcactgaccg ttaagattgc caatgggaac tcattgtcct ggagcaagac aatacgttgg 5520

tctggactca attgagaagc aaattcagca tccacgtcca atgtgattgg aatggtccaa 5580

actaaaccgt tttgaagacg agatttttca acgacagatt gataatcttg ttggttaagg 5640

aacccatcca aaggagaaaa cccaccattc aagatcaa                         5678

<210>3

<211>2253

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>3

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt     60

gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa    120

gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt    180

gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgtagctgat     240

gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca     300

gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct     360

gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg     420

agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa     480

aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc     540

tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc     600

tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag     660

agactcaaat gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagtg     720

gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca     780

gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac     840

agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaggatt cgatctccag taaactgaag     900

gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat     960

gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc    1020

aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga    1080

aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact    1140

ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa    1200

tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaactgtga gctttttaag    1260

cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc    1320

caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa    1380

tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc    1440

ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt cacaaaatgc    1500

tgcacagagt ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca    1560

tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt    1620

tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagcttgt gaaacacaag    1680

cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag    1740

aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt    1800

gctgcaagtc aagctgcctt aggccttggt ggtggtggat ccgcacccgc ccgctcgccc    1860

agccccagca cgcagccctg ggagcatgtg aatgccatcc aggaggcccg gcgtctcctg    1920

aacctgagta gagacactgc tgctgagatg aatgaaacag tagaagtcat ctcagaaatg    1980

tttgacctcc aggagccgac ctgcctacag acccgcctgg agctgtacaa gcagggcctg    2040

cggggcagcc tcaccaagct caagggcccc ttgaccatga tggccagcca ctacaagcag    2100

cactgccctc caaccccgga aacttcctgt gcaacccaga ctatcacctt tgaaagtttc    2160

aaagagaacc tgaaggactt tctgcttgtc atcccctttg actgctggga gccagtccag    2220

gagggtggag gtcaccacca tcaccatcac taa                                 2253

Claims (10)

1、一种重组克鲁维酵母菌，是能作为表达如下低糖基化糖蛋白的宿主的重组菌，所述低糖基化糖蛋白的50％以上的N-糖链上的单糖数不大于20个，较优的是不大于16个，最优的是不大于11个的糖蛋白。

2、根据权利要求1所述的重组克鲁维酵母菌，其特征在于：所述重组克鲁维酵母菌，是将克鲁维酵母菌中的α-1，6-甘露糖转移酶基因或/和α-1，3-甘露糖转移酶基因灭活得到的重组菌。

3、根据权利要求1或2所述的重组克鲁维酵母菌，其特征在于：所述克鲁维酵母菌是乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、鹰嘴豆克鲁维酵母、保加利亚克鲁维酵母、耐温克鲁维酵母或马克思克鲁维酵母菌。

4、根据权利要求3所述的重组克鲁维酵母菌，其特征在于：所述克鲁维酵母菌为乳酸克鲁维酵母菌，优选为乳酸克鲁维酵母菌ATCC8585；

所述重组克鲁维酵母菌为KLGE02或KLGE03，所述KLGE02的保藏号为CGMCC No.2400，KLGE03的保藏号为CGMCC No.2401。

5、一种重组载体，是能够敲除克鲁维酵母菌的甘露糖转移酶基因的重组酵母表达载体，所述甘露糖转移酶为α-1，6-甘露糖转移酶或α-1，3-甘露糖转移酶。

6、根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述能够敲除克鲁维酵母菌的甘露糖转移酶基因的重组酵母表达载体是在酵母表达载体的多克隆位点插入有所述甘露糖转移酶基因的上游侧翼同源区和下游侧翼同源区的重组酵母表达载体；

当所述甘露糖转移酶为α-1，6-甘露糖转移酶时，所述甘露糖转移酶基因的上游侧翼同源区为如下a)或b)的DNA片段，所述甘露糖转移酶基因的下游侧翼同源区为如下c)或d)的DNA片段：

a)大小为至少200bp的DNA片段，该DNA片段选自α-1，6-甘露糖转移酶基因的起始密码子上游的染色体DNA序列；

b)在严格条件下与a)限定的DNA片段杂交的片段；

c)大小为至少200bp的DNA片段，该DNA片段选自α-1，6-甘露糖转移酶基因的终止密码子下游的染色体DNA序列；

d)在严格条件下与c)限定的DNA片段杂交的片段；

当所述甘露糖转移酶为α-1，3-甘露糖转移酶时，所述甘露糖转移酶基因的上游侧翼同源区为如下1)或2)的DNA片段，所述甘露糖转移酶基因的下游侧翼同源区为如下3)或4)的DNA片段，

1)大小为至少200bp的DNA片段，该DNA片段选自α-1，3-甘露糖转移酶基因的起始密码子上游的染色体DNA序列；

2)在严格条件下与1)限定的DNA片段杂交的片段；

3)大小为至少200bp的DNA片段，该DNA片段选自α-1，3-甘露糖转移酶基因的终止密码子下游的染色体DNA序列；

4)在严格条件下与3)限定的DNA片段杂交的片段。

7、根据权利要求5或6所述的重组载体，其特征在于：

当所述甘露糖转移酶为α-1，6-甘露糖转移酶时，所述甘露糖转移酶基因的上游侧翼同源区为如下A)或B)的DNA片段，所述甘露糖转移酶基因的下游侧翼同源区为如下C)或D)的DNA片段：

A)序列表中序列1的自5′末端第121-2119位脱氧核糖核苷酸组成的DNA分子；

B)在严格条件下与A)限定的DNA片段杂交的片段；

C)序列表中序列1的自5′末端第3276-5469位脱氧核糖核苷酸组成的DNA分子；

D)在严格条件下与C)限定的DNA片段杂交的片段；

当所述甘露糖转移酶为α-1，3-甘露糖转移酶时，所述甘露糖转移酶基因的上游侧翼同源区为如下I)或II)的DNA片段，所述甘露糖转移酶基因的下游侧翼同源区为如下III)或IV)的DNA片段：

I)序列表中序列2的自5′末端第102-1480位脱氧核糖核苷酸组成的DNA分子；

II)在严格条件下与I)限定的DNA片段杂交的片段；

III)序列表中序2的自5′末端第3897-5436位脱氧核糖核苷酸组成的DNA分子；

IV)在严格条件下与III)限定的DNA片段杂交的片段。

8、根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：所述酵母表达载体为pYES2酵母表达载体。

9、一种构建权利要求1、2、3或4所述克鲁维酵母菌的方法，是将权利要求5、6、7或8中任一所述重组载体导入克鲁维酵母菌中获得重组菌。

10、权利要求1、2、3或4所述的克鲁维酵母在生产外源糖蛋白中的应用；所述的外源糖蛋白包括：细胞因子、凝血因子、免疫球蛋白、内皮生长因子、生长激素释放因子、生长因子、人血管抑制素、组织纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂、尿激酶、流感病毒神经氨酸酶、血细胞凝集素、唾液酸转移酶、HIV胞膜蛋白、肠激酶、疱疹病毒I型糖蛋白D，以及这些蛋白的融合蛋白。

Images