CN103060367A

CN103060367A - 一种离体高效构建多拷贝乳酸克鲁维酵母表达载体的方法

Info

Publication number: CN103060367A
Application number: CN201210587460XA
Authority: CN
Inventors: 马立新; 赵西选; 刘晓倩; 李晔星; 王亚平; 姚永兰
Original assignee: HUBEI HUAGUOSHAN INDUSTRIAL Co Ltd; Hubei University
Current assignee: HUBEI HUAGUOSHAN INDUSTRIAL Co Ltd; Hubei University
Priority date: 2012-12-29
Filing date: 2012-12-29
Publication date: 2013-04-24

Abstract

本发明提出了一种离体高效构建多拷贝的乳酸克鲁维酵母表达载体的方法，步骤为：1）根据乳酸克鲁维酵母KluyveromyceslactisGG799的载体pKLAC₂基因序列，设计合成PCR用的10个引物；2）合成四个限制性内切酶位点的酵母表达核式结构的基因片段；3）构建表达载体BpKLAC₂；4）用限制性内切酶酶切验证重组载体的正确性；5）在表达载体BpKLAC₂上插入目的基因成为含有目的基因的单拷贝表达载体；6）应用生物砖法，离体多拷贝表达载体。应用本发明能够提高乳酸克鲁维酵母表达目的蛋白质基因的表达量和稳定性。

Description

一种离体高效构建多拷贝乳酸克鲁维酵母表达载体的方法

技术领域

本发明涉及的是乳酸克鲁维酵母表达载体，特别是一种离体高效构建多拷贝的乳酸克鲁维酵母表达载体的方法，可人为控制外源基因插入拷贝数并且可用于基因剂量效应研究，是酵母表达载体的一种有利的改造。

背景技术

近年来，酵母表达系统引起了广泛的重视, 并逐渐被用于药用蛋白质的生产。它既有像原核细胞系统生长快、便于基因操作和可以被大规模培养等优点, 同时又有真核细胞具备的翻译后加工、糖基化修饰能力, 能生产有生物活性的重组蛋白等诸多特点。作为最简单的真核生物之一, 乳酸克鲁维酵母培养成本低廉, 已长期用于工业规模生产。其表达水平高, 工程株构建周期短, 表达系统不含任何病毒来源的元件, 不产生内毒素。乳酸克鲁维酵母还具有真核细胞的大部分翻译后修饰功能, 包括简单的糖基合成功能。为了获得外源蛋白的最大表达，研究者们致力寻找高效的工业化菌株。目前所熟知的商业化菌株 GG799 是乳酸克鲁维酵母野生单倍型菌株, 已应用于食品工业之中, 具有较良好的蛋白合成与分泌能力。乳酸克鲁维酵母常用的表达载体有：pKLAC₂ 。

乳酸克鲁维酵母常用的表达系统仍然无法满足日趋增长的产量需求，它的表达量和稳定性都有待提高。

于是基于分子水平上的各种载体改造成为新的出路。T. Knight建立了一套新的的克隆策略并将其命名为“生物砖”，这种克隆策略可以使生物组件之间能够标准化装配，跟传统的机械制造一样，各种组件之间具备相应的标准接口，可以以标准的方式将这些组件进行连接然后装配并形成更大的组件。每个生物砖都是一段特殊的DNA，它包含特定的信息以及编码相对应的信息都具有特定功能。例如，一段特殊的DNA可能是启动子，核糖体结合位点，编码蛋白质的序列，终止子等其中之一，也可能是这些基本部件的组合体。某些特定的酶切位点一般包含在每个生物砖的上游及下游，需要通过传统的酶切连接反应，就可以将任意一个标准化后的生物砖组件和其他的生物砖组件按照人们的意愿进行组合，并且新的组合序列依然可以用于下一个组合，仍然是标准化的生物砖组件。不断重复这样的操作，可以利用简单的手段，从最简单的组件开始建立，最终可以构建大规模的复杂系统。简单的说，生物砖就是一段DNA，这段DNA含有特殊酶切位点和特定功能。一个标准化的生物砖有三个重要部分组成：前缀(prefix)，主体(body)和后缀(suffix)。其中主体部分是一段可以发挥特定功能的DNA序列，可以是调节基因，也可以是编码蛋白质基因或终止子等，也可以是它们之间的组合。其中含特殊酶切位点的序列包括在前缀（prefix）和后缀（suffix）中，起到类似于传统机械制造中接口的作用。

应用基因改造和生物砖技术能够提高乳酸克鲁维酵母表达蛋白质基因的表达量和稳定性。

发明内容

本发明的目的是通过基因工程的手段构建能够人工选择插入外源基因拷贝数的表达载体，并成功表达甘露聚糖酶，提供研究乳酸克鲁维酵母中基因剂量效应与蛋白表达水平关系的技术方法。

本发明是这样实现的。其步骤为：

1、设计合成PCR引物。根据商品化的乳酸克鲁维酵母 Kluyveromyces lactis GG799的载体pKLAC₂基因序列，设计合成PCR用的10个引物（见表1）。

表格

引物名称	序列
		1	5'tattacgtaggatcccctaggGCGGGAGTCAGTGGGCCG 3'
2	5'AGTCGATCCTCGCGGGAAATTTAGGAATTTTAAACTTGGGCTTG 3'
		3	5'AAATTCCTAAATTTCCCGCGAGGATCGACTCATAAAA 3'
4	5'AAAACATAACGTAACTAAAGGTGTTCACCA 3'
		5	5'gcggccgcAAGCAGCAGATTACGCGCAGAA 3'
6	5'gaattccggaccgAATTTCAGGTGGCACTTTTCGG 3'
		7	5'CTGAAATTCGGTCCGGAATTCCCTGCAGGTAATTAAATAAAGGCCTTG 3
8	5'tattgtacagtcgacactagtCCCGGAAACAACAAAAGGATGAT 3'

2、合成四个限制性内切酶位点的酵母表达核式结构的基因片段；分别用引物1和2、3和4、7和8为引物，pKLAC₂质粒为模板，PCR合成片段a、b、d（对应基因序列表NO 1、2、4），用琼脂糖凝胶电泳回收；再以引物1和4为上下游引物，将DNA片段a、b按1:1比例为模板，PCR合成大片段AB(对应基因序列表NO 5)。以引物5和6为引物，pET30a质粒为模板，PCR合成片段c（对应基因序列表NO 3），用琼脂糖凝胶电泳回收。以引物5和8为上下游引物，将DNA片段c和d按1:1比例（各0.5μl）为模板，PCR合成大片段CD（对应基因序列表NO 6）。DNA片段AB和CD琼脂糖凝胶电泳回收备用。

以上PCR条件为98℃，2min，1 cycle; 98℃，7s，55℃，30s，72℃，1min, 30cycle；72℃，8min, 1 cycle；4℃保存。

3、构建表达载体BpKLAC₂；用限制性内切酶SnaBⅠ酶切载体pKLAC₂和第2步的片段AB，3h，然后电泳检测，酶切完全后琼脂糖凝胶回收；再将产物用限制性内切酶HindⅢ酶切3h，琼脂糖凝胶电泳回收；将经两步酶切后所得片段和载体按3:1比例混合，用TAKARA公司的连接试剂盒SolutionⅠ连接酶酶连2h，常规转化入大肠杆菌感受态细胞DH10β，涂布含氨苄西林钠的LB平板，37℃培养12h；随机挑选菌落，抽质粒，以此为模板，采用PCR的方式筛选重组质粒；以引物1和4为引物PCR，鉴定重组阳性克隆，命名Bp-lac₄；用限制性内切酶NotⅠ酶切载体Bp-lac₄和片段CD，琼脂糖凝胶电泳回收后将所得产物用限制性内切酶BsrGⅠ酶切3h，琼脂糖凝胶电泳回收后得到所需载体和片段，按照载体：片段=1:3的比例用SolutionⅠ连接酶酶连2h，常规转化入大肠杆菌感受态细胞DH10β，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃培养12h，长出菌落以引物5和6、经PCR验证全为所需阳性克隆，将该重组载体命名为BpKLAC₂（对应基因序列5）；

以上PCR条件为98℃，2min，1 cycle; 98℃，7s，55℃，30s，72℃，1min, 30cycle；72℃，8min, 1 cycle；4℃保存；

4、用限制性内切酶酶切验证。分别用限制性内切酶BInⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ、SalⅠ单酶切载体BpKLAC₂，均可线性化载体，验证重组载体的正确性。

5、在表达载体BpKLAC₂上插入目的基因成为含有目的基因的单拷贝表达载体。

6、应用生物砖法，离体多拷贝表达载体。

利用本发明表达的目的基因蛋白可以是甘露聚糖酶，植酸酶，或者其他需求GRAS级别宿主菌的蛋白。

本发明具有明显的优点：可通过简单的酶切酶连反应人工串联含有目的基因的表达核式结构，提高其拷贝数，以达到提高蛋白表达水平。

附图说明

图1 一个标准化的生物砖有三个重要部分组成：前缀(prefix)，主体(body)和后缀(suffix)。

图2 载体BpKLAC₂图谱。包括表达核式结构、筛选标记、在大肠杆菌中复制所需的元件。其中表达核式结构又包括启动子（P _LAC4- PBI ），信号肽α-MF，MCS以及NotⅠ和CpoⅠ酶切位点之间部分填充片段卡那霉素核式结构。

图3 表达载体BpKLAC₂-manB的构建过程

图4为1-4拷贝摇瓶诱导第3天上清的SDS-PAGE。M：Unstained Protein Molecular Weight Marker；Lane 0：Kluyveromyces lactis GG799/ BpKLAC₂空白对照。Lane 1-4：Kluyveromyces lactis GG799/ GG799-Bp-Bman×1、GG799-Bp-Bman×2、GG799-Bp-Bman×3和GG799-Bp-Bman×4。

具体实施方式

下面是实例对本发明进一步说明。

实施例1 上述方式构建表达载体BpKLAC₂。

实施例2 构建含有甘露聚糖酶基因重组载体GG799-Bp-Bman。

、选择枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的甘露聚糖酶基因为目的基因；

2、合成引物。用GeneTool软件设计表格2中引物，合成备用。

引物名称	序列
		Bman-f	5'atagcggccgcAAACCAATTGAAGCGCATACTGTGT 3
Bman-r	5'atacggtccgTTACTCAACGATTGGCGTTAAAGAATC 3

表格

3、表达载体的构建。分别将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的甘露聚糖酶基因用引物Bman-f和Bman-r进行PCR（98℃，2min，1 cycle; 98℃，7s，55℃，30s，72℃，1min, 25cycle；72℃，8min, 1 cycle；4℃保存）扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳回收后依次用限制性内切酶NotⅠ和CpoⅠ酶切，回收后连接到经NotⅠ和CpoⅠ酶切后的表达载体BpKLAC₂上，构建成重组质粒BpKLAC₂-manB。

4、将测序正确且读框正确的重组质粒用SacⅡ酶切线性化，所得产物回收后经电击转化至Kluyveromyces lactis GG799 酵母感受态细胞，涂布YCB平板，28℃培养48小时，获得重组转化子。随机选取转化子，提基因组DNA，以其为模板Bman-f、Bman-r引物为引物进行PCR鉴定（98℃，2min，1 cycle; 98℃，7s，55℃，30s，72℃，1min, 25cycle；72℃，8min, 1 cycle；4℃保存）,扩增产物为1.1kb的转化子即为阳性克隆。将正确的克隆命名为GG799-Bp-Bman。

5、将转化子GG799-Bp-Bman接种于YPGal培养基中，28℃、200 r/min培养，分别取48 h，72 h，96 h表达上清液进行SDS?PAGE电泳，分析不同时段的蛋白质表达水平。选择较好的结果。

实施例3

1、用限制性内切酶BamHⅠ和SpeⅠ双酶切实例2的载体BpKLAC₂-manB，得到含有粘性末端的生物砖主体，命名为片段1。用限制性内切酶BInⅠ和SalⅠ双酶切载体BpKLAC₂-manB，得到含有粘性末端的生物砖主体，命名为片段2，用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切载体BpKLAC₂-manB，得到含有粘性末端的生物砖结构载体片段3。

将片段1、片段2和片段3按3：3: 1比例混合（片段1、2为1.5μl，片段3为0.5μl），用TAKARA公司的连接试剂盒SolutionⅠ连接酶酶连2h，常规转化入大肠杆菌感受态细胞DH10β，涂布含氨苄西林钠的LB平板，37℃培养12h。随机挑选菌落，提取质粒，用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切验证是否为双拷贝阳性克隆。进一步PCR验证是否为阳性克隆，以Bman-f、Bman-r引物为引物进行PCR鉴定（98℃，2min，1 cycle; 98℃，7s，55℃，30s，72℃，3min, 25cycle；72℃，8min, 1 cycle；4℃保存），产物含有1.1kb和2.2kb扩增片段的即为阳性克隆，命名为BpKLAC₂-manB×2。

2、以此往复，得到3拷贝和4拷贝载体BpKLAC₂-manB×3和BpKLAC₂-manB×4。

3、分别将载体BpKLAC₂-manB×2、BpKLAC₂-manB×3和BpKLAC₂-manB×4用SacⅡ酶切线性化，所得产物回收后经电击转化至Kluyveromyces lactis GG799 酵母感受态细胞，涂布YCB平板，28℃培养48小时，获得重组转化子。随机选取转化子，提基因组DNA，以其为模板Bman-f、Bman-r引物为引物进行PCR鉴定,扩增产物为1.1kb的转化子即为阳性克隆。将正确的克隆命名为GG799-Bp-Bman×2、GG799-Bp-Bman×3和GG799-Bp-Bman×4。

4、将转化子GG799-Bp-Bman×2、GG799-Bp-Bman×3和GG799-Bp-Bman×4分别接种于YPGal培养基中，28℃、200 r/min培养，分别取48 h，72 h，96 h表达上清液进行SDS?PAGE电泳，分析不同时段的蛋白质表达水平，选择较好的结果。

本发明中用于转化大肠杆菌感受态细胞DH10β购置于Invitrogen公司，Kluyveromyces lactis GG799 感受态细胞和pKLAC2质粒均由本实验室保存，YCB培养基购于New England BioLabs公司，限制性内切酶（BInⅠ、BamHⅠ、BsrGⅠ、CpoⅠ、HindⅢ、NotⅠ、SacⅡ、SnaBⅠ、SpeⅠ、SalⅠ等）购自Promega公司， SolutionⅠ酶购于TaKaRa公司，DNA聚合酶来自本实验室，所有引物均由上海桑尼生物公司合成。

Claims

1. 一种离体高效构建多拷贝的乳酸克鲁维酵母表达载体的方法，其特征在于其步骤为：

1）、设计合成PCR引物；根据商品化的乳酸克鲁维酵母 Kluyveromyces lactis GG799的载体pKLAC₂基因序列，设计合成PCR用的10个引物：

引物名称序列 1 5'tattacgtaggatcccctaggGCGGGAGTCAGTGGGCCG 3' 2 5'AGTCGATCCTCGCGGGAAATTTAGGAATTTTAAACTTGGGCTTG 3' 3 5'AAATTCCTAAATTTCCCGCGAGGATCGACTCATAAAA 3' 4 5'AAAACATAACGTAACTAAAGGTGTTCACCA 3' 5 5'gcggccgcAAGCAGCAGATTACGCGCAGAA 3' 6 5'gaattccggaccgAATTTCAGGTGGCACTTTTCGG 3' 7 5'CTGAAATTCGGTCCGGAATTCCCTGCAGGTAATTAAATAAAGGCCTTG 3 8 5'tattgtacagtcgacactagtCCCGGAAACAACAAAAGGATGAT 3'

2)、合成四个限制性内切酶位点的酵母表达核式结构的基因片段；分别用引物1和2、3和4、7和8为引物，pKLAC₂质粒为模板，PCR合成片段a、b、d，用琼脂糖凝胶电泳回收；再以引物1和4为上下游引物，将DNA片段a、b按1:1比例为模板，PCR合成大片段AB，以引物5和6为引物，pET30a质粒为模板，PCR合成片段c，用琼脂糖凝胶电泳回收；以引物5和8为上下游引物，将DNA片段c和d按1:1比例为模板，PCR合成大片段CD、DNA片段AB和CD琼脂糖凝胶电泳回收备用；

3）、构建表达载体BpKLAC₂；用限制性内切酶SnaBⅠ酶切载体pKLAC₂和第2步的片段AB，3h，然后电泳检测，酶切完全后琼脂糖凝胶回收；再将产物用限制性内切酶HindⅢ 酶切3h，琼脂糖凝胶电泳回收；将经两步酶切后所得片段和载体按3:1比例混合，用TAKARA公司的连接试剂盒SolutionⅠ连接酶酶连2h，常规转化入大肠杆菌感受态细胞DH10β，涂布含氨苄西林钠的LB平板，37℃培养12h；随机挑选菌落，抽质粒，以此为模板，采用PCR的方式筛选重组质粒；以引物1和4为引物PCR，鉴定重组阳性克隆，命名Bp-lac₄；用限制性内切酶NotⅠ酶切载体Bp-lac₄和片段CD，琼脂糖凝胶电泳回收后将所得产物用限制性内切酶BsrGⅠ酶切3h，琼脂糖凝胶电泳回收后得到所需载体和片段，按照载体：片段=1:3的比例用SolutionⅠ连接酶酶连2h，常规转化入大肠杆菌感受态细胞DH10β，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃培养12h，长出菌落以引物5和6、经PCR验证全为所需阳性克隆，将该重组载体命名为BpKLAC₂；

4）、用限制性内切酶酶切验证重组载体的正确性；

5）、在表达载体BpKLAC₂上插入目的基因成为含有目的基因的单拷贝表达载体；

6）、应用生物砖法，离体多拷贝表达载体。