CN108949602B - 一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌株S8‑H，通过将来源于黑曲霉CICC2462菌的木聚糖酶xynB基因构建表达盒，利用rDNA整合法构建得到8拷贝木聚糖酶基因菌株，木聚糖酶表达量325U/mL，通过转化pYES6‑PGK‑HAC1片段到该菌株得到过表达HAC1 8拷贝木聚糖酶酿酒酵母工程菌，木聚糖表达量达到381U/mL，过表达HAC1提高了与内质网蛋白折叠相关基因表达水平，同时本发明提供了一种酿酒酵母菌分泌表达多拷贝外源基因的模型，可利用该模型构建表达其他基因,本发明所提供的高产木聚糖酶酿酒酵母菌株可优势的应用于秸秆降解，饲料制造过程中。

Description

一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌及应用

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌株S8-H及其应用。

背景技术

木聚糖酶(xylanase)是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶，它不仅在能源工业上可发挥巨大作用，在饲料、造纸、食品等领域也有着广阔的应用前景。而制约我国木聚糖酶生产与应用的主要限制性因素是缺乏能够与规模化生产相适应的高产菌株，因此，开发出具有我国自主知识产权的高产木聚糖酶新菌系迫在眉睫。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是美国食品与药品管理局(FDA)认定的一种安全菌株，是食品与饲用酶制剂表达的理想宿主。酿酒酵母生物学和遗传学背景清楚，既具有原核生物生长繁殖快、遗传操作简单的特点，又具有真核生物对外源蛋白进行翻译后修饰加工的能力，近年来，在外源基因表达方面得到了深入研究和广泛应用。

启动子是表达载体的一个重要元件，它是影响mRNA分子合成速率的主要因素之一，一个强的启动子能有利于载体表达更高水平的外源蛋白。信号肽是引导新合成肽链转移到内质网中的一段短肽，利用信号肽来引导新合成的外源蛋白定位分泌到细胞的特定区间，提高外源蛋白的可溶性。核糖体DNA(ribosomal DNA，rDNA)序列是指细胞核中编码核糖体RNA的DNA序列，它是一段高度重复序列，其重复单位由转录区段和非转录区段组成。在酿酒酵母的XII染色体中，rDNA存在100～140个重复单位。如果以酿酒酵母rDNA序列为整合位点，从理论上说，可以得到100～140个目的基因拷贝数。依赖于rDNA重复序列整合的外源基因导入酿酒酵母后，外源基因在酵母细胞内的表达会由于剂量效应而实现高效表达，但是否拷贝数越多，外源基因表达量越高还值得探讨。

在酿酒酵母表达系统中，非正确折叠蛋白的产生和积累，尤其是多拷贝所导致的过表达蛋白不能正确折叠分泌出细胞，积累于内质网上，诱发内质网相关的蛋白降解(ERAD)途径，进而被ER蛋白酶降解，这是影响外源蛋白高效表达的核心与关键。HAC1基因是UPR通路中的转录调控蛋白，能作用于大量与蛋白折叠和组装相关的分子伴侣。为了增强外源基因的表达量，制备分泌型的基因表达盒，得到木聚糖酶基因的最优拷贝量，同时选择优势的调控基因去增强内质网蛋白折叠相关基因表达水平，成为目前的研究热点及难点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌株S8-H，本发明通过将来源于黑曲霉CICC2462菌的木聚糖酶xynB基因构建表达盒，利用rDNA整合法构建得到8拷贝木聚糖酶基因载体，通过连接过表转录因子HAC1基因得到优化的8拷贝木聚糖酶酿酒酵母木聚糖酶菌株。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌株S8-H，其特征在于：

1、重叠延伸PCR法构建PαXC表达盒

以黑曲霉CICC2462菌种扩增木聚糖酶xynB基因，以S.Cerevisiae INVSc1基因组DNA为模板扩增Phosphoglycerate kinase(PGK)启动子序列，以pPIC9K质粒为模板扩增分泌信号肽alpha-factor(α-factor)序列，以pSH65质粒扩增终止子CYC1序列，利用重叠延伸PCR的方法将四段序列串联成PGK-α-factor-xynB-CYC1(PαXC)表达盒，将PαXC表达盒连接至pMD19-T载体，转化感受态大肠杆菌DH5α，提取pMD19-T-PαXC质粒测序验证序列是否正确，其核苷酸编码序列如SEQ ID NO：9；

2、S.Cerevisiae INVSc1-pYES2-PαXC-rDNA工程菌的构建

对pMD19-T-PαXC和pYES2分别双酶切后连接转化感受态大肠杆菌DH5α，得到pYES2-PαXC载体，以S.Cerevisiae INVSc1基因组DNA为模板，扩增rDNA单元中的核心序列，对pYES2-PαXC和pMD19-T-rDNA分别经SnaBI单酶切后，回收目的片段，T4连接酶连接，测序验证，得到pYES2-PαXC-rDNA表达载体，对pYES2-PαXC-rDNA载体经SphI在rDNA位置进行线性化后，采用LiAc/ssDNA法转化感受态S.Cerevisiae INVSc1，转化后体系涂布于SC-U培养基，3-5d后长出单菌落；

3、微滴数字PCR鉴定转化子拷贝数

将的阳性转化子，接种于YPD培养基中，培养48h后，收集菌体，用Omega酵母基因组提取试剂盒提取DNA，以DNA为模板，ATC1基因为内参，利用BIO-RADQX200数字液滴PCR进行xynB基因拷贝数鉴定，并使用软件QuantaSoft V1.3.2.0分析分析实验数据，获得绝对定量结果，选择8拷贝菌株；

4、过表达HAC1 8拷贝木聚糖酶酿酒酵母工程菌的构建

以S.Cerevisiae INVSc1基因组DNA为模板，扩增PGK启动子序列，经HindIII和BamHI双酶切连接到pYES6载体上，得到pYES6-PGK载体，将酿酒酵母INVSc1菌株接种至YPD液体培养基，30℃摇床过夜培养至对数生长期后，向培养液中加入灭菌的DDT溶液使培养液诱导6h，经DDT诱导后大量生成编码HAC1蛋白的mRNA，收集经DDT诱导后的酵母细胞，提取细胞总RNA，并反转录获得细胞的cDNA，以该cDNA为模板、扩增HAC1蛋白的编码基因，经双酶切后连接入pYES6-PGK载体，挑取阳性克隆测序验证，测序正确的质粒命名为pYES6-PGK-HAC1，将pYES6-PGK-HAC1线性化后转化8拷贝数的酿酒酵母木聚糖酶工程菌，以Blasticidin抗性为筛选标记进行转化子筛选，得到过表达HAC1 8拷贝木聚糖酶酿酒酵母工程菌S8-H，将得到的过表达S8-H菌株表达木聚糖酶做鉴定；

5、发酵产酶实验。

本发明获得的有益效果：

本发明提供了一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌株S8-H，1、本发明首先提供了一种木聚糖酶xynB基因PαXC表达盒，成功实现了木聚糖酶的分泌表达；2、本发明利用rDNA整合法提高外源蛋白在酵母中的高拷贝表达，并且得到最优基因拷贝数即8拷贝，酶活性为325U/mL；3、更特别地本发明创造性的使用HAC1基因提高木聚糖酶在多拷贝数情况的表达量，使木聚糖酶基因8拷贝量时木聚糖酶的产酶活性达到381U/mL，证明了过表达HAC1基因增强了内质网折叠组装木聚糖酶的功能从而进一步提高产酶能力，此方法为研究UPR机制和转录因子HAC1的功能提供依据；4、本发明所选的工程菌为酿酒酵母菌，遗传背景清晰，适合进行遗传操作；5、同时本发明提供了一种酿酒酵母菌分泌表达多拷贝外源基因的模型，可利用该模型构建表达其他基因；6、本发明所选酿酒酵母菌培养条件简单生长繁殖快且适合大规模发酵生产，酿酒酵母菌本身可作为一种蛋白类成分添加于饲料产品中，其表达外源蛋白过程中产生的“酒香味”有助于改良饲料产品的适口性；7、本研究所提供的一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌株S8-H能够在降解秸秆中得到很好的应用。

附图说明

图1：PαXC表达盒构建，M:2000DNA Marker,Lane 1:850bp PGK sequence,Lane 2:255bpα-factor sequence,Lane 3:984bp xynB gene sequence,Lane 4:260bpCYC1sequence,Lane 5:2365bp PαXC sequence。

图2：pYES2-PαXC载体构建，M1:5000DNA Marker,Lane 1:PMD19-T-PαXC doubleenzyme digestion,Lane 2:pYES2double enzyme digestion,Lane 3:pYES2-PαXC doubleenzyme digestion,Lane 4:pYES2-PαXC single enzyme digestion,M2:15000DNAMarker。

图3：pYES2-PαXC-rDNA载体构建，M1:15000DNA Marker,Lane 1:rDNA sequenceamplification,Lane 2:PMD19-T-rDNAsingle enzyme digestion,Lane 3:pYES2-PαXCsingle enzyme digestion,Lane 3:pYES2-PαXC-rDNA single enzyme digestion,M2:15000DNA Marker。

图4：重组酿酒酵母菌筛选A:Recombinant S.cerevisiae strains of pYES2-PαXC；B:Recombinant S.cerevisiae strains of pYES2-PαXC-rDNA。

图5：pYES6-PGK-HAC1表达载体构建，M:15000DNA Marker,Lane 1:pYES6doubleenzyme digestion,Lane 2:pYES-PGK double enzyme digestion,Lane 3:pYES6-PGK-HAC1single enzyme digestion

图6：S8-H菌株木聚糖酶纯化后SDS-PAGE电泳图，M:Protein Marker；Lane1:Purified xylanase protein

具体实施方式

实施例1重叠延伸PCR法构建PαXC表达盒

将黑曲霉CICC2462菌种(中国工业微生物菌种保藏中心)经PDA(成分为：200g马铃薯水煮液、20g葡萄糖、1.5g MgSO₄·7H₂O、1g KH₂PO₄、20g Agar，去离子水定容至1L)平板活化后，制备种子液，将种子液接种于液体发酵培养基(成分为：CaCl₂ 5g，KH₂PO₄ 26g，FeSO_4·7H₂O 0.16g，酵母膏10g，麸皮20g，MgSO_4·7H₂O 10g，Tween-80 5ml，pH5.0，蒸馏水1000mL)30℃、150rpm，培养72h后，收集菌体，用AXYGEN总RNA提取试剂盒提取RNA。用Taraka一步法反转录试剂盒合成cDNA，以扩增木聚糖酶xynB基因，上下游引物xynB-F和xynB-R核苷酸编码序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，以S.Cerevisiae INVSc1(购买于美国Invitrogen公司)基因组DNA为模板扩增Phosphoglycerate kinase(PGK)启动子序列，上下游引物PGK-F和PGK-R核苷酸编码序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；以pPIC9K质粒(购买于中国质粒菌种保藏中心)为模板扩增分泌信号肽alpha-factor(α-factor)序列,上下游引物α-factor-F和α-factor-R核苷酸编码序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；以pSH65质粒(购买于中国质粒菌种保藏中心)扩增终止子CYC1序列，上下游引物CYC1-F和CYC1-R核苷酸编码序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，利用重叠延伸PCR的方法将四段序列串联成PGK-α-factor-xynB-CYC1(PαXC)表达盒。各基因片段PCR条件如表1所示：

表1

PGK启动子序列大小为850bp，序列如SEQ ID NO：24，Genebank登记号AH001380，α-factor序列大小为255bp，SEQ ID NO：25，Genebank登记号KM032189，木聚糖酶成熟肽xynB基因序列大小为984bp，序列如SEQ ID NO：23，Genebank登记号FJ986225.1，CYC1终止子序列大小为254bp，序列如SEQ ID NO：26，Genebank登记号AF298780.1，对扩增的各序列经测序验证后，经过片段融合预实验，确定重叠延伸的最佳条件，最终得到全长为2365bp的融合片段命名为PαXC，核苷酸编码序列如SEQ ID NO：9，包含了PGK、α-factor、xynB和CYC1基因的序列，电泳条带结果如图1所示。

对pYES2载体和经重叠延伸PCR构建的PαXC表达盒，连接至pMD19-T载体(PMD19-T购于日本Takara公司)，T4连接酶连接过夜，连接体系转化感受态大肠杆菌DH5α，经菌液PCR验证后，阳性转化子提取质粒送至苏州金唯智生物科技有限公司测序，测序结果与原序列完全一致，说明载体构建成功如图2所示。

实施例2S.Cerevisiae INVSc1-pYES2-PαXC-rDNA工程菌的构建

以S.Cerevisiae INVSc1基因组DNA为模板，扩增rDNA单元中2300bp(Genebank登记号BK006945.2)的核心序列，核苷酸序列如SEQ ID NO：10，上下游引物rDNA-F和rDNA-R核苷酸编码序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，对pYES2-PαXC和pMD19-T-rDNA分别经SnaBI单酶切后，回收目的片段，T4连接酶连接，测序验证，得到pYES2-PαXC-rDNA表达载体如图3所示。对pYES2-PαXC-rDNA载体经SphI在rDNA位置进行线性化后，采用LiAc/ssDNA法转化感受态S.Cerevisiae INVSc1，转化后体系涂布于不含有尿嘧啶的营养缺陷型SC-U培养基(购买于日本Clonetech公司)，木聚糖酶活力筛选培养基采用木聚糖-刚果红培养基，20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉、10g/L木聚糖(Sigma公司)，18g/L琼脂和1％刚果红，于30℃培养箱培养，3-5d后长出单菌落，通过水解圈的大小对转化子产酶能力进行初步考察，pYES2-PαXC-rDNA筛选得到的转化子水解圈大小各异，产生了不同拷贝数基因表达盒串联的木聚糖酶重组菌，重组酿酒酵母菌筛选如图4所示。

实施例3微滴数字PCR鉴定转化子拷贝数

对于得到的阳性转化子，接种于YPD培养基中，包含20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉和10g/L葡萄糖，培养条件为30℃，培养48h后收集菌体，用Omega酵母基因组提取试剂盒提取DNA，以DNA为模板，ATC1基因为内参基因序列(885bp，Genebank登记号CP020126.1)核苷酸编码序列如SEQ ID NO：13。利用BIO-RAD QX200数字液滴PCR进行xynB基因拷贝数鉴定。ATC1上下游引物ATC1-F1和ATC1-R1的核苷酸编码序列如SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15，探针：5'-HEX-CATCTTCGTTAGCTTCATCCGACGCTA-BHQ-3'；上游引物xynB-F2和下游引物xynB-R2的核苷酸编码序列如SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，探针：5'-FAM-CCTGGTCAACTTTGCCCAGTCTAACAA-BHQ-3'。内参基因荧光标记基团为HEX，目的基因为FAM。微滴数字PCR反应包括配制体系、生成微滴、扩增循环和信号读取4个步骤。微滴数字PCR体系为20μL，包含10μL 2×ddPCR Master Mix，10μmol/L正向引物和反向引物各1μL、探针0.5μL，DNA模板2μL。生成微滴需要使用专门的微滴生成卡和微滴生成仪，将40μL PCR体系和70μL微滴生成油(droplet generation oil)加入微滴生成卡，覆盖专用胶垫后置入微滴生成仪，生成微滴。微滴数字PCR扩增使用两步法，设置程序如下：94℃，10min预变性；94℃变性15s，60℃退火60s，共45个循环，扩增结束后进行98℃、10min的热失活。每个模板重复3个平行检测。扩增结束后，将96孔板置入微滴读取仪中读取信号，并使用软件QuantaSoftV1.3.2.0分析分析实验数据，获得绝对定量结果。

首先以S.Cerevisiae INVSc1-pYES2-PαXC验证ddPCR的准确性(表2)，在FAM和HEX两个荧光通路下，检测的阳性微滴和阴性微滴的分布状况，图中阳性微滴和阴性微滴区分明显，系统可准确判读出阳性微滴和阴性微滴数目，检测的拷贝数为1.02、1.04和0.98，说明方法准确度高，结果可信。

表2

对S.Cerevisiae INVSc1-pYES2-PαXC-rDNA转化子拷贝数鉴定结果如表3所示，检测微滴数区间为10987-14683之间，均大于10000，能够符合泊松分布的原理，说明结果可信。鉴定得到的拷贝数分别为：2.11、2.98、5.04、、6.95、8.07、9.02、12.09、15.18、17.92、19.98和22.00，选取8拷贝数菌株命名为S8。

表3

实施例4过表达HAC1 8拷贝木聚糖酶酿酒酵母工程菌的构建及表达

以S.Cerevisiae INVSc1基因组DNA为模板，PGK-F1和PGK-R1核苷酸编码序列分别为SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19为引物扩增PGK启动子序列，经HindIII和B amHI双酶切连接到pYES6载体上，得到pYES6-PGK载体。由于HAC1基因本身因含有一段约250bp的内含子在正常酿酒酵母细胞中是不表达的，只有当蛋白质在内质网中积累、错误折叠时，该基因才会发生剪切，去掉内含子，表达有活性的HAC1蛋白，所以本研究用蛋白正确折叠抑制剂DTT诱导，使野生型酿酒酵母产生错误折叠蛋白，从而扩增得到激活形式的HAC1基因。将酿酒酵母INVSc1菌株接种至YPD液体培养基，30℃摇床过夜培养至对数生长期后，向培养液中加入灭菌的DDT溶液使培养液中DDT终浓度为5mmol/L，再将培养液放入30℃摇床诱导6h。经DDT诱导后的酵母细胞中会累积大量未折叠蛋白，引起细胞产生未折叠蛋白反应，大量生成编码HAC1蛋白的mRNA。收集经DDT诱导后的酵母细胞，提取细胞总RNA，并反转录获得细胞的cDNA，以该cDNA为模板、HAC1-F和HAC1-R核苷酸编码序列分别为SEQ ID NO：20和SEQ IDNO：21为引物大量扩增HAC1蛋白的编码基因，去除内含子后的HAC1序列大小717bp，Genebank登记号NM_001179935，序列如SEQ ID NO：27，经双酶切后连接入pYES6-PGK载体，挑取阳性克隆测序验证，测序正确的质粒命名为pYES6-PGK-HAC1，PGK-HAC1基因序列大小1567bp，序列如SEQ ID NO：22，构建载体的电泳图如图5所示。将pYES6-PGK-HAC1线性化后转化8拷贝数的酿酒酵母木聚糖酶工程菌，以Blasticidin抗性为筛选标记进行转化子筛选，得到过表达HAC1 8拷贝木聚糖酶酿酒酵母工程菌命名为S8-H。因表达载体上没有蛋白标签，蛋白纯化工作由长春申宇细胞生物有限公司代理服务，利用GE公司CIPP无标签蛋白纯化法进行纯化，S8-H菌株表达得到的木聚糖蛋白大小35KDa，如图6所示。

实施例5发酵产酶实验

将8拷贝木聚糖酿酒酵母菌S8和过表达HAC1 8拷贝木聚糖酶酿酒酵母工程菌S8-H接种于YPD培养基中，30℃、150rpm培养72h后，离心取上清，用DNS法测定木聚糖酶酶活力，具体方法见文献《黑曲霉FnD5-2产木聚糖酶液体发酵及酶学特性》，木糖标准曲线回归方程为：y＝0.1275x-0.07，R²＝0.9935。酶活力单位定义：在50℃，pH5.0的条件下，每分钟每毫升待测酶液分解底物释放出1μmol还原糖的量。

酶活力(U)＝D×V₁×C_X/T×V₂

D：酶液稀释倍数 V₁：比色管定容体积 C_X:木糖摩尔浓度(μmol/mL)

V₂：酶液体积 T：酶解时间

8拷贝菌株S8表达木聚糖酶达到325U/mL，通过过表达HAC1基因可以进一步提高S8木聚糖酶产酶能力，达到381U/mL，对过表达HAC1菌株内质网蛋白折叠相关基因表达水平的研究，表明过表达HAC1提高了与内质网蛋白折叠相关基因表达水平，增强了内质网折叠组装蛋白的功能从而进一步提高了木聚糖酶的表达量。

<110>吉林农业大学

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<170>SIPOSequenceListing1.0

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aatggcctat cggaatacat tttctacatc ctaactacta taaaacaacc tttagactta 420

cgtttgctac tctcatggtc tcaatactgc cgccgacatt ctgtcccaca tactaaatct 480

cttcccgtca ttatcgcccg catccggtgc cgtaaatgca aaacaaatac catctatgtc 540

ttccacacca tcattttact atgcctgcca ccatccattt gtcttttgca ccatatcttc 600

ataacctgtc accttgaaac tacctctgca tgccacctac cgaccaactt tcatgttctg 660

tttcgaccta cctcttgtaa atgacaaatc acctttttca tcgtatgcac cttattctcc 720

acatcacaat gcactattgc ttttgctttt tcacctgtca tatcctattg ctattagatg 780

aaatataata aaaattgtcc tccacccata acacctctca ctcccaccta ctgaacatgt 840

ctggaccctg ccctcatatc acctgcgttt ccgttaaact atcggttgcg gccatatcta 900

ccagaaagca ccgtttcccg tccgatcaac tgtagttaag ctggtaagag cctgaccgag 960

tagtgtagtg ggtgaccata cgcgaaactc aggtgctgca atctttattt cttttttttt 1020

tttttttttt tttttttttt ctagtttctt ggcttcctat gctaaatccc ataactaacc 1080

taccattcga ttcagaaaaa ttcgcactat ccagctgcac tcttcttctg aagagttaag 1140

cactccatta tgctcattgg gttgctacta cttgatatgt acaaacaata ttctcctccg 1200

atattcctac aaaaaaaaaa aaaaaaacac tccggttttg ttctcttccc tccatttccc 1260

tctcttctac ggttaatact ttcctcttcg tctttttcta caccctcgtt tagttgcttc 1320

ttattccttc ccgctttcct gcactaacat tttgccgcat tacactatat gatcgtagta 1380

catcttacaa ctccgcatac cgcgtcgccg cgtcgccgcg tcgccaaaaa tttacttcgc 1440

caaccattcc atatctgtta agtatacatg tatatattgc actggctatt catcttgcac 1500

ttttcctctt tcttcttccc agtagcctca tccttttacg ctgcctctct ggaacttgcc 1560

atcatcattc cctagaaact gccatttact taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaatgtcccc 1620

actgttcact gttcactgtt cacttgtctc ttacatcttt cttggtaaaa tcgtagttcg 1680

tagtattttt tttcatatca aaggcatgtc ctgttaacta taggaaatga gcttttctca 1740

attctctaaa cttatacaag cactcatgtt tgccgctctg atggtgcgga aaaaactgct 1800

ccatgaagca aactgtccgg gcaaatcctt tcacgctcgg gaagctttgt gaaagccctt 1860

ctctttcaac ccatctttgc aacgaaaaaa aaaaaaaaaa taaaaaataa aaagaccaaa 1920

tagtaaatag taacttacat acattagtaa atggtacact cttacacact atcatcctca 1980

tcgtatatta taatagatat atacaataca tgtttttacc cggatcatag aattcttaag 2040

acaaataaaa tttatagaga cttgttcagt ctacttctct ctaaactagg ccccggctcc 2100

tgccagtacc cacttagaaa gaaataaaaa acaaatcaga caacaaaggc ttaatctcag 2160

cagatcgtaa caacaaggct actctactgc ttacaatacc ccgttgtaca tctaagtcgt 2220

atacaaatga tttatcccca cgcaaaatga cattgcaatt cgccagcaag cacccaaggc 2280

ctttccgcca agtgcaccgt 2300

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acgtacgtac aacgaacgag accttaacct 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

acgtacgtac ggaacctcta atcattcgct 30

<210> 13

<211> 885

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttaactttcc ttggatgatt tttcattgag tttttgagta agttctagga tttgttgctt 60

caagtcatca ttctcaacca ataaatgtgc tctgtgaatt tcactatcct ttaaagagtc 120

catagatttt ttcaattgaa tacaagatct cgcgtaacct tctttaataa aattgaaatt 180

gagcagcaat ttatgagtat taattattct tgccttcatt tccgaaattt gacttattgt 240

aaactcattt gtgaacttag caggcttcgt tgcagataca atgtcttgtc ttgcagaatc 300

tattttagat gttatatcag taatcatgga ttctattttt aggtgggatt cattagcgtc 360

ggatgaagct aacgaagatg aaggtgatag ggatgcaggg gataacatgg gttcatttgt 420

ggttttcaaa agggattttt tcttcttgat ggtgggttta tctatcttat agttcttttg 480

ttctttatca ggtttatgta cgttattttg gtttgtactt ttatctaatg atgccttgcc 540

agtataaccc tttttatgcc tatcgagatc aataccaact aggctatcat tagcacttct 600

ctgcatttcc aaaagtgtgc tcgaatcggt gttgtgttca tcgttaaata aagattccaa 660

tgttaggtgt ttctgagaag cgatgtcgga atcaaaaata tcagtgcagt ctaaattatc 720

catcataact tgttcgagat cctttcccaa atctaaactc tgcccatcaa tctttactgt 780

atcatcaaaa tgattatttg cctgagtgag cagccgatgc aacgtatgtt ctatattggc 840

atcatctgtt aaatctgtat tcggattgga ctgattcgtg ttcat 885

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tatcccctgc atccctatca 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

caggcttcgt tgcagataca 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gccgtggaca gttctctttc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tcatgacccc gatgagtgta 20

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cccaagcttc tgccccaggt tccgttatt 29

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cgcggatcca ccgaaggcat cgttgatgt 29

<210> 20

<211>28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cccggatcca tggaaatgac tgattttg 28

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ccctctagat catgaagtga tgaagaaatc 30

<210> 22

<211> 1567

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

atggaaatga ctgattttga actaactagt aattcgcaat cgaacttggc tatccctacc 60

aacttcaagt cgactctgcc tccaaggaaa agagccaaga caaaagagga aaaggaacag 120

cgaaggatcg agcgtatttt gagaaacaga agagctgctc accagagcag agagaaaaaa 180

agactacatc tgcagtatct cgagagaaaa tgttctcttt tggaaaattt actgaacagc 240

gtcaaccttg aaaaactggc tgaccacgaa gacgcgttga cttgcagcca cgacgctttt 300

gttgcttctc ttgacgagta cagggatttc cagagcacga ggggcgcttc actggacacc 360

agggccagtt cgcactcgtc gtctgatacg ttcacacctt cacctctgaa ctgtacaatg 420

gagcctgcga ctttgtcgcc caagagtatg cgcgattccg cgtcggacca agagacttca 480

tgggagctgc agatgtttaa gacggaaaat gtaccagagt cgacgacgct acctgccgta 540

gacaacaaca atttgtttga tgcggtggcc tcgccgttgg cagacccact ctgcgacgat 600

atagcgggaa acagtctacc ctttgacaat tcaattgatc ttgacaattg gcgtaatcca 660

gaagcgcagt caggtttgaa ttcatttgaa ttgaatgatt tcttcatcac ttcatgaagc 720

ctgctctcac acatctttct tctaaccaag gggtgtttag tttagtagaa cctcgtgaaa 780

cttacattta catatatata aacttgcata aattggtcaa tgcaagaaat acatatttgt 840

cttttctaat tcgtagtttt tcaagttctt agatgctttc tttttctctt ttttacagat 900

catcaagaag taattatcta ctttttacaa caaatataaa acaatgtctt tatcttcaaa 960

gttgtctgtc caagatttgg acttgaagga caagcgtgtc ttcatcagag ttgacttcaa 1020

cgtcccattg gacggtaaga agatcacttc taaccaaaga attgttgctg ctttgccaac 1080

catcaagtac gttttggaac accacccaag atacgttgtc ttggcttctc acttgggtag 1140

accaaacggt gaaagacacg aaaaatactc tttggctcca gttgctaagg aattgcaatc 1200

attgttgggt aaggatgtca ccttcttgaa cgactgtgtc ggtccagaag ttgaagccgc 1260

tgtcaaggct tctgccccag gttccgttat tttgttggaa aacttgtgtt accacatcga 1320

agaagaaggt tccagaaagg tcgatggtca aaaggtcaag gcttccaagg aagatgttca 1380

acagttcaga cacgaattga gctctttggc tgatgtttac atcaacgatg ccttcggtac 1440

cgctcacaga gctcactctt ctatggtcgg tttcgacttg ccacaacgtg ctgccggttt 1500

cttgttggaa aaggaattga agtacttcgg taaggctttg gagaacccaa ccagaccatt 1560

cttggcc 1567

<210> 23

<211> 984

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

atggttcaga tcaaggtagc tgcactggcg aagcttatcg ctagccaagt gctttctgaa 60

cctattgaac cccgtcaggc ttcagtgagc atcgacacca agttcaaggc tcacggaaag 120

aagtatctgg gaaacatcgg ggatcagtac accttgacca agaactcgaa gactccggca 180

atcatcaaag ccgattttgg cgccttgacc ccagagaaca gcatgaagcg ggatgccact 240

gagcccagcc gtggacagtt ctctttctcg ggatcggatt acctggtcaa ctttgcccag 300

tctaacaaca agctgatccg tggacatacg ctggtgtggc actctcagct cccctcttgg 360

gttcaagcca tcacggacaa aaatacactc atcggggtca tgaagaatca catcaccacg 420

gtgatgcaac actataaggg caagatctac gcctgggacg tggttaatga aattttcaac 480

gaagatggct ccctgcgcga cagcgtcttc tacaaagtca tcggcgagga ctacgtccga 540

attgccttcg agactgctcg ggctgcggat cccaacgcaa agctctacat caacgattac 600

aacctggact ccgcttccta tcctaagttg actggcatgg tcagccatgt caagaagtgg 660

atcgcagccg gtattcctat cgatggaatt ggctcccaaa cccacttgag cgctggtgga 720

ggtgctggaa tttctggagc tcttaatgct ctcgcaggtg cgggcaccaa ggagattgcg 780

gtcaccgagc tcgacatcgc tgacgccagc tcaaccgact acgtcgaggt cgtcgaagcc 840

tgccttgacc agcccaagtg tatcggtatc accgtgtggg gagtcgctga cccggactcc 900

tggcgctcca gctccactcc tctgttgttt gacagcaact ataacccgaa gcctgcatat 960

tttgctgtcg caaatgctct ctag 984

<210> 24

<211> 850

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

agcctgctct cacacatctt tcttctaacc aaggggtgtt tagtttagta gaacctcgtg 60

aaacttacat ttacatatat ataaacttgc ataaattggt caatgcaaga aatacatatt 120

tgtcttttct aattcgtagt ttttcaagtt cttagatgct ttctttttct cttttttaca 180

gatcatcaag aagtaattat ctacttttta caacaaatat aaaacaatgt ctttatcttc 240

aaagttgtct gtccaagatt tggacttgaa ggacaagcgt gtcttcatca gagttgactt 300

caacgtccca ttggacggta agaagatcac ttctaaccaa agaattgttg ctgctttgcc 360

aaccatcaag tacgttttgg aacaccaccc aagatacgtt gtcttggctt ctcacttggg 420

tagaccaaac ggtgaaagac acgaaaaata ctctttggct ccagttgcta aggaattgca 480

atcattgttg ggtaaggatg tcaccttctt gaacgactgt gtcggtccag aagttgaagc 540

cgctgtcaag gcttctgccc caggttccgt tattttgttg gaaaacttgt gttaccacat 600

cgaagaagaa ggttccagaa aggtcgatgg tcaaaaggtc aaggcttcca aggaagatgt 660

tcaacagttc agacacgaat tgagctcttt ggctgatgtt tacatcaacg atgccttcgg 720

taccgctcac agagctcact cttctatggt cggtttcgac ttgccacaac gtgctgccgg 780

tttcttgttg gaaaaggaat tgaagtactt cggtaaggct ttggagaacc caaccagacc 840

attcttggcc 850

<210> 25

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

atgagatttc cttctatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tacttagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggtgtt 240

tctttggata aaaga 255

<210> 26

<211> 254

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cggccgcaaa ttaaagcctt cgagcgtccc aaaaccttct caagcaaggt tttcagtata 60

atgttacatg cgtacacgcg tctgtacaga aaaaaaagaa aaatttgaaa tataaataac 120

gttcttaata ctaacataac tataaaaaaa taaataggga cctagacttc aggttgtcta 180

actccttcct tttcggttag agcggatgtg gggggagggc gtgaatgtaa gcgtgacata 240

actaattaca tgac 254

<210> 27

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

atggaaatga ctgattttga actaactagt aattcgcaat cgaacttggc tatccctacc 60

aacttcaagt cgactctgcc tccaaggaaa agagccaaga caaaagagga aaaggaacag 120

cgaaggatcg agcgtatttt gagaaacaga agagctgctc accagagcag agagaaaaaa 180

agactacatc tgcagtatct cgagagaaaa tgttctcttt tggaaaattt actgaacagc 240

gtcaaccttg aaaaactggc tgaccacgaa gacgcgttga cttgcagcca cgacgctttt 300

gttgcttctc ttgacgagta cagggatttc cagagcacga ggggcgcttc actggacacc 360

agggccagtt cgcactcgtc gtctgatacg ttcacacctt cacctctgaa ctgtacaatg 420

gagcctgcga ctttgtcgcc caagagtatg cgcgattccg cgtcggacca agagacttca 480

tgggagctgc agatgtttaa gacggaaaat gtaccagagt cgacgacgct acctgccgta 540

gacaacaaca atttgtttga tgcggtggcc tcgccgttgg cagacccact ctgcgacgat 600

atagcgggaa acagtctacc ctttgacaat tcaattgatc ttgacaattg gcgtaatcca 660

gaagcgcagt caggtttgaa ttcatttgaa ttgaatgatt tcttcatcac ttcatga 717

Claims (4)

1.一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌株，其特征在于：所述菌株含有木聚糖酶xynB基因，序列如SEQ ID NO：23；所述菌株含有8拷贝木聚糖酶基因表达盒PαXC，PαXC序列如SEQ ID NO：9；所述菌株含有过表达基因HAC1，序列如SEQ ID NO：27，所述菌株以酿酒酵母菌为工程菌；

所述8拷贝的木聚糖酶基因表达盒PαXC包括以下元件：（a）起始信号元件为PGK，序列如SEQ ID NO：24；（b）分泌信号肽α-factor，序列如SEQ ID NO：25；（c）木聚糖酶xynB基因；（d）终止子CYC1，序列如SEQ ID NO：26；所述8拷贝的木聚糖酶基因表达盒PαXC构建按如下进行：

①重叠延伸PCR法构建PαXC表达盒：以黑曲霉CICC2462菌种扩增木聚糖酶xynB基因，以S. Cerevisiae INVSc1基因组DNA为模板扩增PGK启动子序列、序列如SEQ ID NO：24，以pPIC9K质粒为模板扩增分泌信号肽α-factor序列、序列如SEQ ID NO：25，以pSH65质粒扩增终止子CYC1序列、序列如SEQ ID NO：26，利用重叠延伸PCR的方法将四段序列串联成PGK-α-factor-xynB-CYC1表达盒PαXC，将PαXC表达盒连接至pMD19-T载体，转化感受态大肠杆菌DH5α，提取pMD19-T-PαXC质粒测序验证序列是否正确，其核苷酸编码序列如 SEQ ID NO：9；

②S. Cerevisiae INVSc1-pYES2-PαXC-rDNA工程菌的构建：对pMD19-T-PαXC和pYES2分别双酶切后连接转化感受态大肠杆菌DH5α，得到pYES2-PαXC载体，以S. CerevisiaeINVSc1基因组DNA为模板，扩增rDNA单元中的核心序列、核苷酸编码序列如 SEQ ID NO：10，对pYES2-PαXC和pMD19-T-rDNA分别经SnaBI单酶切后，回收目的片段，T4连接酶连接，测序验证，得到pYES2-PαXC-rDNA表达载体，对pYES2-PαXC-rDNA载体经SphI在rDNA位置进行线性化后，采用LiAc/ssDNA法转化感受态S. Cerevisiae INVSc1，转化后体系涂布于SC-U培养基，3-5d后长出单菌落；

③微滴数字PCR鉴定转化子拷贝数

将的阳性转化子，接种于YPD培养基中，培养48h后，收集菌体，用Omega酵母基因组提取试剂盒提取DNA，以DNA为模板，ATC1基因为内参、序列如SEQ ID NO：13，利用BIO-RAD QX200数字液滴PCR进行xynB基因拷贝数鉴定，并使用软件QuantaSoft V1.3.2.0分析分析实验数据，获得绝对定量结果，选择8拷贝菌株。

2.一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于：该方法包含以下步骤：PαXC基因表达盒的构建、8拷贝PαXC基因表达盒的构建、过表达HAC1 8拷贝木聚糖酶菌株的构建；

所述PαXC基因表达盒的构建包含如下步骤：

以黑曲霉CICC2462菌种扩增木聚糖酶xynB基因，上下游引物xynB-F 和xynB-R核苷酸编码序列如 SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，以S. Cerevisiae INVSc1基因组DNA为模板扩增Phosphoglycerate kinase（PGK）启动子序列，上下游引物PGK -F 和PGK -R核苷酸编码序列如 SEQ ID NO： 3和SEQ ID NO： 4；以pPIC9K质粒为模板扩增分泌信号肽alpha-factor（α-factor）序列, 上下游引物α-factor -F 和α-factor -R核苷酸编码序列如 SEQ IDNO： 5和SEQ ID NO： 6；以pSH65质粒扩增终止子CYC1序列，上下游引物CYC1 -F 和CYC1 -R核苷酸编码序列如 SEQ ID NO： 7和SEQ ID NO： 8，利用重叠延伸PCR的方法将四段序列串联成PGK-α-factor-xynB-CYC1（PαXC）表达盒，核苷酸编码序列如 SEQ ID NO： 9，xynB序列如SEQ ID NO：23，PGK序列如SEQ ID NO：24，α-factor序列如SEQ ID NO：25，CYC1序列如SEQID NO：26；

所述8拷贝PαXC基因表达盒的构建包含如下步骤：

①S. Cerevisiae INVSc1-pYES2-PαXC-rDNA工程菌的构建：将pMD19-T-PαXC和pYES2分别用EcoRI和XbaI双酶切后，琼脂糖凝胶回收目的片段，T4连接酶连接后转化感受态大肠杆菌DH5α，得到pYES2-PαXC载体，以S. Cerevisiae INVSc1基因组DNA为模板，扩增rDNA单元中2300bp的核心序列，核苷酸编码序列如 SEQ ID NO：10，上下游引物rDNA-F和rDNA-R核苷酸编码序列如 SEQ ID NO： 11和SEQ ID NO： 12，对pYES2-PαXC和pMD19-T-rDNA分别经酶切后回收连接，测序验证得到pYES2-PαXC-rDNA表达载体，对pYES2-PαXC-rDNA载体经SphI在rDNA位置进行线性化后，采用LiAc/ssDNA法转化感受态S. Cerevisiae INVSc1，转化后体系涂布于SC-U培养基，3-5d后长出单菌落；

②微滴数字PCR鉴定转化子拷贝数：将的阳性转化子，接种于YPD培养基中，培养48h后，收集菌体，用Omega酵母基因组提取试剂盒提取DNA，以DNA为模板，ATC1基因为内参，序列如SEQ ID NO： 13， ATC1上下游引物ATC1-F1和ATC1-R1的核苷酸编码序列如 SEQ ID NO： 14和SEQ ID NO： 15，探针：5'-HEX-CATCTTCGTTAGCTTCATCCGACGCTA-BHQ-3'，利用BIO-RADQX200数字液滴PCR进行xynB基因拷贝数鉴定，并使用软件QuantaSoft V1.3.2.0 分析实验数据，获得绝对定量结果，得到8拷贝PαXC基因表达盒菌株。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，过表达HAC1 8拷贝木聚糖酶菌株的构建包含如下步骤：

以S. Cerevisiae INVSc1基因组DNA为模板，扩增PGK启动子序列，经HindIII和BamHI双酶切连接到pYES6载体上，得到pYES6-PGK载体，将酿酒酵母INVSc1菌株接种至YPD液体培养基经DDT诱导后大量生成编码HAC1蛋白的mRNA，收集经DDT诱导后的酵母细胞，提取细胞总RNA，并反转录获得细胞的cDNA扩增扩增HAC1蛋白的编码基因， 扩增引物HAC1-F和HAC1-R核苷酸编码序列分别为 SEQ ID NO： 20和SEQ ID NO： 21，去除内含子后的HAC1序列大小717bp，序列如SEQ ID NO：27，经双酶切后连接入pYES6-PGK载体，挑取阳性克隆测序验证，测序正确的质粒命名为pYES6-PGK-HAC1，PGK-HAC1核苷酸编码序列如 SEQ ID NO： 22，将pYES6-PGK-HAC1线性化后转化8拷贝数的酿酒酵母木聚糖酶工程菌，以Blasticidin抗性为筛选标记进行转化子筛选，得到过表达HAC1 8拷贝木聚糖酶酿酒酵母工程菌S8-H，将得到的过表达S8-H菌株表达木聚糖酶做鉴定。

4.如权利要求1所述的菌株在制备降解木聚糖制剂中的应用。

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