CN105112313B - 马克思克鲁维酵母营养缺陷型菌株及无痕基因组改造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基因改造的马克思克鲁维酵母营养缺陷型菌株以及用于菌株改造的无痕基因改造方法，所述马克思克鲁维酵母营养缺陷型菌株是马克思克鲁维酵母菌株CGMCC No.10621敲除全部或部分营养基因之后的菌株；所述无痕基因改造方法包括：敲除马克思克鲁维酵母菌CGMCC No.10621至少部分营养缺陷型基因，使其形成营养缺陷型菌株。CGMCC No.10621具有高的分泌蛋白的能力和高的生物量、以及发酵时间短等特征；本发明方法所构建的营养缺陷型马克思克鲁维酵母菌株，可以用于马克思克鲁维酵母表达系统的宿主菌，用于重组制备外源蛋白(酶)。另外，本发明提供的优选的第二基因敲除方法，标签基因序列能够回收利用。
Description
技术领域
本发明涉及一种营养缺陷型菌株、以及一种基因改造方法，尤其涉及一种无痕基因改造构建的马克思克鲁维酵母营养缺陷型菌株、以及所述菌株的构建方法。
背景技术
酵母菌是一类低等的真核生物，它既具有类似原核生物的生长特性，又具有一般真核生物的分子和细胞生物学特征。随着分子生物学技术以及全基因组测序技术的快速发展，酵母表达系统逐渐成为外源蛋白重组表达的有力工具。
1981年Hitzeman首次在酿酒酵母中重组表达了人α干扰素，1986年第一个由酿酒酵母表达的基因工程药物乙型肝炎病毒表面抗原进入市场。此外，白细胞介素、多肽类激素、乙型肝炎病毒表面抗原及凝乳酶、淀粉酶、甜味蛋白、血浆蛋白等先后在酿酒酵母表达系统中得到重组表达。但酿酒酵母表达系统存在有不可忽视的局限性，如很难进行高密度发酵、利用葡萄糖产生乙醇、外源基因的表达水平不高、分泌系统不理想，对于大于30KD的蛋白几乎不分泌等等。因此，科学家开发了不同类型的非常规酵母表达系统，包括乳酸克鲁维亚酵母(Kluyveromyces lactis)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)、西方许旺氏酵母(Schwanuiomycesoccidentalis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)等等，并实现了不同类型蛋白的在这些酵母系统中的重组表达，例如人白蛋白、植酸酶等在毕赤酵母中的分泌表达量都超过了10g/L。毕赤酵母是能够以甲醇为唯一C源进行生长的酵母，具有高密度发酵，高水平分泌表达外源蛋白的优势，但该酵母以甲醇作为C，在生产安全和食用安全性上都存在一定的局限性，同时发酵时间较长。
酵母表达系统主要包括宿主菌和表达载体，其中，马克思克鲁维酵母(马克斯克鲁维酵母，Kluyveromyces marxianus)已经通过了美国和欧洲的GRAS和QPS安全认证，其自身不仅被认为是安全的微生物菌株，同时也被认为是可用于制备食品级重组蛋白(酶)的安全微生物菌株，具有很好的工业化应用前景。
构建新型酵母表达系统，首先要获理想的酵母出发菌株，并建立恰当的筛选标记。筛选标记一般分为营养缺陷型筛选和抗生素筛选两种。对于食用安全级别的酵母表达系统，通常选用营养缺陷型筛选标记，包括URA3、HIS3、ADE2等。通过利用分子生物学的技术手段，构建营养缺陷型酵母菌株，实现表达外源蛋白的重组表达。
发明内容
本发明提供了一种马克思克鲁维酵母营养缺陷型菌株、以及一种用于菌株改造的无痕基因改造方法。
本发明第一个方面是提供一种马克思克鲁维酵母营养缺陷菌株，所述马克思克鲁维酵母营养缺陷菌株是马克思克鲁维酵母菌株CGMCC No.10621敲除全部或部分营养基因之后的菌株。
其中，所述营养基因优选为选自URA3基因、HIS3基因、ADE2基因中的任意一种或几种。
其中，在一种优选实施例中，所述马克思克鲁维酵母菌株CGMCC No.10621敲除全部或部分URA3基因。
其中，所述敲除部分基因URA3基因优选为至少敲除该基因全部或部分ORF区，更优选为至少敲除该基因全部或部分CDS区。
其中，在一种更优选实施例中，所述马克思克鲁维酵母营养缺陷菌株在Uracil营养缺陷培养基中不能生长。
本发明所述的马克思克鲁维酵母营养缺陷菌株，还可以是所述马克思克鲁维酵母菌株CGMCC No.10621敲除全部或部分HIS3基因、ADE2基因中的任意一种或几种之后的菌株。
其中，更优选地，敲除全部或部分HIS3基因后，所述马克思克鲁维酵母营养缺陷菌株在SC-Histidine营养缺陷培养基中不能生长。
其中，更优选地，敲除全部或部分ADE2基因后，所述马克思克鲁维酵母营养缺陷菌株在SC-Adenine营养缺陷培养基中不能生长。
在一种优选实施例中，所述马克思克鲁维酵母营养缺陷菌株，是马克思克鲁维酵母菌株CGMCC No.10621敲除全部或部分URA3基因、以及全部或部分HIS3基因的菌株。
在一种更优选实施例中，所述马克思克鲁维酵母营养缺陷菌株在SC-Uracil、SC-Histidine营养缺陷培养基中不能生长。
在一种优选实施例中，所述马克思克鲁维酵母营养缺陷菌株，是马克思克鲁维酵母菌株CGMCC No.10621敲除全部或部分URA3基因、以及全部或部分ADE2基因的菌株。
在一种更优选实施例中，所述马克思克鲁维酵母营养缺陷菌株在SC-Uracil、SC-Adenine营养缺陷培养基中不能生长。
在一种优选实施例中，所述马克思克鲁维酵母营养缺陷菌株，是马克思克鲁维酵母菌株CGMCC No.10621敲除全部或部分URA3基因、全部或部分HIS3基因、以及全部或部分ADE2基因的菌株。
在一种更优选实施例中，所述的马克思克鲁维酵母营养缺陷菌株在SC-Uracil、SC-Histidine、SC-Adenine营养缺陷培养基中不能生长。
在一种优选实施例中，所述马克思克鲁维酵母营养缺陷菌株，是马克思克鲁维酵母菌株CGMCC No.10621敲除全部或部分HIS3基因之后的菌株。
其中，在一种优选实施例中，所述敲除部分HIS3基因为至少敲除全部或部分该基因的ORF区，更优选为至少敲除全部或部分该基因的CDS区。
其中，在一种优选实施例中，所述的马克思克鲁维酵母营养缺陷菌株在SC-Histidine营养缺陷培养基中不能生长。
在一种优选实施例中，所述的马克思克鲁维酵母营养缺陷菌株，是马克思克鲁维酵母菌株CGMCC No.10621敲除全部或部分HIS3、以及全部或部分ADE2基因的菌株。
在一种更优选实施例中，所述的马克思克鲁维酵母营养缺陷菌株在SC-Histidine、SC-Adenine营养缺陷培养基中不能生长。
本发明第二个方面是提供一种无痕基因改造方法，步骤包括：敲除马克思克鲁维酵母菌CGMCC No.10621至少部分营养缺陷型基因，使其形成营养缺陷型菌株。
其中，本发明所述营养缺陷型基因是指能够编码产生马克思克鲁维酵母菌CGMCCNo.10621营养物质的基因。
本发明所述营养缺陷型基因选自全部或部分URA3基因、全部或部分HIS3基因、全部或部分ADE2基因中的一种或几种。
其中，更优选为敲除至少部分营养缺陷型基因的步骤包括：
敲除马克思克鲁维酵母菌CGMCC No.10621中的全部或至少部分第一基因；
进一步敲除全部或部分第二基因。
其中，更优选为所述的步骤包括：
敲除马克思克鲁维酵母菌CGMCC No.10621中的全部或至少部分第一基因；
进一步敲除全部或部分第二基因；
然后通过重组回补第一基因。
在本发明的一种优选实施例中，敲除基因的步骤包括：
敲除马克思克鲁维酵母菌CGMCC No.10621中的全部或至少部分第一基因，得到第一基因缺失的菌株A，
扩增第二基因片段和第一基因标签基因序列，使第二基因片段和第一基因标签基因序列发生内源性重组。
更优选地，步骤包括：
敲除马克思克鲁维酵母菌CGMCC No.10621中的全部或至少部分第一基因，得到第一基因缺失的菌株A，
设计引物扩增得到第二基因的上游片段、第一下游片段和第二下游片段，并扩增得到第一基因标签序列；其中，所设计引物使得：
——上游片段和第二下游片段的5’末端包含同源序列；
——第一下游片段和第一基因标签基因序列的3’末端包含同源序列；
——上游片段5’末端与第一线性化载体3’末端包含同源序列；
——第二下游片段3’末端与第二线性化载体5’末端包含同源序列；
将上游片段与第二下游片段连接的第一线性化载体上，酶切获得包含上游片段和第二下游片段的线性化载体A；
将第一下游片段与第一基因标签序列连接到第二线性化载体上，PCR扩增得到第一下游片段与第一基因标签基因序列的连接片段B；
其中，其中连接片段B的5’末端和上游片段的3’末端有同源序列，连接片段B的3’末端和第二下游片段的5’末端有同源序列；
将连接片段B、线性化载体A进行连接，获得第二基因缺失突变质粒；在所述第二基因缺失突变质粒中，第一下游片段和第一基因标签序列位于上游片段和第二下游片段之间，第一基因标签序列位于第一下游片段和第二下游片段之间；
酶切第二基因缺失突变质粒得到第二基因缺失突变表达框，转化第一基因缺失的菌株A，得到敲除部或部分第一基因、第二基因的马克思克鲁维酵母菌。
在第一种优选实施例中，所述方法还包括：培养所得敲除部或部分第一基因、第二基因的马克思克鲁维酵母菌，使得第一基因标签序列两端的第一下游片段和第二下游片段之间发生同源重组，将第一基因标签序列从基因组中去除，回收第一基因标签序列。
其中，所述第一基因和第二基因可以分别独立地是一种或多种基因，并优选为至少一种所述营养缺陷型基因。其中，第一基因优选为至少包括URA3基因，第二基因优选为HIS3基因、ADE2基因中的一种或几种。或者第一基因优选为URA3基因和HIS3基因，第二基因为ADE2基因。
其中，所述第一基因标签基因序列优选为URA3基因标签基因序列，更优选为Chromosome1：1542629-1544057序列。
其中，所述第一线性化载体和第二线性化载体可以相同或不同，并优选为相同，并更优选为pMD-18T载体。
在第一种优选实施例中，本发明敲除马克思克鲁维酵母菌CGMCC No.10621的全部或部分URA3基因，得到在Uracil营养缺陷培养基中不能生长的马克思克鲁维酵母菌FIM-1(ura3Δ)。
在第一种优选实施例中，敲除部或部分URA3基因的步骤包括：
根据URA3基因序列设计PCR扩增引物，扩增提取URA3基因序列；
根据提取的URA3基因序列CDS上下游分别设计引物，进行PCR扩增得到URA3基因序列CDS上游片段和下游片段；将上游片段和下游片段与线性化载体片段克隆连接，获得URA3基因缺失突变质粒；
URA3基因缺失突变质粒为模板扩增得到URA3基因缺失突变表达框线性DNA片段，将该片段转化马克思克鲁维酵母菌CGMCC No.10621菌株，得到敲除部或部分URA3基因的马克思克鲁维酵母菌FIM-1(ura3Δ)。
在第一种优选实施例中，根据URA3基因序列CDS上下游设计引物的方法包括：URA3基因序列CDS上游、下游片段的5’和3’末端添加10-25bp的同源序列。更优选地，URA3基因序列CDS上游片段5’端和线性化载体片段的3’末端添加10-25bp的同源序列；URA3基因序列CDS下游片段3’端和线性化载体片段的5’末端添加10-25bp的同源序列。
更优选为根据URA3基因序列CDS上下游设计的引物为：
URA上游F：
5’-GATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCCATTTTCATCTAAGAATATATCTG-3’
URA3上游R：5’-CGAGTACACTTAGAAGCGTATTGTGATGAGCATCC-3’
URA3下游F：5’-TACGCTTCTAAGTGTACTCGGATCAGAAGTTACAAG-3’
URA3下游R：
5’-GACGATATCTCTAGAGGATCCCCCAGGTAACACAATACCGATTACTTG-3’
在第一种优选实施例中，根据URA3基因序列设计PCR扩增引物优选为：
URA3F：5’-CCCATTTTCATCTAAGAATATATCTG-3’
URA3R：5’-CAGGTAACACAATACCGATTACTTG-3’
在第一种优选实施例中，所述线性化载体片段优选为pMD-18T空载质粒酶切厚的线性化载体片段，所述酶切优选为PstI、SmaI双酶切。
在第二种优选实施例中，本发明敲除马克思克鲁维酵母菌FIM-1(ura3Δ)的全部或部分HIS3基因，得到在SC-Histidine营养缺陷培养基中不能生长的马克思克鲁维酵母菌FIM-2(ura3Δhis3Δ)。
即第一基因为URA3基因、第二基因为HIS3基因；其中，优选地，第二基因上游序列为SEQ ID No.18、第一下游序列为SEQ ID No.19、第二下游序列为SEQ ID No.21，第一基因标签基因序列为SEQ ID No.20。
其中，敲除全部或部分HIS3基因的步骤包括：
根据HIS3基因序列设计PCR扩增引物，扩增得到如下同源序列：HIS3基因序列上游序列SEQ ID No.18、下游序列SEQ ID No.19和SEQ ID No.21，扩增URA3标签基因序列SEQID No.20；
扩增所得SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21序列片段与线性化载体DNA序列克隆连接，得到HIS3基因缺失突变质粒；
酶切HIS3基因缺失突变质粒得到HIS3基因缺失突变表达框，转化FIM-1(ura3Δ)菌株，得到敲除部或部分URA3基因、HIS3基因的马克思克鲁维酵母菌FIM-2(ura3Δhis3Δ)。
在第二种优选实施例中，设计PCR扩增引物时，分别在SEQ ID No.18、SEQ IDNo.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21片段5’和3’末端添加10-25bp的同源序列。其中更优选为：SEQ ID No.19片段3’和SEQ ID No.21片段5’末端包含10-25bp同源序列，其中SEQ IDNo.20片段5’和SEQ ID No.19片段3’末端包含10-25bp同源序列，其中SEQ ID No.19片段5’和线性化载体3’末端包含10-25bp同源序列，其中线性化载体5’和SEQ ID No.21片段3’末端包含10-25bp同源序列。
更优选为所述PCR扩增引物为：
SEQ ID No.18F：
5’-GATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCATTCGGTGGCAAACCTCTATAAACGC-3’
SEQ ID No.18R：
AGAAATGTGGCCCGGGAGGACCAACCAGAGTGCTTCGCTAGGG-3’
SEQ ID No.19F：
5’-GATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCCACATTTCTTGGAGTCATTTGCGG-3’
SEQ ID No.19R：
5’-TCCAATCAGAATTCGAGCTTCCCTAATCGAACCAAAGAATG-3’
SEQ ID No.20F：
5’-TCGATTAGGGAAGCTCGAATTCTGATTGGAAAGACCATTCTGC-3’
SEQ ID No.20R：
5’-GACGATATCTCTAGAGGATCCCCTCCGAGTACACTCGAACCTCTGCTTGTTC-3’
SEQ ID No.21F：
5’-GGTTGGTCCTCCCGGGACCACATTTCTTGGAGTCATTTGCGG-3’
SEQ ID No.21R：
5’-GACGATATCTCTAGAGGATCCCCGTTGAAAGCGGAACTGTAACCCTTGC-3’
在第二种优选实施例中，所述线性化载体DNA片段优选为pMD-18T空载质粒双酶切后所得线性化载体片段。所述双酶切优选为PstI、SmaI双酶切。
在第二种优选实施例中，构建HIS3基因缺失突变质粒的方法包括：
利用所述同原序列，将SEQ ID No.18、SEQ ID No.21克隆连接到所述线性化载体DNA片段，然后单酶切获得包含SEQ ID No.18、SEQ ID No.21序列的线性化载体I；
将SEQ ID No.19、SEQ ID No.20克隆连接到所述线性化载体DNA片段，得到连接质粒，扩增所述连接质粒，获得SEQ ID No.19-SEQ ID No.20连接的DNA片段；利用同源序列，将所述SEQ ID No.19-SEQ ID No.20连接的DNA片段与线性化载体I克隆连接，得到HIS3基因缺失突变质粒。
在第三种优选实施例中，本发明敲除马克思克鲁维酵母菌FIM-1(ura3Δ)和/或FIM-2(ura3Δhis3Δ)的全部或部分ADE2基因，得到在SC-Adenine营养缺陷培养基中不能生长的马克思克鲁维酵母菌。
即，第一基因为URA3基因、HIS3基因中的任意一种或几种；第二基因为ADE2基因；其中，优选地，第二基因上游序列为SEQ ID No.22、第一下游序列为SEQ ID No.23、第二下游序列为SEQ ID No.24，第一基因标签基因序列为SEQ ID No.20。
在第三种优选实施例中，敲除马克思克鲁维酵母菌FIM-1(ura3Δ)的全部或部分ADE2基因的方法包括：
克隆ADE2基因序列，用K.latics KLLA0E02685g基因序列进行BLAST获得三段同源序列SEQ ID No.22-SEQ ID No.24；根据所得同源序列、以及SEQ ID No.20设计引物，扩增所述同源序列和SEQ ID No.20；
扩增后的同源序列、以及SEQ ID No.20序列与线性化载体DNA片段克隆连接，得到ADE2基因缺失突变质粒；
酶切获得ADE2基因缺失突变表达框，转化FIM-1(ura3Δ)得到敲除部或部分URA3基因、ADE2基因的马克思克鲁维酵母菌FIM-4(ura3Δade2Δ)；和/或转化FIM-2(ura3Δhis3Δ)，得到敲除部或部分URA3基因、HIS3基因、ADE2基因的马克思克鲁维酵母菌FIM-5(ura3Δhis3Δade2Δ)。
在第三种优选实施例中，根据所得同源序列设计引物时，优选为：分别在SEQ IDNo.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.20片段5’和3’末端添加10-25bp同源序列。更优选为：SEQ ID No.22片段3’和SEQ ID No.23片段5’末端包含10-25bp同源序列，SEQID No.20片段3’和SEQ ID No.24片段5’末端包含10-25bp同源序列，SEQ ID No.22片段5’和线性化载体DNA序列3’末端包含10-25bp同源序列，线性化载体DNA序列5’和SEQ IDNo.24片段3’末端包含10-25bp同源序列。更优选地，所述引物为：
SEQ ID No.20F：
5’-ATCGTCCAAACGAATTCTGATTGGAAAGACCATTC-3’
SEQ ID No.20R：
5’-ATAGGCAAATAGGTCCGAGTACACTCGAACCTCTGCTTG-3’
SEQ ID No.22F：
5’-CGAATTCGAGCTCGGTACCCGGATCCGATAGTGGAGGCCGCTCACAGATTG-3’
SEQ ID No.22R：
5’-CCTAGAACATCTCTACACCGAAAATACC-3’
SEQ ID No.23F：
5’-GAGATGTTCTAGGATTTGCCTATGCCAAAAGAATTCAC-3’
SEQ ID No.23R：
5’-TCAGAATTCGTTTGGACGATAGAATGCAAAGAATC-3’
SEQ ID No.24F：
5’-CCTATTTGCCTATGCCAAAAGAATTCAC-3’
SEQ ID No.24R：
5’-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCGGATCCGAATTCTAATAGCTAGTAAAGCAGC-3’
在第三种优选实施例中，所述线性化载体DNA片段优选为pMD-18T空载质粒双酶切后所得线性化载体片段。所述双酶切优选为PstI、SmaI双酶切。
在第三种优选实施例中，构建ADE2基因缺失突变质粒的方法包括：
利用所述同源序列，将SEQ ID No.22、SEQ ID No.24克隆连接，获得SEQ IDNo.22-SEQ ID No.24的DNA片段；
将SEQ ID No.23、SEQ ID No.20克隆连接，获得SEQ ID No.20-SEQ ID No.23连接的DNA片段；
利用同源序列，将所述SEQ ID No.22-SEQ ID No.24的DNA片段、SEQ ID No.20-SEQ ID No.23连接的DNA片段与所述线性化载体DNA序列克隆连接，得到ADE2基因缺失突变质粒。
在第四种优选实施例中，本发明敲除马克思克鲁维酵母菌CGMCC No.10621的全部或部分HIS3基因，得到在SC-Histidine营养缺陷培养基中不能生长的马克思克鲁维酵母菌FIM-3(his3Δ)。
在第四种优选实施例中，敲除马克思克鲁维酵母菌CGMCC No.10621的全部或部分HIS3基因方法优选为包括：
克隆URA3基因，并针对URA3基因设计PCR扩增引物，扩增获得包含URA3ORF的DNA片段；
所述包含URA3ORF的DNA片段转化FIM-2(ura3Δhis3Δ)菌株，通过同源重组回补URA3，获得敲除全部或部分HIS3基因的马克思克鲁维酵母菌FIM-3(his3Δ)。
在第四种优选实施例中，本发明敲除马克思克鲁维酵母菌CGMCC No.10621的全部或部分HIS3基因和全部或部分ADE2基因，得到在SC-Histidine营养缺陷培养基、以及SC-Adenine营养缺陷培养基中不能生长的马克思克鲁维酵母菌FIM-6(his3Δade2Δ)。
在第五种优选实施例中，敲除马克思克鲁维酵母菌CGMCC No.10621的全部或部分HIS3基因和全部或部分ADE2基因的方法优选为包括：
克隆URA3基因，并针对URA3基因设计PCR扩增引物，扩增获得包含URA3ORF的DNA片段；
所述包含URA3ORF的DNA片段转化FIM-5(ura3Δhis3Δade2Δ)菌株，通过同源重组回补URA3，获得敲除全部或部分HIS3基因、和全部或部分ADE2基因的马克思克鲁维酵母菌FIM-6(his3Δade2Δ)。
其中，上述的针对URA3基因设计的PCR扩增引物优选为：
URA3-F：5’-CCATTTTCATCTAAGAATATATCTG-3’
URA3-R：5’-CAGGTAACACAATACCGATTACTTG-3’
其中，CGMCC No.10621保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期为2015年3月13日，分类命名为：马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。
本发明上述内容中，本发明上述内容中，术语ura3、URA3、Ura3具有相同的含义；术语his3、HIS3、His3具有相同的含义；术语ade2、ADE2、Ade2具有相同的含义。
本发明上述内容中，没有特别说明的情况下，URA3基因、HIS3基因、ADE2基因均指的是马克思克鲁维酵母菌的基因。
CGMCC No.10621相比于ATCC8585、ATCC 26548等现有克鲁维酵母，具有更高的分泌蛋白的能力和更高的生物量、以及发酵时间短等特征。本发明方法所构建的营养缺陷型马克思克鲁维酵母菌株，可以用于马克思克鲁维酵母表达系统的宿主菌，用于重组制备外源蛋白(酶)。另外，本发明提供的优选的第二基因敲除方法，标签基因序列能够回收利用。
附图说明
图1为实施例1中pMD-18T ura3Δ-cas质粒构建示意图；
图2为实施例1中同源重组方法敲除FIM基因组上的URA3基因示意图；
图3为实施例1中所得FIM-1(ura3Δ)与野生型FIM在尿嘧啶营养缺陷性培养基上的生长状态；
图4为实施例2中构建的pMD-18T his3Δ-cas质粒所用各DNA片段凝胶电泳图；其中1：HIS3up 607bp片段；2：HIS3dow1 565bp片段；3、5：Km URA3；4：HIS3dow2 604bp片段；7：pMD-18T质粒SmaI单酶切的线性化片段；
图5为实施例2中pMD-18T his3Δ-ca质粒构建示意图；
图6为实施例2中FIM-2(ura3Δhis3Δ)菌株构建原理示意图；
图7为实施例2中FIM-2(ura3Δhis3Δ)菌株构建筛选过程结果；
图8为实施例3中pMD-18T ade2ΔURA3质粒构建所用各DNA片段凝胶电泳图；其中，1：ADE2基因DNA片段，1710bp；2：ADE2_up片段，722bp；3：ADE2dow2片段，693bp；4：ADE2dow1片段，617bp；5：KmURA3片段，1430bp；6：ADE2up-ADE2dow1片段；7：URA3-ADE2dow2片段；8：pMD18T-(ADE2up+ADE2dow1)质粒；9：pMD18T-(URA3+ADE2dow2)质粒；10：pMD18T-(ADE2up+ADE2dow1)质粒Spe1单酶切片段；11：pMD-18T ade2ΔURA3质粒；12：pMD-18T ade2ΔURA3质粒Kpn1、Sph1双酶切片段；
图9为实施例3中pMD-18T ade2ΔURA3质粒构建示意图；
图10为实施例3中FIM-4(ura3Δade2Δ)菌株平板鉴定结果；
图11为实施例3中FIM-5(ura3Δhis3Δade2Δ)菌株平板鉴定结果；
图12为实施例4中FIM-3(his3Δ)菌株平板鉴定结果。
具体实施方式
本发明下述实施例中所用马克思克鲁维酵母CGMCC No.10621筛选方法：
2014年8月从西藏那曲地区采集不同的酸奶样本。
取酸奶样本用无菌水进行，涂布于酵母固体培养基YNB(无氨基酵母氮源；YeastNitrogen Base without Amino Acids)+1％菊粉平板上，30℃培养形成克隆。
将酸奶样本中分离到的酵母菌在含1％酵母提取物(Yeast Extract)和2％的葡萄糖液体培养基中，30℃发酵培养后离心收集发酵上清，检测各株酵母分泌蛋白的能力。其中发现：一株酵母FIM-1具有高分泌蛋白能力，分泌蛋白的大小约90kDa左右。
酵母菌FIM-1的菌种的鉴定：
进行PCR扩增与测序，发现获得的酵母菌FIM-1的18s rDNA序列(SEQ ID No.1)与GenBank中的已知K.marxianus NBRC 1777的序列相似度为100％。
细胞形态学观察发现，酵母菌FIM-1的株菌落为圆形，呈乳白色，边缘整齐，显微下观察发现该酵母菌呈椭圆形，大小约为4-8μm，出芽生殖，单个、两个或多个系成串粘连，这些表现与马克斯克鲁维酵母的细胞形态基本一致，因此该酵母菌命名为K.marxianus FIM-1。
本发明所述的马克思克鲁维酵母菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年3月13日，保藏号为CGMCC No.10621。
高生物量发酵实验
1)初始培养基：酵母粉40g，葡萄糖50g，初始体积1L。灭菌。
2)发酵过程控制：pH7.0，用30％氨水调节，和10％HCL调节；溶解氧设定30％DOT，依靠转速调节溶解氧。
3)培养基流加：开始流加培养基时间是6-10小时，残糖浓度约为5-15g/L。
4)发酵培养时间：30-35小时。
5)培养温度：28-35℃。
实验结果：
1)按照C:N＝5:1的规律，配制流加培养基，葡萄糖浓度50％，酵母粉浓度40％；经过35小时培养，消耗葡萄糖总量350克，消耗酵母粉总量280克，细胞生物量达到99.19g/L(干重)，细胞产率最为0.62，细胞最大生长速度为2.92g/L。
2)按照C:N＝5:1的规律，配制流加培养基，葡萄糖浓度50％，酵母粉浓度40％；培养8小时后开始流加培养基，培养34小时，消耗葡萄糖总量760克，消耗酵母粉总量440克，细胞生物量达到117.78g/L(干重)，细胞产率为0.56，细胞最大生长速度为3.29g/L。
实施例1，敲除ura3基因的马克斯克鲁维酵母工程菌株FIM-1(ura3Δ)的构建
1、KmURA3基因克隆和pMD-18T ura3Δ-cas质粒构建
通过NCBI数据库检索获得K.marxianus的URA3基因序列信息，并设计合成如下引物：
URA3F：5’-CCCATTTTCATCTAAGAATATATCTG-3’
URA3R：5’-CAGGTAACACAATACCGATTACTTG-3’
以FIM基因组为模板，扩增含有URA3基因序列共3123bp(Chromosome1：1541868-1544992，3123bp)。PCR产物克隆到pMD-18T载体上，转化感受态E.coil，通过氨苄抗性筛选，获得阳性克隆，并抽提质粒DNA，进行测序分析，获得FIM URA3基因序列3123bp。
参照图1，在URA3CDS(Chromosome1：1543214-1544017，804bp)上下游分别设计如下引物：
URA上游F：
5’-GATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCCATTTTCATCTAAGAATATATCTG-3’
URA3上游R：5’-CGAGTACACTTAGAAGCGTATTGTGATGAGCATCC-3’
URA3下游F：5’-TACGCTTCTAAGTGTACTCGGATCAGAAGTTACAAG-3’
URA3下游R：
5’-GACGATATCTCTAGAGGATCCCCCAGGTAACACAATACCGATTACTTG-3’
PCR扩增获得URA3CDS上游930bp DNA片段(Chromosome1：1541868-1542797，930bp)，和下游944bp DNA片段(Chromosome1：1544046-1544992，944bp)。同时，pMD-18T空载质粒用PstI、SmaI双酶切后回收获得的线性化载体片段。将上述三个片段通过一步克隆法连接，并转化感受态E.coil，通过氨苄抗性筛选获得阳性克隆，测序鉴定，获得URA3基因敲除的中断盒pMD-18T ura3Δ-cas。
2、FIM-1(ura3Δ)菌株筛选和验证
参照图2，ura3Δcassette线性DNA片段与基因组序列发生同源重组(homologousrecombination)，实现对基因组上ura3的敲除。首先以URA3缺失突变质粒pMD-18T ura3Δ-cas为模板，PCR扩增获得缺失突变片段ura3Δcassette线性DNA。将该片段转化K.marxianus FIM野生菌株，在含有0.2％5-FOA的YEPD平板上30℃培养48h后，即可筛选获得耐5-FOA的阳性菌。
挑取在含有0.2％5-FOA的YEPD平板上生长的单菌落，接种到含有0.2％5-FOA的YEPD液体培养基中培养，并提取基因组DNA。PCR扩增、测序，分析后证实FIM-1的基因组上缺失了URA3CDS共1249bp(Chromosome1：1542797-1544046，1249bp)，将该缺失突变菌株命名为FIM-1(ura3Δ)。
同时在Uracil营养缺陷培养基上进行培养，发现FIM-1(ura3Δ)不能生长，而野生型的FIM(wt)生长良好，如图3所示。
实施例2，敲除ura3、his3基因的马克斯克鲁维酵母工程菌株FIM-2(ura3Δhis3Δ)的构建
1、KmHIS3基因克隆和pMD-18T his3Δ-cas质粒构建
表1，实施例2扩增HIS3基因所用引物
通过NCBI检索获得的关于K.marxianus的HIS3基因序列信息，设计引物(表1)，通过PCR扩增得到HIS3上游和下游各600bp左右的同源序列(HIS3up(607bp)、HIS3dow1(565bp)、HIS3dow2(604bp))，以及Km URA31430bp标签基因序列(Chromosome1：1542629-1544057，1430bp)，如图4所示。
参照图5，同时将pMD-18T空载质粒用PstI、SmaI双酶切后回收获得的线性化载体。将上述各DNA片段通过一步克隆法先后3次将4段DNA片段连到载体上，连接产物转化感受态E.coil，并通过氨苄抗性筛选阳性克隆，37℃过夜培养12-16h并抽提质粒，测序鉴定，即获得pMD-18T his3Δ-cas质粒。
参照图6，首先将HIS3up和HIS3dow2两个DNA片段利用其10-25bp同源序列，通过一步克隆法连接在pMD-18T线性化载体上；利用之前在HIS3up和HIS3dow2同源序列末端添加的SmaI酶切位点单酶切线获得包含HIS3up+HIS3dow2DNA片段的线性化载体；将Km URA3和HIS3dow1两个DNA片段利用其10-25bp同源序列，通过一步克隆法连接在pMD-18T线性化载体上；PCR扩增连接有Km URA3和HIS3dow1片段的pMD-18T质粒，获得HIS3dow1-Km URA3DNA片段，其中HIS3dow1-Km URA3DNA片段5’末端和HIS3up的3’末端有10-25bp同源序列，HIS3dow1-Km URA3DNA片段3’末端和HIS3dow2的5’末端有10-25bp同源序列，HIS3dow1-KmDNA片段和包含HIS3up+HIS3dow2DNA片段的线性化载体进行一步克隆法连接，连接产物转化感受态E.coil，进行阳性克隆筛选、测序鉴定，最终构建获得包含his3Δcassette(HIS3up-HIS3dow1-Km URA3-HIS3dow2，4段DNA片段)的pMD-18T his3Δ-cas质粒。
构建pMD-18T his3Δ-cas质粒测序后比对结果，第一段是HIS3up(SEQ INNo.18)，第二段是HIS3dow1(SEQ IN No.19)，第三段是KmURA3(SEQ IN No.20)，第四段是HIS3dow2(SEQ IN No.21)。
2、FIM-2(ura3Δhis3Δ)菌株筛选和验证
选用同源重组方法敲除马克思克鲁维酵母FIM-1基因组上HIS3：首先将pMD-18This3Δ-cas质粒用BamH1和Kpn1在33.5℃进行3h酶切，酶切后回收3206bp片段，获得his3Δcassette。然后将该片段转化FIM-1(ura3Δ)菌株。
参照图6，his3Δcassette转化FIM-1(ura3Δ)菌株后，5’和3’两端的Km HIS3同源片段和基因组上的Km HIS3基因在筛选压力下发生同源重组，将突变型DNA片段置换到原基因组Km HIS3基因位置。利用Km URA3标签基因，在Uracil缺陷培养条件下筛选阳性菌落，验证鉴定后的菌株即含有Km URA3标签，可以正常表达Km URA3基因编码蛋白。再将该阳性菌株在含5-FOA药物培养条件下培养，利用药物的筛选压力，使得转化DNA片段上在Km URA3两端的Km HIS3下游565bp同源片段发生内源性同源重组，将Km URA3标签从基因组上去掉，这样就可以实现Km URA3标签的重复使用。
参照图7，将转化后菌液涂布在SC-URA平板上，30℃倒置培养48-72h后，挑单克隆分别涂布于SC-Uracil、SC-Histidine平板。30℃倒置培养12-16h后，在SC-Uracil平板生长，在SC-Histidine平板不生长的克隆即转化阳性克隆，该菌株即基因组Km HIS3位置含有Km URA3标签基因的his3Δ菌株。将该菌株涂布于YEPD+5-FOA平板，30℃倒置培养12-16h后，阳性克隆即发生了内源性同源重组，Km URA3标签基因掉落后的FIM-2(ura3Δhis3Δ)菌株，测序鉴定后的FIM-2(ura3Δhis3Δ)菌株涂布SC-Uracil、SC-Histidine平板，30℃倒置培养12-16h后都无法生长，如图7最后两幅照片所示。
实施例3，敲除ura3、ade2基因马克斯克鲁维酵母工程菌株FIM-4(ura3Δade2Δ)的构建、敲除ura3、his3、ade2基因马克斯克鲁维酵母工程菌株FIM-5(ura3Δhis3Δade2Δ)的构建
1、KmADE2基因克隆和pMD-18T ade2Δ-cas质粒构建
克隆获得马克思克鲁维酵母FIM野生菌株ADE2基因序列。根据实验室K.marxianusFIMwt基因组测序数据，用K.latics KLLA0E02685g基因序列进行BLAST，获得3段同源序列：
>fragment_1(上游，SEQ IN No.22，ADE2up)
>fragment_2(下游，SEQ IN No.25，ADE2dow1)
>fragment_3(下游，SEQ IN No.24，ADE2dow2)
根据比对结果在同源序列上游和下游设计如下引物：
KmAED2-F：5’-TGGACCAAAGAACTGTTGGTATTTTAG-3’
KmAED2-R：5’-AATTCTAATAGCTAGTAAAGCAGC-3’
PCR扩增KmAED2，将PCR产物克隆到pMD-18T载体上，转化感受态E.coil，并通过氨苄抗性筛选阳性克隆，37℃过夜培养并提取质粒。质粒使用通用引物M13-R/F进行测序，对测序结果进行序列比对分析，获得KmAED2序列(SEQ IN No.26)。测序结果和K.laticsKLLA0E02685g基因序列进行比对，同源度为86.8％。DNA序列翻译后的蛋白氨基酸序列(SEQIN No.25)和K.latics KLLA0E02685g蛋白氨基酸序列同源度为87％。
根据测序获得的1710bp KmADE2序列，首先在上下游分别设计引物，PCR扩增获得KmADE2序列上游722bp DNA片段(ADE2up)、KmADE2序列下游617bp DNA片段(ADE2dow1)和693bp DNA片段(ADE2dow2)、以及Km URA31430bp标签基因序列(SEQ ID No.22：Chromosome1：1542629-1544057，1430bp)，同时将pMD-18T空载质粒用PstI、SmaI双酶切后回收获得的线性化载体(图8)。
表2，实施例3扩增KmADE2基因所用引物
参照图9，将上述各DNA片段通过优化后一步克隆法连到载体上，连接产物转化感受态E.coil，并通过氨苄抗性筛选阳性克隆，37℃过夜培养12-16h并抽提质粒，测序鉴定，即获得KmURA3作为分子筛选标签的KmADE2基因敲除的中断盒pMD-18T ade2Δ-cas质粒。
首先将pMD-18T ade2Δ-cas质粒用Sph1和Kpn1，37℃进行3h酶切，酶切后回收3462bp片段。将该DNA片段转化FIM-1(ura3Δ)菌株，构建FIM-4(ura3Δade2Δ)工程菌株；将该DNA片段转化FIM-2(ura3Δhis3Δ)菌株，构建FIM-5(ura3Δhis3Δade2Δ)工程菌株。
将转化后菌液涂布在SC-Uracil平板上，30℃倒置培养48-72h后，挑单克隆分别涂布于SC-Uracil、SC-Adenine平板。30℃倒置培养12-16h后，在SC-Uracil平板生长，在SC-Adenine平板不生长的克隆即转化阳性克隆，该菌株即基因组Km ADE2位置含有Km URA3标签基因的ade2Δ菌株。将该菌株涂布于YEPD+5-FOA平板，30℃倒置培养12-16h后，阳性克隆即发生了内源性同源重组，Km URA3标签基因掉落。
挑YEPD+5-FOA平板阳性克隆于YEPD液体培养基，30℃摇床培养24-48h后，抽提基因组，PCR扩增ade2Δ片段，凝胶电泳后回收DNA片段并送测序。测序后ade2Δ序列和KmADE2序列进行比对分析，FIM-4(ura3Δade2Δ)菌株、FIM-5(ura3Δhis3Δade2Δ)菌株ade2Δ序列相比Km HIS3序列缺失120bp。
测序鉴定后的FIM-4(ura3Δade2Δ)菌株涂布SC-Uracil、SC-Adenine平板，30℃倒置培养12-16h后都无法生长(图10)。
测序鉴定后的FIM-5(ura3Δhis3Δade2Δ)菌株涂布SC-Uracil、SC-Histidine、SC-Adenine平板，30℃倒置培养12-16h后都无法生长(图11)。
实施例4，敲除his3基因马克斯克鲁维酵母工程菌株FIM-3(his3Δ)的构建、敲除his3、ade2基因马克斯克鲁维酵母工程菌株FIM-6(his3Δade2Δ)的构建
通过NCBI数据库检索获得K.marxianus URA3基因序列，根据获得的URA3基因序列设计如下引物：
KmURA3-F：5’-CCATTTTCATCTAAGAATATATCTG-3’
KmURA3-R：5’-CAGGTAACACAATACCGATTACTTG-3’
PCR扩增获得包含URA3ORF共3123bp(Chromosome1：1541868-1544992，3123bp)的KmURA3DNA片段。
将上述KmURA3DNA片段通过LiOAc化学转化法分别转化FIM-2(ura3Δhis3Δ)菌株、FIM-5(ura3Δhis3Δade2Δ)菌株，通过同源重组回补URA3，筛选获得FIM-3(his3Δ)和FIM-6(his3Δade2Δ)工程菌株。
将上述转化FIM-2(ura3Δhis3Δ)后的菌液涂布于SC-Uracil平板，30℃倒置培养48-72h后。挑单菌落于SC-Uracil液体培养基，30℃摇床培养24-48h后，抽提基因组，PCR扩增URA3片段，凝胶电泳后回收DNA片段并送测序。测序后URA3序列和KmURA3序列进行比对分析，URA3正确回补。
KmURA3正确回补的菌株即his3Δ单基因突变菌株，命名为FIM-3(his3Δ)，测序鉴定后的FIM-3(his3Δ)菌株涂布SC-Uracil平板，30℃倒置培养12-16h后生长，而涂布SC-Histidine平板，30℃倒置培养12-16h后无法生长，如图12所示。
PCR扩增获得到的3123bp(Chromosome1：1541868-1544992，3123bp)KmURA3DNA片段用于转化DNA，通过LiOAc化学转化法转化FIM-5(ura3Δhis3Δade2Δ)菌株。转化后菌液涂布于SC-Uracil平板，30℃倒置培养48-72h后，挑单菌落于SC-Uracil液体培养基30℃摇床培养24-48h后，抽提基因组，PCR扩增URA3片段，凝胶电泳后回收DNA片段并送测序。测序后URA3序列和KmURA3序列进行比对分析，URA3正确回补。
KmURA3正确回补的菌株即his3Δade2Δ双基因突变菌株，命名为FIM-6(his3Δade2Δ)，测序鉴定后的FIM-6(his3Δade2Δ)菌株涂布SC-Uracil平板，30℃倒置培养12-16h后生长，而涂布SC-Histidine、SC-Adenine平板，30℃倒置培养12-16h后都无法生长。
本发明上述内容中，术语ura3、URA3、Ura3具有相同的含义；术语his3、HIS3、His3具有相同的含义；术语ade2、ADE2、Ade2具有相同的含义。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (2)
1.一种马克思克鲁维酵母营养缺陷菌株，其特征在于，是马克思克鲁维酵母菌株CGMCCNo.10621敲除选自URA3基因、HIS3基因、ADE2基因中的任意一种或几种的营养基因之后的菌株。
2.根据权利要求1所述的马克思克鲁维酵母营养缺陷菌株，其特征在于，选自：
所述马克思克鲁维酵母菌株CGMCC No.10621敲除URA3基因，并且在Uracil营养缺陷培养基中不能生长；
所述马克思克鲁维酵母菌株CGMCC No.10621敲除HIS3基因，并且在SC-Histidine营养缺陷培养基中不能生长；
所述马克思克鲁维酵母菌株CGMCC No.10621敲除URA3基因和HIS3基因，并且在SC-Uracil和SC-Histidine营养缺陷培养基中不能生长；
所述马克思克鲁维酵母菌株CGMCC No.10621敲除URA3基因和ADE2基因，并且在SC-Uracil和SC-Adenine营养缺陷培养基中不能生长；
所述马克思克鲁维酵母菌株CGMCC No.10621敲除HIS3基因和ADE2基因并且，在SC-Histidine和SC-Adenine营养缺陷培养基中不能生长；
所述马克思克鲁维酵母菌株CGMCC No.10621敲除URA3基因、HIS3基因和ADE2基因，并且在SC-Uracil、SC-Histidine和SC-Adenine营养缺陷培养基中不能生长。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1252438A (zh) * | 1998-10-26 | 2000-05-10 | 中国农业科学院饲料研究所 | 一种产生菊粉酶的酵母菌株及其在制作高果糖浆中的应用 |
| CN1408876A (zh) * | 2002-09-18 | 2003-04-09 | 复旦大学 | 鹰嘴豆克鲁维酵母表达系统及其用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Identification of auxotrophic mutants of the yeast Kluyveromyces marxianus by non-homologous end joining-mediated integrative transformation with genes from Saccharomyces cerevisiae;Tohru Yarimizu et al.;《Yeast》;20131219;第30卷;全文 * |
| 一种两步基因同源重组敲除酵母靶标蛋白基因的方法;薛奎晶 等;《生物技术通讯》;20100930;第21卷(第5期);全文 * |
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