CN117417967A - 一种酿酒酵母工程菌株在制备角鲨烯中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酿酒酵母工程菌株在制备角鲨烯中的应用。该酿酒酵母工程菌株具有如下特点：LncRNA SUT067、LncRNA SUT433和LncRNA CUT782中的至少一种缺失或突变；且含有能表达HMG‑CoA还原酶1的编码核酸。本发明不同于提高重组tHMG1表达质粒拷贝数等传统方法，所提供的酵母基因工程菌从底盘细胞自身出发，以关键LncRNA相关靶点为抓手而展开，创新性地改造长非编码RNA靶点，有效的促进了酿酒酵母表达内源酶的水平，提高了高附加值目标产物角鲨烯的产量。本发明构建的酵母工程菌用于合成角鲨烯具有较强的潜力，具备广阔的应用前景和重要的实践意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母工程菌株在制备角鲨烯中的应用。
背景技术
角鲨烯是一种线性三萜类化合物，广泛存在于植物、动物和人类体内，具有抗氧化、抗肿瘤等多种功效。角鲨烯最初从鲨鱼肝油中分离得到。由于市场对角鲨烯的需求不断增加，这可能会导致过度捕捞和其他环境问题。尽管最近的研究发现，通过植物萃取的方式可以获得高纯度的角鲨烯，但植物中角鲨烯的含量较低，萃取过程繁琐，并且萃取原材料易受到季节和地理位置的影响，这些因素都导致萃取产品价格昂贵。因此，植物萃取并不适合角鲨烯大规模工业化生产和商业推广。
酿酒酵母正逐渐成为生产包括角鲨烯在内的各种萜类化合物的有效宿主。使用酿酒酵母发酵合成角鲨烯有多个优势：培养条件简单、成本低廉、生产周期短以及产物下游分离相对简单。因此，酿酒酵母发酵合成萜类化合物已得到广泛应用。酿酒酵母甲羟戊酸途径(MVA)负责提供萜类化合物合成的前体。通过过表达甲羟戊酸(MVA)途径限速步骤的酶基因HMG1和IDI1可以增加角鲨烯产量；抑制ERG1或ERG7的表达用来减少角鲨烯的向下代谢可减少角鲨烯的消耗，从而增加角鲨烯的积累。然而，目前针对角鲨烯合成途径基因靶点的改造已出现边际递减效应，急需在新的维度上寻找有效改造靶点，以进一步提高角鲨烯产量。
因此，通过基因工程和代谢工程的手段，在非编码RNA的维度上改造酵母菌株以提高角鲨烯的产量，具有重要的意义和实际应用价值。
发明内容
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种酿酒酵母工程菌株在制备角鲨烯中的应用，其中，所述的酵母工程菌株具有如下特点：LncRNA SUT067、LncRNA SUT433和LncRNACUT782中的至少一种缺失或突变，且含有能表达HMG-CoA还原酶1的编码核酸；优选包括如下步骤：将所述酿酒酵母工程菌株接种于发酵培养基培养，收集发酵产物即可得到角鲨烯。
所述的酿酒酵母工程菌株优选通过如下步骤得到：
(1)对酿酒酵母工程菌株的出发菌株进行底盘细胞的改造：将出发菌株中的LncRNA SUT067、LncRNA SUT433和LncRNA CUT782中的至少一种进行缺失或突变，得到初步改造的菌株；
(2)tHMG1表达重组载体的构建：将HMG-CoA还原酶1的编码核酸构建于表达载体上，得到tHMG1表达重组载体；
(3)酿酒酵母工程菌株的获得：将tHMG1表达重组载体转化入步骤(1)得到的初步改造的菌株，得到酿酒酵母工程菌株。
所述的酿酒酵母工程菌株的出发菌株优选为具有CEN.PK背景的菌株，该菌株是常用的酵母菌株，在工业界和学术界的代谢工程和系统生物学研究广泛应用(Microb CellFact,2012,11,36)，代表性及普适性较好；优选为酿酒酵母CEN.PK 113-5D。
所述的缺失优选通过同源重组的方法或CRISPR/Cas9基因编辑技术进行无痕敲除。
所述的突变是使得相应的LncRNA不再发挥功能，可通过同源重组的方法或CRISPR/Cas9基因编辑技术得到。
所述的tHMG1是HMG-CoA还原酶1；优选为酿酒酵母来源的截短型HMG-CoA还原酶1。
所述的编码核酸的序列优选如SEQ ID No.1所示。
所述的表达载体优选为p416GAL、p416GPD、p416TEF、p416ADH、p416CYC1、p426GPD、p426TEF、p426ADH或p426CYC1。
所述的发酵培养基优选为YPG培养基。
所述的培养的条件优选为于28～32℃、150～250rpm培养80～120h；更优选为于30℃、200rpm培养96h。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明对酵母细胞进行针对LncRNA靶点的改造，改造后的细胞用于表达截短型HMG-CoA还原酶1，得到高产角鲨烯的工程菌，相比未经LncRNA靶点而用于表达截短型HMG-CoA还原酶1的对照菌株L1T，角鲨烯的产量均超过211.2％。其中，L3T菌株产量可达35.16mg/L，相比对照菌株L1T角鲨烯的产量(15.16mg/L)提高了231.8％以上。不同于提高重组tHMG1表达质粒拷贝数等传统方法，该酵母工程菌仅从出发菌底盘细胞自身出发，围绕LncRNA相关靶点的敲除而展开。本发明创新性地改造长非编码RNA靶点，成功发现了酿酒酵母中有效提升角鲨烯产量的长非编码RNA靶点。酵母工程菌用于提高其他高经济价值内源酶有较强的潜力，具备广阔的应用前景和重要的实践意义。
附图说明
图1是携带URA3筛选标记的重组表达质粒p416-Pgal7-tHMG1-Tcyc1的组成示意图。
图2是使用限制性内切酶XbaI和BamHI对重组表达质粒p416-Pgal7-tHMG1-Tcyc1进行酶切验证的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M为DNA分子量marker。
图3是PCR鉴定敲除SUT067、SUT433、CUT782菌株的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道M为DNA分子量marker。
图4是琼脂糖凝胶电泳图；其中，(A)是PCR鉴定在菌株CEN.PK 113-5D中转入p416-Pgal7-Tcyc1空质粒的琼脂糖凝胶电泳图；(B)是PCR鉴定在菌株ΔSUT067、ΔSUT433、ΔCUT782菌株中成功转入p416-Pgal7-tHMG1-Tcyc1质粒的琼脂糖凝胶电泳图；图中，泳道M为DNA分子量marker，EP为p416-Pgal7-Tcyc1空质粒，p416-tHMG1为p416-Pgal7-tHMG1-Tcyc1质粒。
图5是实施例4中L0T、L1T、L2T、L3T和L4T酵母工程菌株试管发酵合成角鲨烯的产量的数据图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，则通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2017)、《酵母遗传学方法实验指南》(北京：科学出版社，2016)中所述的条件进行。
下述实施例中应用到的CRISPR技术参见现有技术(Zhang et al.A gRNA-tRNAarray for CRISPR-Cas9based rapid multiplexed genome editing in Saccharomycescerevisiae.Nat Commun 2019,10(1):1053)。此外，下述实施例所使用的质粒psgtRNA、pCas质粒以及pScURA质粒片段的序列已在该文献“Zhang et al.A gRNA-tRNA array forCRISPR-Cas9 based rapid multiplexed genome editing in Saccharomycescerevisiae.Nat Commun 2019,10(1):1053”中的附件材料中公开，其中，pScURA质粒片段可通过人工合成即可得到。
为更好地理解本发明的内容，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK背景菌株CEN.PK 113-5D(可由EUROSCARF获取)为出发菌株，为具体实施例作进一步说明。
下列实施例中所涉及的培养基如下：
LB液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，溶剂为去离子水；固体培养基添加2％琼脂粉。
LB/AMP培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，溶剂为去离子水；固体培养基添加2％琼脂粉，以上灭菌后冷却至40℃左右，加入100μg/mL氨苄青霉素(过滤除菌)。
YPD培养基：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖(单独灭菌后再加入)，溶剂为去离子水；固体培养基添加2％琼脂粉。
SC-Ura营养缺陷培养基：0.77g/L CSM-Ura，1.7g/L YNB w/o AA&w/o(NH4)2SO4(Yeast Nitrogen Base without Amino acids and without Ammonium sulphate)，5.0g/L(NH4)2SO4，20g/L葡萄糖(注：葡萄糖分开灭菌)，调节pH值至5.5-6.0；固体培养基添加2％琼脂粉；溶剂为去离子水。
下述实施例中所涉及的方法如下：
质粒构建：
(1)Gibson组装方法，具体操作依照NEB Gibson Assembly Cloning kit(货号E2611，NEB)说明书操作；
(2)Golden gate组装方法，具体操作依照Golden Gate组装试剂盒(货号E1602L，NEB)说明书操作；
(3)将5μL组装体系转化至50μL大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，涂布至LB/AMP固体培养基过夜培养；
(4)筛选获得阳性克隆，扩增培养后提取质粒，具体提取过程依照HiPure PlasmidMicro Kit(货号P1001-03，Magen)说明书操作。
酵母菌株转化：
如无特殊说明，均采用醋酸锂转化法，具体操作见相关标准规范。
重组酿酒酵母菌株OD600nm的检测方法：
接种酿酒酵母单菌落于3mL发酵培养基，置于30℃、200rpm摇床培养。取发酵液按适当比例稀释后使用紫外分光光度计测量OD600nm。
角鲨烯检测方法：
角鲨烯标品购自Macklin(Shanghai,China)，含量测定时使用岛津高效液相色谱，Hypers11 ODS C18柱(250×4.6mm)，检测波长210nm，流速1mL/min，柱温40℃，100％乙腈洗脱，洗脱20min。
下述实施例中所涉及的引物序列如表1所示：
表1：引物序列(5’-3’)
| Primer-A1F | GGATCCTCATGTAATTAGTTA |
| Primer-A1R | GAGCTCCAGCTTTTGTTCCCT |
| Primer-A2F | AAAAGCTGGAGCTCTTTGCCAGCTTACTATCCTTCTTGA |
| Primer-A2R | TCTTCACCAATTGGTCCATTTTTGAGGGAATATTCAACTGTTTTT |
| Primer-A3F | AAAAACAGTTGAATATTCCCTCAAAAATGGACCAATTGGTGAAGA |
| Primer-A3R | ACTAATTACATGAGGATCCTTAGGATTTAATGCAGGTGACGGACCCA |
| Primer-A4F | AAAGGTCTCAGATCCTATCGCCTCTTGGTTTTTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT |
| Primer-A4R | AAAGGTCTCA TGCGCAAGCCCGGAATCGAACCGGG |
| Primer-A5F | AAAGGTCTCACGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC |
| Primer-A5R | AAAGGTCTCAAAACCTAGACACAGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAGCTC |
| Primer-A6F | GATATATAGCCATAATGAATCAACAAATTGTATTATTATTTCCGACAACAGCATTGCCA |
| Primer-A6R | GAAGTCTCTTTGGAAAAACCAACCTTGATCGCGCAGCAATGTGGCAATGCTGTTGTCGG |
| Primer-A7F | GACCAGGTTCTACTCTTCAC |
| Primer-A7R | GCTCTTCTACAGGCTCAAC |
| Primer-A8F | GCCAGCTTACTATCCTTCTT |
| Primer-A8R | TAATGTTACATGCGTACACG |
| Primer-A9F | AAAGGTCTCAGATCCGATAATGTGCTAGCAAAGG GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT |
| Primer-A10F | GAAGGAAGAACGTTATGTTATTAATGGACTTTTAGTGTCATCGAATTTCAGATTGATTT |
| Primer-A10R | TCGTTTTTTGCCTCTTCTTATGTCATAAGAACTTATGTGAAAAATCAATCTGAAATTCG |
| Primer-A11F | GTAGTCGCAGAGACAACAT |
| Primer-A11R | AAATGGCACCAAACTCCC |
| Primer-A12F | AAAGGTCTCAGATCCAGTGACGATGAAGTAGTAA GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT |
| Primer-A13F | ATATGAGGTTAGGGAAGCCGGATAAAGAAAATAGAGTACTTTAAAACTGTGCAATTTTG |
| Primer-A13R | AAGGAAACGTACTAAGCTCAATTTGTCCACAGTATAATCAACAAAATTGCACAGTTTTA |
| Primer-A14F | CTACAGAGAGCCGTGAGAGTGAG |
| Primer-A14R | GATGCGAGAATACGAGATTA |
实施例1酿酒酵母HMG-CoA还原酶1编码基因的获取
根据UniProt数据库中公开的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HMG-CoA还原酶1(P12683)的核苷酸序列，以酿酒酵母CEN.PK 113-5D基因组为模板，克隆HMG-CoA还原酶1从1591-3165bp共1575bp的DNA编码序列，其中需在截短后的N端加上起始密码子ATG(如SEQ ID No.1所示)。
实施例2酿酒酵母HMG-CoA还原酶1的表达载体的构建
酿酒酵母截短型HMG-CoA还原酶1表达载体p416-Pgal7-tHMG1-Tcyc1的结构如图1所示，具体构建过程如下：
(1)使用引物Primer-A1F/Primer-A1R，以p416-GPD质粒为模板扩增质粒框架；PCR扩增包括常规的变性、退火以及延伸步骤(下同)；其中退火温度为56℃，于72℃延伸300s，扩增30个循环。
(2)使用引物对Primer-A2F/Primer-A2R，以酿酒酵母CEN.PK 113-5D基因组为模板扩增出带有同源臂的GAL7启动子片段；PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
(3)使用引物对Primer-A3F/Primer-A3R，以酿酒酵母CEN.PK 113-5D基因组为模板扩增出带有同源臂的tHMG1片段；PCR扩增的退火温度为54℃，72℃延伸20s，扩增30个循环。
(4)利用Gibson组装技术，将以上三种片段拼接起来，转化大肠杆菌DH5α。
经测序和酶切(通过XbaI和BamHI酶切后的琼脂糖凝胶电泳图如图2所示)验证确认质粒构建成功，构建所得质粒命名为p416-Pgal7-tHMG1-Tcyc1。
实施例3表达酿酒酵母tHMG-CoA还原酶1的酿酒酵母工程菌的构建
3.1敲除SUT067以高产角鲨烯
非编码RNA SUT067敲除过程如下：
(1)构建质粒pCas9-SUT067
非编码RNA SUT067的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
以质粒psgtRNA为模板，由引物对Primer-A4F/Primer-A4R扩增得到带有20bp靶向SUT067的gRNA序列，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
以pScURA质粒片段为模板，由引物对Primer-A5F/Primer-A5R扩增得到1127bp带有营养标记URA3的质粒框架片段；PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸30s，扩增30个循环。
利用Golden gate组装技术，将以上两种片段与带有Cas9质粒片段的pCas质粒拼接起来，构建所得质粒命名为pCas9-SUT067。
(2)PCR扩增SUT067修复片段
合成与SUT067上下游完全匹配的59bp引物对Primer-A6F/Primer-A6R，经PCR扩增、凝胶回收获得与SUT067上下游有50bp同源臂的靶向修复片段，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
(3)通过醋酸锂转化法，将质粒pCas9-SUT067连同SUT067修复片段一并转化至菌株CEN.PK 113-5D，涂布至SC-Ura固体培养基于30℃培养3～4天，使用引物对Primer-A7F/Primer-A7R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子(结果如图3所示)，将质粒pCas9-SUT067去除，得到的酿酒酵母菌株命名为L2。
转化质粒p416-Pgal7-tHMG1-Tcyc1至菌株L2以表达截短型HMG-CoA还原酶1：
将酿酒酵母L2制备成感受态细胞，并通过醋酸锂转化法将酿酒酵母截短型HMG-CoA还原酶1表达质粒p416-Pgal7-tHMG1-Tcyc1转化至该感受态细胞，涂布至SC-Ura固体培养基上于30℃培养3-4天，使用引物对Primer-A8F/Primer-A8R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性菌株(结果如图4中的(B)所示)，将其命名为酿酒酵母L2T。
3.2敲除SUT433以高产角鲨烯
非编码RNA SUT433敲除过程如下：
(1)构建质粒pCas9-SUT433
非编码RNA SUT433的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
以质粒psgtRNA为模板，由引物对Primer-A9F/Primer-A4R扩增得到带有20bp靶向SUT433的gRNA序列，PCR扩增的退火温度为56℃，72℃延伸20s，扩增30个循环。
以pScURA质粒片段为模板，由引物对Primer-A5F/Primer-A5R扩增得到1127bp带有营养标记URA3的质粒框架片段，PCR扩增的退火温度为56℃，72℃延伸30s，扩增30个循环。
利用Golden gate组装技术，将以上两种片段与带有Cas9质粒片段的pCas质粒拼接起来，构建所得质粒命名为pCas9-SUT433。
(2)PCR扩增SUT433修复片段
合成与SUT433上下游完全匹配的59bp引物对Primer-A10F/Primer-A10R，经PCR扩增、凝胶回收获得与SUT433上下游有50bp同源臂的靶向修复片段，PCR扩增的退火温度为56℃，72℃延伸20s，扩增30个循环。
(3)通过醋酸锂转化法，将质粒pCas9-SUT433连同SUT433修复片段一并转化至菌株CEN.PK 113-5D，涂布至SC-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物对Primer-A11F/Primer-A11R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子(结果如图3所示)，将质粒pCas9-SUT433去除，得到的酿酒酵母菌株命名为L3。
转化质粒p416-Pgal7-tHMG1-Tcyc1至菌株L3以表达截短型HMG-CoA还原酶1：
将酿酒酵母L3制备成感受态细胞，并通过醋酸锂转化法将酿酒酵母截短型HMG-CoA还原酶1表达质粒p416-Pgal7-tHMG1-Tcyc1转化至该感受态细胞，涂布至SC-Ura固体培养基上于30℃培养3-4天，使用引物对Primer-A8F/Primer-A8R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性菌株(结果如图4中的(B)所示)，将其命名为酿酒酵母L3T。
3.3敲除CUT782以高产以高产角鲨烯
非编码RNA CUT782敲除过程如下：
(1)构建质粒pCas9-CUT782
非编码RNA CUT782的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
以质粒psgtRNA为模板，由引物对Primer-A12F/Primer-A4R扩增得到带有20bp靶向CUT782的gRNA序列，PCR扩增的退火温度为56℃，72℃延伸20s，扩增30个循环。
以pScURA质粒片段为模板，由引物对Primer-A5F/Primer-A5R扩增得到1127bp带有营养标记URA3的质粒框架片段PCR扩增的退火温度为56℃，72℃延伸30s，扩增30个循环。
利用Golden gate组装技术，将以上两种片段与带有Cas9质粒片段的pCas质粒拼接起来，构建所得质粒命名为pCas9-CUT782。
(2)PCR扩增CUT782修复片段
合成与CUT782上下游完全匹配的59bp引物对Primer-A13F/Primer-A13R，经PCR扩增、凝胶回收获得与CUT782上下游有50bp同源臂的靶向修复片段，PCR扩增的退火温度为56℃，72℃延伸20s，扩增30个循环。
(3)通过醋酸锂转化法，将质粒pCas9-CUT782连同CUT782修复片段一并转化至菌株CEN.PK 113-5D，涂布至SC-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物对Primer-A14F/Primer-A14R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子(结果如图3所示)，将质粒pCas9-CUT782去除，得到的酿酒酵母菌株命名为L4。
转化质粒p416-Pgal7-tHMG1-Tcyc1至菌株L4以表达截短型HMG-CoA还原酶1：
将酿酒酵母L4制备成感受态细胞，并通过醋酸锂转化法将酿酒酵母截短型HMG-CoA还原酶1表达质粒p416-Pgal7-tHMG1-Tcyc1转化至该感受态细胞，涂布至SC-Ura固体培养基上于30℃培养3-4天，使用引物对Primer-A8F/Primer-A8R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性菌株(结果如图4中的(B)所示)，将其命名为酿酒酵母L4T。
实施例4工程菌株发酵生产角鲨烯
(1)分别将酿酒酵母菌株L0T、L1T及上述L2T、L3T和L4T从平板接种至2.5mL YPG发酵培养基，在30℃、200rpm条件下培养96h，其中L0T是空质粒对照菌。L0T的制备过程如下：将酿酒酵母CEN.PK 113-5D制备成感受态细胞，并通过醋酸锂转化法将空质粒p416-Pgal7-Tcyc1转化至该感受态细胞，涂布至SC-Ura固体培养基上于30℃培养3-4天，使用引物对Primer-A8F/Primer-A8R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性菌株(结果如图4中的(A)所示)，将其命名为酿酒酵母L0T。L1T是对照菌，L1T的制备过程如下：将酿酒酵母CEN.PK 113-5D制备成感受态细胞，并通过醋酸锂转化法将酿酒酵母HMG-CoA还原酶1表达质粒p416-Pgal7-tHMG1-Tcyc1转化至该感受态细胞，涂布至SC-Ura固体培养基上于30℃培养3-4天，使用引物对Primer-A8F/Primer-A8R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性菌株(结果如图4中的(B)所示)，将其命名为酿酒酵母L1T。
(2)发酵96h后取发酵液稀释50倍后使用紫外分光光度计测量OD600nm。
(3)取1mL发酵液离心后取上清液500μL，加入1000μL乙酸乙酯。
(4)震荡混匀混合液，离心后取500μL上清液，抽滤。
(5)测定角鲨烯产量。
表达酿酒酵母截短型HMG-CoA还原酶1酵母的检测结果如图5所示，可知L2T、L3T、L4T菌株相比L1T菌株的角鲨烯的产量(15.16mg/L)分别提高211.2％、231.8％、226.7％；图5还显示转入p416-Pgal7-tHMG1-Tcyc1质粒的L1T对照菌株角鲨烯产量相比空质粒p416-Pgal7-Tcyc1对照菌株L0T菌株的角鲨烯的产量(4.639mg/L)提高326％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种酿酒酵母工程菌株在制备角鲨烯中的应用，其特征在于：所述的酵母工程菌株具有如下特点：LncRNA SUT067、LncRNA SUT433和LncRNA CUT782中的至少一种缺失或突变，且含有能表达HMG-CoA还原酶1的编码核酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于包括如下步骤：将所述酿酒酵母工程菌株接种于发酵培养基培养，收集发酵产物即得到角鲨烯。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的酿酒酵母工程菌株通过如下步骤得到：
(1)对酿酒酵母工程菌株的出发菌株进行底盘细胞的改造：将出发菌株中的LncRNASUT067、LncRNA SUT433和LncRNA CUT782中的至少一种进行缺失或突变，得到初步改造的菌株；
(2)tHMG1表达重组载体的构建：将HMG-CoA还原酶1的编码核酸构建于表达载体上，得到tHMG1表达重组载体；
(3)酿酒酵母工程菌株的获得：将tHMG1表达重组载体转化入初步改造的菌株，得到酿酒酵母工程菌株。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于：
所述的酿酒酵母工程菌株的出发菌株为具有CEN.PK背景的菌株。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
所述的酿酒酵母工程菌株的出发菌株为酿酒酵母CEN.PK 113-5D。
6.根据权利要求1～3所述的应用，其特征在于：
所述的HMG-CoA还原酶1是截短型酿酒酵母HMG-CoA还原酶1。
7.根据权利要求1～3所述的应用，其特征在于：
所述的编码核酸的序列如SEQ ID No.1所示。
8.根据权利要求1～3所述的应用，其特征在于：
所述的表达载体为p416GAL、p416GPD、p416TEF、p416ADH、p416CYC1、p426GPD、p426TEF、p426ADH或p426CYC1。
9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的发酵培养基为YPG培养基；
所述的培养的条件为于28～32℃、150～250rpm培养80～120h。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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