CN103131718A - 来源产甘油假丝酵母新型耐高渗功能基因CgHog1的克隆及其应用 - Google Patents

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Abstract

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)耐高渗功能基因CgHog1克隆及其应用，属于分子生物学、生物技术领域。本发明涉及一种新型耐高渗功能基因CgHog1，从产甘油假丝酵母Candida glycerinogenes的染色体基因组中分离得到HOG途径的核心分子Hog1p的基因CgHog1。该基因全长1164bp，该序列无内含子，编码387个氨基酸。该基因是耐高渗功能基因，为今后更好地利用和改造包括产甘油关键酶基因GPD基因在内的600个生物基因表达调控这一重要的生物资源提供十分重要的手段，为利用基因工程技术改善微生物及其他高等真核生物的抗逆性改良提供了更加丰富的优良基因材料。

Description

来源产甘油假丝酵母新型耐高渗功能基因CgHog1的克隆及其应用
技术领域
本发明涉及一种产甘油假丝酵母Hog1基因的克隆、重组及耐高渗透压抗盐性功能分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。 
背景技术
产甘油假丝酵母(Candida glycerolgenesis)是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的工业菌株，能在55％葡萄糖或15％NaCl的高渗透压培养基上正常生长繁殖，具有耐高渗，目标产物高产量、高转化率、生产强度大的特点。 
生物细胞在长期的进化过程中形成了一种保守的生理适应机制来应对外界环境的胁迫，例如：酿酒酵母拥有典型的有丝分裂原激活蛋白酶(MAPK)信号转导途径，其中高渗透压甘油应答途径(HOG途径)对于酵母细胞在耐渗条件下的生长是必需的，而且酿酒酵母的HOG途径是目前已知研究最为透彻的渗透压胁迫应答调控机制，根据报道，酿酒酵母Hog1一旦进入细胞核就调控基因转录，高渗应激下Hog1调节大约包括产甘油关键酶基因GPD基因在内的600个基因表达。但当前研究比较透彻的酵母其本身耐渗透性能不佳，正常生长一般不超过30％葡萄糖或7％NaCl，无法与产甘油假丝酵母相比，主要原因之一就是这些酵母的Hog1基因耐渗透性能不佳，故这些酵母的Hog1基因在生物细胞耐渗透改造中的应用受限制。 
因此，克隆获得耐高盐高渗的产甘油假丝酵母Hog1基因并进行功能研究，是为今后更好地利用及改造包括产甘油关键酶基因GPD基因在内的600个生物基因表达调控这一重要的生物资源提供十分重要的手段。若将耐高盐高渗的功能基因Hog1导入植物，就可以进行耐盐新品种的选育，又若利用Hog1调控GPD高效启动子，可用于工业上浓醪发酵菌株改造。从而为培养抗旱耐盐生物新品种提供了新的材料和新的思路。 
发明内容
本发明从产甘油假丝酵母中分离得到完整的Hog1基因序列，命名为CgHog1。并将CgHog1在真核宿主进行互补表达提高其耐盐、耐高渗功能。以在酿酒酵母Hog1缺失突变株为宿主为例说明。 
本发明的技术方案： 
(1)利用引物P-F：5′-CGCGAATTCATGTCTGCTGATGGAGAATTTA-3′；P-R：5′-GGGAAGCTTTTATTGCTGTTGTTGTTGGTGC-3′，克隆Candida glycerinogenes HOG1基因的全长序列基因SEQ ID NO.1； 
(2)构建包含SEQ ID NO.1的表达载体，在真核宿主，如酿酒酵母Hog1Δ缺陷型突变株Y508中表达，表达的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；以表达载体pYX212为例构建如下： 
根据核苷酸序列SEQ ID NO.1设计一对引物克隆CgHog1基因全序列： 
P-F：5′-CGCGAATTCATGTCTGCTGATGGAGAATTTA-3′； 
P-R：5′-GGGAAGCTTTTATTGCTGTTGTTGTTGGTGC-3′； 
在两引物的5′端分别添加EcoR I和HindIII酶切位点，下划线“_”表示引入的酶切位点。以Candida glycerinogenes基因组DNA为模板，经PCR得到HOG1的基因片段，经TA克隆挑取阳性克隆子。用EcoR I和Hind III双酶切基因片段和质粒pYX212经T4-DNA连接酶连接，导入E.coli JM109中，抗性平板挑取阳性克隆子，阳性克隆子即得表达质粒pYX212-CgHog1。 
(3)CgHog1在耐盐耐高渗的改造应用，以在酿酒酵母Hog1Δ缺陷型突变株Y508为例说明： 
1、CgHog1转入S.cerevisiae Hog1Δ缺失突变株Y508 
将表达载体pYX212-CgHog1和pYX212分别醋酸锂转化S.cerevisiae Hog1缺失突变株Y508，以添加了酸水解干酪素和腺嘌呤，缺少尿嘧啶的培养基筛选转化子。菌落PCR验证转化子Y508-pYX212-CgHog1(Y-C)和Y508-pYX212(Y-p)。 
2、高葡萄糖浓度(浓醪，高渗)下Y508-pYX212-CgHog1与Y508-pYX212的生长。 
分别接种Y508-pYX212-CgHog1与Y508-pYX212于葡萄糖浓度为30％的培养基中，培养48h，菌株Y508-pYX212-CgHog1生长正常，原始对照菌株Y508-pYX212无生长现象。 
3、不同NaCl浓度(盐)Y508-pYX212-CgHog1与Y508-pYX212的耐受试验. 
Y508-pYX212-CgHog1与Y508-pYX212培养到菌浓大约106个/毫升，系列稀释10-1、10-2、10-3、10-4和10-5，点种4μL于NaCl浓度分别为0、0.5、1.0、2.0M的固体培养基中，培养3d观察酿酒酵母Y508-pYX212-CgHog1与Y508-pYX212菌落的差别(见图2.Y508-pYX212-CgHog1(Y-C)和Y508-pYX212(Y-p)在不同NaCl浓度的固体培养基上的菌落形态)。 
通过CgHog1基因在酿酒酵母Hog1Δ缺陷型突变株Y508中互补表达可以看出，重组菌株Y508-CgHog1相较于对照原始菌株Y508抗盐耐高渗能力显著提高，可耐受2.0M以上的盐浓度。 
结果表明转基因Y508相较于原始菌株，盐的耐受性、耐渗透压和甘油产量显著增加； 
本发明的有益效果：本发明从产甘油假丝酵母Candida glycerinogenes的染色体基因组中分离得到HOG途径的核心分子Hog1p的基因CgHog1。该基因全长1164bp，该序列无内含子，编码387个氨基酸。研究表明基因CgHog1功能与在酿酒酵母Hog1完全相同，且性能更佳。该基因的获得扩大了微生物抗渗透压胁迫研究的基因资源，也为产甘油假丝酵母高产甘油的分子机理研究奠定了基础。是为今后更好地利用及改造包括产甘油关键酶基因GPD基因在内的600个生物基因表达调控这一重要的生物资源提供十分重要的手段。若将耐高盐高渗的功能基因Hog1导入植物，就可以加快耐盐新品种的选育，又若利用Hog1调控GPD高效启动子，可用于工业上浓醪发酵菌株改造，从而为培养抗旱耐盐生物新品种提供了新的材料和新的思路。 
附图说明：
图1.PCR扩增CgHog1全基因 
M：DL2000Marker；1：PCR获得的CgHog1全基因 
图2.Y508-pYX212-CgHog1(Y-C)和Y508-pYX212(Y-p)在不同NaCl浓度的固体培养基上的菌落形态 
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明。 
实施例1：Candida glycerinogenes Hog1基因克隆 
利用引物P-F：5′-CGCGAATTCATGTCTGCTGATGGAGAATTTA-3′；P-R：5′-GGGAAGCTTTTATTGCTGTTGTTGTTGGTGC-3′，克降Candida glycerinogenes Hog1基因的全长序列基因SEQ ID NO.1；其核苷酸序列全长1164bp，序列详见SEQ ID NO.1，编码387个氨基酸，并且编码框内不含有内含子。见图1.PCR扩增CgHog1全基因。 
将产甘油假丝酵母Hog1基因序列及其编码蛋白用BLAST程序GeneBank数据库进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现在氨基酸水平上，属于同一家族蛋白，且经验证功能相同。 
实施例2：表达载体pYX212-CgHog1的构建 
根据核苷酸序列SEQ ID NO.1设计一对引物克隆CgHog1基因全序列： 
P-F：5′-CGCGAATTCATGTCTGCTGATGGAGAATTTA-3′； 
P-R：5′-GGGAAGCTTTTATTGCTGTTGTTGTTGGTGC-3′； 
在两引物的5′端分别添加EcoR I和Hind III酶切位点，下划线“_”表示引入的酶切位点。以Candida glycerinogenes基因组DNA为模板，经PCR得到HOG1的基因片段，经TA克隆挑取阳性克隆子。用EcoR I和Hind III双酶切基因片段和质粒pYX212经T4-DNA连接酶连接，导入E.coli JM109中挑取阳性克隆子，即得表达质粒pYX212-CgHog1。 
实施例3：Candida glycerinogenes Hog1基因在提高酿酒酵母Hog1Δ缺陷型突变株Y508中耐盐耐高渗的应用 
1、CgHog1转入S.cerevisiae Hog1Δ缺失突变株Y508 
将表达载体pYX212-CgHog1和pYX212分别醋酸锂转化S.cerevisiae Hog1缺失突变株Y508，以添加了酸水解干酪素和腺嘌呤，缺少尿嘧啶的培养基筛选转化子。菌落PCR验证转化子Y508-pYX212-CgHog1(Y-C)和Y508-pYX212(Y-p)。 
2、高葡萄糖浓度(浓醪，高渗)下Y508-pYX212-CgHog1与Y508-pYX212的生长。 
分别接种Y508-pYX212-CgHog1与Y508-pYX212于葡萄糖浓度为30％的培养基中，培养48h，菌株Y508-pYX212-CgHog1生长正常，原始对照菌株Y508-pYX212无生长现象。 
3、不同NaCl浓度(盐)Y508-pYX212-CgHog1与Y508-pYX212的耐受试验. 
Y508-pYX212-CgHog1与Y508-pYX212培养到菌浓大约106个/毫升，系列稀释10-1、10-2、10-3、10-4和10-5，点种4μL于NaCl浓度分别为0、0.5、1.0、2.0M的固体培养基中，培养3d观察酿酒酵母Y508-pYX212-CgHog1与Y508-pYX212菌落的差别(见图2.Y508-pYX212-CgHog1(Y-C)和Y508-pYX212(Y-p)在不同NaCl浓度的固体培养基上的菌落形态)。 
通过CgHog1基因在酿酒酵母Hog1Δ缺陷型突变株Y508中互补表达可以看出，重组菌株Y508-CgHog1相较于对照原始菌株Y508抗盐耐高渗能力显著提高，可耐受2.0M以上的盐浓度。 
Figure ISA00000831304800011
Figure ISA00000831304800021

Claims (5)

1.一种产甘油假丝酵母(Candidaglycerinogenes)CgHog1基因，其核酸序列为SEQ ID NO.1，其特征在于Candida glycerinogenes耐高渗透压的功能基因。
2.根据权利要求1所示的核苷酸序列，编码Candida glycerinogenes Hog1p，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
3.根据权利要求1所示的核苷酸序列，其特征在于基因分离自Candida glycerinogenes，基因全长1164bp，编码387个氨基酸。
4.如权利1所述Hog1的功能验证，其特征在于能显著提高生物细胞的抗盐耐渗透压能力。
5.如权利1所述Hog1基因用于抗旱、耐盐、浓醪发酵等生物新品的改造。
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