CN103614408A - 一种敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT及其构建方法 - Google Patents

Abstract

一种敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT及其构建方法，它涉及一种自杀质粒及其构建方法。敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT由prcK基因左侧片段prcKL、prcK基因右侧片段prcKR、四环素抗性基因和质粒pUC18构成。构建方法：一、扩增片段prcKL；二、得到质粒pUC18-KL；三、扩增片段prcKR；四、得到质粒pUC18-KLKR；五、扩增四环素抗性基因Tet；六、得到敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT。本发明用于生物工程研究领域。

Description

一种敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种自杀质粒及其构建方法。

背景技术

近年来研究中研究人员发现在某些G⁺菌QS体系中的AIP不仅仅是信号分子，它还具有抗菌能力，如乳酸乳球菌的nisin，植物乳杆菌的植物乳杆菌素等等。这些抗菌肽(antimicrobialpeptide，AMP)的基因簇中除了含有ABC转运体编码基因外，还有一个辅助蛋白(accessoryprotein，AP)编码基因，它们的产物组成了AMP输出和处理体系。AMP的结构基因都位于其相应的免疫蛋白基因之前，产生的AMP大多数富含半胱氨酸，具有疏水性，而且，经研究发现，AMP的最大生产量与产生菌的非最佳生长条件有关。

根据AMP的性质不同，可将AMP分为两大类：一类是I型AMPs或硫醚抗生素，它们是一些对热稳定的肽类，在被分泌之前会被进行高度的翻译后修饰，如nisin、枯草菌素；另一类是II型AMPs或热稳定的AMPs，它们具有特征性的双甘氨酸基序，分泌之前不存在修饰过程，但在分泌后，前体肽的N端会有一个片段被移去，如植物乳杆菌素、乳酸杆菌素P等。

副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)HD1.7，革兰氏阳性菌，2003年从齐齐哈尔丰源食品有限公司乳酸酸菜发酵液中分离获得。它最大的特点是在其发酵液中可产生抑制多种G⁺、G^-和酿酒酵母生长的肽类物质，分子量在10kD左右，热稳定，酸性条件下(pH2～6)活性高，其性能比目前市面上常用的nisin更为优越，因为nisin能有效的抑制革兰氏阳性菌如一些腐败菌、致病菌和芽孢菌，而对革兰氏阴性菌起的作用并不大，甚至不起作用。同时经过研究还发现，当将高密度菌体发酵液(>10¹¹个/mL)添加到低密度菌体发酵液(<10⁵个/mL)中时，可促进低密度菌体中这种AMP的生成；发酵24h和48h的菌体发酵液，其抑菌能力相差较大。以上种种现象说明，该菌产生的这种AMP的产量可能受到菌群密度影响和控制。

国外Nakayama等通过PCR方法克隆到了副干酪乳杆菌拟群体效应相关基因(prcA、prcK和prcR)，但对于这些基因在群体感应中的具体功能，以及AMP产量是否与群体感应有关尚不明确。

目前，基因功能的研究方法主要有两种：一种是增强基因表达，然后对获得的表达产物进行研究；另一种是减弱或者终止基因表达，通过观察生物整体功能的变化，进而推测相应的基因功能。由于第一种方法往往不能反映基因产物的真实表达情况，而逐渐被抛弃。第二种方法中RNA干扰技术（RNAi）实际上只是在转录后水平上降低基因的表达，并不象基因敲除技术可以完全把基因从基因组中剔除掉，有时也会因背景的不干净导致产生的表型难以分析。因此，采用基因敲除技术成为了目前最为理想和合适的方法。

基因敲除技术根据基因打靶的目的不同，载体有不同的设计方法，可分为替换性载体和插入型载体。由于参照Genbank提供的prcK基因序列信息所设计的引物对，反复试验都无法得到副干酪乳杆菌HD1.7的prcK基因特异性条带，因此“副干酪乳杆菌HD1.7prcK基因敲除载体构建及其电转化条件初步确立”中不得不采用拼接的方式构建插入型基因敲除载体，不但同源臂的长度短，仅有550bp，而且构建步骤繁琐、成功率低。又因为无法找到满足四环素抗性基因（tet基因）插入prcK-550片段要求的酶，该方法还不得已在tet基因扩增上游引物中设计了一个突变的碱基，导致突变位点的引入。

发明内容

本发明为了解决现有副干酪乳杆菌HD1.7的prcK基因敲除载体构建过程中自杀载体内同源片段长度短，构建步骤繁琐、成功率低，引入突变位点的缺陷，而提供的一种敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT及其构建方法。

本发明敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT由prcK基因左侧片段prcKL、prcK基因右侧片段prcKR、四环素抗性基因和质粒pUC18构成；片段prcKL的核酸序列如SEQ ID NO：1所示；片段prcKR的核酸序列如SEQ ID NO：2所示。

上述敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT按以下步骤进行构建：

一、以L.paracasei HD1.7基因组DNA为模板PCR扩增prcK基因左侧片段prcKL，扩增片段prcKL的上游引物为prcKL-up，prcKL-up的核苷酸序列为5’-CCGGAGCTCTACCTTAATGATTTAGATGCGAGCG-3’，扩增片段prcKL的下游引物为prcKL-down，prcKL-down的核苷酸序列为5’-GTCGGTACCGATTGTTCCTTCGGTGTGGATGTGT-3’，PCR扩增片段prcKL的反应体系为50μL由10μL含Mg²⁺的5×PrimeSTAR Buffer、4μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP Mixture、10μL浓度为25ng/μL的L.paracasei HD1.7基因组DNA、10μL浓度为1pmol/μL的prcKL-up、10μL浓度为1pmol/μL的prcKL-down、0.5μL浓度为2.5U/μL的PrimeSTAR HS DNA聚合酶和5.5μL灭菌ddH₂O组成；PCR扩增片段prcKL的反应条件为98℃预变性3min，98℃变性10s、62℃退火15s、72℃延伸1.5min，共30个循环，再72℃延伸10min；

二、用限制性内切酶Sac I及Kpn I对质粒pUC18和步骤一获得的片段prcKL分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μl由16.5μl prcKL双酶切片段、5μl质粒pUC18双酶切片段、2.5μl10×T4DNA Ligase Buffer和1μl浓度为3U/μL的T4DNA连接酶组成，16℃过夜连接，得到质粒pUC18-KL；

三、以L.paracasei HD1.7基因组DNA为模板PCR扩增prcK基因右侧片段prcKR，扩增片段prcKR的上游引物为prcKR-up，prcKR-up的核苷酸序列为5’-GTCGGTACCGGTTTTGCCGTCATCAGCGCACTTG-3’，扩增片段prcKR的下游引物为prcKR-down，prcKR-down的核苷酸序列为5’-CCGCTGCAGACTAATCAGCTGGACTAAGGTGTAT-3’，PCR扩增片段prcKR的反应体系为50μL由10μL含Mg²⁺的5×PrimeSTAR Buffer、4μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP Mixture、10μL浓度为25ng/μL的L.paracasei HD1.7基因组DNA、10μL浓度为1pmol/μL的prcKR-up、10μL浓度为1pmol/μL的prcKR-down、0.5μL浓度为2.5U/μL的PrimeSTAR HS DNA聚合酶和5.5μL灭菌ddH₂O组成；PCR扩增片段prcKR的反应条件为98℃预变性3min，98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸1.5min，共30个循环，再72℃延伸10min；

四、用限制性内切酶Pst I及Kpn I对质粒pUC18-KL和步骤三获得的片段prcKR分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μl由16.5μl prcKR双酶切片段、5μl质粒pUC18-KL双酶切片段、2.5μl10×T4DNA Ligase Buffer和1μl浓度为3U/μL的T4DNA连接酶组成，16℃过夜连接，得到质粒pUC18-KLKR；

五、以pBR322质粒为模板PCR扩增四环素抗性基因Tet，扩增Tet的上游引物为Tet-up，Tet-up的核苷酸序列为5’-CCGGGTACCTCTCATGTTTGACAGCTT-3’，扩增Tet的下游引物为Tet-down，Tet-down的核苷酸序列为5’-GTCGGTACCTAATAGATATGTTCTGCCAAGGGT-3’，PCR扩增Tet的反应体系为50μL由10μL含Mg²⁺的5×PrimeSTAR Buffer、4μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP Mixture、10μL浓度为25ng/μL的pBR322质粒、10μL浓度为1pmol/μL的Tet-up、10μL浓度为1pmol/μL的Tet-down、0.5μL浓度为2.5U/μL的PrimeSTAR HS DNA聚合酶和5.5μL灭菌ddH₂O组成；PCR扩增Tet的反应条件为98℃预变性3min，98℃变性10s、46℃退火15s、72℃延伸1.5min，共30个循环，再72℃延伸10min；

六、用限制性内切酶Kpn I对质粒pUC18-KLKR和步骤五获得的四环素抗性基因Tet分别进行酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μl由16.5μl四环素抗性基因Tet酶切片段、5μl质粒pUC18-KLKR酶切片段、2.5μl10×T4DNA Ligase Buffer和1μl浓度为3U/μL的T4DNA连接酶组成，16℃过夜连接，即得到敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT。

构建自杀质粒必须选择出合适的载体，载体质粒在受体菌中不能复制，载体质粒必须带有一个在整合到染色体内以后可供选择的抗性标记，载体质粒带有易于克隆的多克隆位点；必须选择出足够长的同源臂，同源臂越长越有利于同源重组的发生，可降低错误置换的发生率，而且同源臂又必须满足酶切位点的单一性，在同源臂内部不能包含插入时用到的限制性酶切位点；必须选择出合适的目标基因，目标基因片段与替换的片段长度相同，且不含插入时用到的限制性酶切位点，不能引入突变。所以，要同时满足上述所有条件构建自杀质粒的难度非常大。

本发明方法无需扩增出副干酪乳杆菌HD1.7的prcK基因，因此避免了因菌株不同造成的影响。而且不必进行基因拼接，构建步骤少，成功率高。

本发明自杀质粒pYTKLKRT中同源臂的长度达到了2.71kb，远远超过了已知prcK基因自杀质粒敲除技术中同源臂的长度，提高了同源重组率，避免了错误基因置换的发生。而且本发明选用的同源臂不含插入时用到的限制性酶切位点，不含突变位点，具有生物安全性。

本发明利用了四环素抗性基因作为目标基因替换prcK基因，不但使阳性受体菌容易筛选，而且通过四环素抗性的表达证明prcK基因已经被成功的敲除。

本发明为之后研究prcK基因与副干酪乳杆菌拟群体效应奠定了物质基础。

附图说明

图1是实施例1中步骤二获得的质粒pUC18-KL的酶切验证结果图。

图2是实施例1中步骤二获得的质粒pUC18-KLKR的酶切验证结果图。

图3是实施例1中步骤二获得的质粒pYTKLKRT的酶切验证结果图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT由prcK基因左侧片段prcKL、prcK基因右侧片段prcKR、四环素抗性基因和质粒pUC18构成；片段prcKL的核酸序列如SEQ ID NO：1所示；片段prcKR的核酸序列如SEQ ID NO：2所示。

具体实施方式二：本实施方式敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT按以下步骤进行构建：

一、以L.paracasei HD1.7基因组DNA为模板PCR扩增prcK基因左侧片段prcKL，扩增片段prcKL的上游引物为prcKL-up，prcKL-up的核苷酸序列为5’-CCGGAGCTCTACCTTAATGATTTAGATGCGAGCG-3’，扩增片段prcKL的下游引物为prcKL-down，prcKL-down的核苷酸序列为5’-GTCGGTACCGATTGTTCCTTCGGTGTGGATGTGT-3’，PCR扩增片段prcKL的反应体系为50μL由10μL含Mg²⁺的5×PrimeSTAR Buffer、4μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP Mixture、10μL浓度为25ng/μL的L.paracasei HD1.7基因组DNA、10μL浓度为1pmol/μL的prcKL-up、10μL浓度为1pmol/μL的prcKL-down、0.5μL浓度为2.5U/μL的PrimeSTAR HS DNA聚合酶和5.5μL灭菌ddH₂O组成；PCR扩增片段prcKL的反应条件为98℃预变性3min，98℃变性10s、62℃退火15s、72℃延伸1.5min，共30个循环，再72℃延伸10min；

二、用限制性内切酶Sac I及Kpn I对质粒pUC18和步骤一获得的片段prcKL分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μl由16.5μl prcKL双酶切片段、5μl质粒pUC18双酶切片段、2.5μl10×T4DNA Ligase Buffer和1μl浓度为3U/μL的T4DNA连接酶组成，16℃过夜连接，得到质粒pUC18-KL；

三、以L.paracasei HD1.7基因组DNA为模板PCR扩增prcK基因右侧片段prcKR，扩增片段prcKR的上游引物为prcKR-up，prcKR-up的核苷酸序列为5’-GTCGGTACCGGTTTTGCCGTCATCAGCGCACTTG-3’，扩增片段prcKR的下游引物为prcKR-down，prcKR-down的核苷酸序列为5’-CCGCTGCAGACTAATCAGCTGGACTAAGGTGTAT-3’，PCR扩增片段prcKR的反应体系为50μL由10μL含Mg²⁺的5×PrimeSTAR Buffer、4μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP Mixture、10μL浓度为25ng/μL的L.paracasei HD1.7基因组DNA、10μL浓度为1pmol/μL的prcKR-up、10μL浓度为1pmol/μL的prcKR-down、0.5μL浓度为2.5U/μL的PrimeSTAR HS DNA聚合酶和5.5μL灭菌ddH₂O组成；PCR扩增片段prcKR的反应条件为98℃预变性3min，98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸1.5min，共30个循环，再72℃延伸10min；

四、用限制性内切酶Pst I及Kpn I对质粒pUC18-KL和步骤三获得的片段prcKR分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μl由16.5μl prcKR双酶切片段、5μl质粒pUC18-KL双酶切片段、2.5μl10×T4DNA Ligase Buffer和1μl浓度为3U/μL的T4DNA连接酶组成，16℃过夜连接，得到质粒pUC18-KLKR；

五、以pBR322质粒为模板PCR扩增四环素抗性基因Tet，扩增Tet的上游引物为Tet-up，Tet-up的核苷酸序列为5’-CCGGGTACCTCTCATGTTTGACAGCTT-3’，扩增Tet的下游引物为Tet-down，Tet-down的核苷酸序列为5’-GTCGGTACCTAATAGATATGTTCTGCCAAGGGT-3’，PCR扩增Tet的反应体系为50μL由10μL含Mg²⁺的5×PrimeSTAR Buffer、4μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP Mixture、10μL浓度为25ng/μL的pBR322质粒、10μL浓度为1pmol/μL的Tet-up、10μL浓度为1pmol/μL的Tet-down、0.5μL浓度为2.5U/μL的PrimeSTAR HS DNA聚合酶和5.5μL灭菌ddH₂O组成；PCR扩增Tet的反应条件为98℃预变性3min，98℃变性10s、46℃退火15s、72℃延伸1.5min，共30个循环，再72℃延伸10min；

六、用限制性内切酶Kpn I对质粒pUC18-KLKR和步骤五获得的四环素抗性基因Tet分别进行酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μl由16.5μl四环素抗性基因Tet酶切片段、5μl质粒pUC18-KLKR酶切片段、2.5μl10×T4DNA Ligase Buffer和1μl浓度为3U/μL的T4DNA连接酶组成，16℃过夜连接，即得到敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT。

本实施方式引物序列中标注有下划线的部分为酶切位点。

本实施方式步骤一扩增出的片段prcKL长度为1343bp，步骤三扩增出的片段prcKR长度为1369bp，步骤五扩增出的片段Tet长度为1407bp。

由于G^-细菌的质粒不能在G⁺细菌中复制，因此，需在G^-细菌的质粒上加上能在G⁺细菌中表达的抗性基因。本实施方式选择了pUC18作为质粒骨架，以四环素基因作为抗性基因，来构建prcK基因敲除载体。该载体转化进入HD1.7后不能复制，但是能与同源基因发生同源重组整合到HD1.7染色体上，表达出四环素抗性，从而进行筛选。

酶切与连接是关键核心步骤，是影响重组率和实验繁简的关键因素。实验中酶切位点个数、酶切位点的位置和内切酶种类的选择是酶切位点设计中的重中之重和基本因素。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点在于：步骤二中质粒pUC18酶切反应体系为20μL由1μL浓度为10U/μL的Sac I、1μL浓度为10U/μL的Kpn I、2μL10×BufferTango、7μL浓度为80ng/μL的质粒pUC18和9μL无菌ddH₂O组成；37℃恒温酶切2h，并用酶切产物胶回收酶切片段。其他步骤和参数与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三的不同点在于：步骤二中片段prcKL酶切反应体系为20μL由1μL浓度为10U/μL的Sac I、1μL浓度为10U/μL的Kpn I、2μL10×Buffer Tango、10μL浓度为80ng/μL的片段prcKL和6μL无菌ddH₂O组成；37℃恒温酶切2h，并用酶切产物胶回收酶切片段。其他步骤和参数与具体实施方式二或三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二、三或四的不同点在于：步骤四中质粒pUC18-KL酶切反应体系为20μL由1μL浓度为10U/μL的Pst I、1μL浓度为10U/μL的KpnI、2μL10×Buffer Tango、7μL浓度为80ng/μL的质粒pUC18-KL和9μL无菌ddH₂O组成；37℃恒温酶切2h，并用酶切产物胶回收酶切片段。其他步骤和参数与具体实施方式二、三或四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一的不同点在于：步骤四中片段prcKR酶切反应体系为20μL由1μL浓度为10U/μL的Pst I、1μL浓度为10U/μL的Kpn I、2μL10×Buffer Tango、7μL浓度为80ng/μL的片段prcKR和9μL无菌ddH₂O组成；37℃恒温酶切2h，并用酶切产物胶回收酶切片段。其他步骤和参数与具体实施方式二至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一的不同点在于：步骤六中质粒pUC18-KLKR酶切反应体系为20μL由1μL浓度为10U/μL的Kpn I、2μL10×Buffer Tango、7μL浓度为80ng/μL的质粒pUC18-KLKR和10μL无菌ddH₂O组成；37℃恒温酶切2h，并用酶切产物胶回收酶切片段。其他步骤和参数与具体实施方式二至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二至七之一的不同点在于：步骤六中四环素抗性基因Tet酶切反应体系为20μL由1μL浓度为10U/μL的Kpn I、2μL10×Buffer Tango、7μL浓度为80ng/μL的四环素抗性基因Tet和10μL无菌ddH₂O组成；37℃恒温酶切2h，并用酶切产物胶回收酶切片段。其他步骤和参数与具体实施方式二至七之一相同。

实施例1

敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT按以下步骤进行构建：

一、以L.paracasei HD1.7基因组DNA为模板PCR扩增prcK基因左侧片段prcKL，扩增片段prcKL的上游引物为prcKL-up，prcKL-up的核苷酸序列为5’-CCGGAGCTCTACCTTAATGATTTAGATGCGAGCG-3’，扩增片段prcKL的下游引物为prcKL-down，prcKL-down的核苷酸序列为5’-GTCGGTACCGATTGTTCCTTCGGTGTGGATGTGT-3’，PCR扩增片段prcKL的反应体系为50μL由10μL含Mg²⁺的5×PrimeSTAR Buffer、4μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP Mixture、10μL浓度为25ng/μL的L.paracasei HD1.7基因组DNA、10μL浓度为1pmol/μL的prcKL-up、10μL浓度为1pmol/μL的prcKL-down、0.5μL浓度为2.5U/μL的PrimeSTAR HS DNA聚合酶和5.5μL灭菌ddH₂O组成；PCR扩增片段prcKL的反应条件为98℃预变性3min，98℃变性10s、62℃退火15s、72℃延伸1.5min，共30个循环，再72℃延伸10min；

二、用限制性内切酶Sac I及Kpn I对质粒pUC18和步骤一获得的片段prcKL分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μl由16.5μl prcKL双酶切片段、5μl质粒pUC18双酶切片段、2.5μl10×T4DNA Ligase Buffer和1μl浓度为3U/μL的T4DNA连接酶组成，16℃过夜连接，得到质粒pUC18-KL；

三、以L.paracasei HD1.7基因组DNA为模板PCR扩增prcK基因右侧片段prcKR，扩增片段prcKR的上游引物为prcKR-up，prcKR-up的核苷酸序列为5’-GTCGGTACCGGTTTTGCCGTCATCAGCGCACTTG-3’，扩增片段prcKR的下游引物为prcKR-down，prcKR-down的核苷酸序列为5’-CCGCTGCAGACTAATCAGCTGGACTAAGGTGTAT-3’，PCR扩增片段prcKR的反应体系为50μL由10μL含Mg²⁺的5×PrimeSTAR Buffer、4μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP Mixture、10μL浓度为25ng/μL的L.paracasei HD1.7基因组DNA、10μL浓度为1pmol/μL的prcKR-up、10μL浓度为1pmol/μL的prcKR-down、0.5μL浓度为2.5U/μL的PrimeSTAR HS DNA聚合酶和5.5μL灭菌ddH₂O组成；PCR扩增片段prcKR的反应条件为98℃预变性3min，98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸1.5min，共30个循环，再72℃延伸10min；

四、用限制性内切酶Pst I及Kpn I对质粒pUC18-KL和步骤三获得的片段prcKR分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μl由16.5μl prcKR双酶切片段、5μl质粒pUC18-KL双酶切片段、2.5μl10×T4DNA Ligase Buffer和1μl浓度为3U/μL的T4DNA连接酶组成，16℃过夜连接，得到质粒pUC18-KLKR；

五、以pBR322质粒为模板PCR扩增四环素抗性基因Tet，扩增Tet的上游引物为Tet-up，Tet-up的核苷酸序列为5’-CCGGGTACCTCTCATGTTTGACAGCTT-3’，扩增Tet的下游引物为Tet-down，Tet-down的核苷酸序列为5’-GTCGGTACCTAATAGATATGTTCTGCCAAGGGT-3’，PCR扩增Tet的反应体系为50μL由10μL含Mg²⁺的5×PrimeSTAR Buffer、4μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP Mixture、10μL浓度为25ng/μL的pBR322质粒、10μL浓度为1pmol/μL的Tet-up、10μL浓度为1pmol/μL的Tet-down、0.5μL浓度为2.5U/μL的PrimeSTAR HS DNA聚合酶和5.5μL灭菌ddH₂O组成；PCR扩增Tet的反应条件为98℃预变性3min，98℃变性10s、46℃退火15s、72℃延伸1.5min，共30个循环，再72℃延伸10min；

六、用限制性内切酶Kpn I对质粒pUC18-KLKR和步骤五获得的四环素抗性基因Tet分别进行酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μl由16.5μl四环素抗性基因Tet酶切片段、5μl质粒pUC18-KLKR酶切片段、2.5μl10×T4DNA Ligase Buffer和1μl浓度为3U/μL的T4DNA连接酶组成，16℃过夜连接，即得到敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT。

其中，步骤二中质粒pUC18酶切反应体系为20μL由1μL浓度为10U/μL的Sac I、1μL浓度为10U/μL的Kpn I、2μL10×Buffer Tango、7μL浓度为80ng/μL的质粒pUC18和9μL无菌ddH₂O组成；37℃恒温酶切2h，并用酶切产物胶回收酶切片段；

步骤二中片段prcKL酶切反应体系为20μL由1μL浓度为10U/μL的Sac I、1μL浓度为10U/μL的Kpn I、2μL10×Buffer Tango、10μL浓度为80ng/μL的片段prcKL和6μL无菌ddH₂O组成；37℃恒温酶切2h，并用酶切产物胶回收酶切片段；

步骤四中质粒pUC18-KL酶切反应体系为20μL由1μL浓度为10U/μL的Pst I、1μL浓度为10U/μL的Kpn I、2μL10×Buffer Tango、7μL浓度为80ng/μL的质粒pUC18-KL和9μL无菌ddH₂O组成；37℃恒温酶切2h，并用酶切产物胶回收酶切片段；

步骤四中片段prcKR酶切反应体系为20μL由1μL浓度为10U/μL的Pst I、1μL浓度为10U/μL的Kpn I、2μL10×Buffer Tango、7μL浓度为80ng/μL的片段prcKR和9μL无菌ddH₂O组成；37℃恒温酶切2h，并用酶切产物胶回收酶切片段；

步骤六中质粒pUC18-KLKR酶切反应体系为20μL由1μL浓度为10U/μL的Kpn I、2μL10×Buffer Tango、7μL浓度为80ng/μL的质粒pUC18-KLKR和10μL无菌ddH₂O组成；37℃恒温酶切2h，并用酶切产物胶回收酶切片段；

步骤六中四环素抗性基因Tet酶切反应体系为20μL由1μL浓度为10U/μL的Kpn I、2μL10×Buffer Tango、7μL浓度为80ng/μL的四环素抗性基因Tet和10μL无菌ddH₂O组成；37℃恒温酶切2h，并用酶切产物胶回收酶切片段。

将步骤二获得的质粒pUC18-KL转化至E.coli DH5α感受态细胞中，然后接种至卡那霉素浓度为50μg/mL的筛选平板上进行培养，菌落均为阳性菌，挑选阳性菌进行PCR验证（引物为prcKL-up和prcKL-down）和酶切验证（限制性内切酶Sac I及Kpn I）。PCR验证所有泳道均在1340bp左右有清晰条带，与prcKL基因片段大小相符；酶切验证中出现两条清晰的条带（如图1所示），大小分别与质粒pUC18（2.6kb）和prcKL（1.34kb）相符，说明pUC18-KL质粒构建成功。

将步骤四获得的质粒pUC18-KLKR转化至E.coli DH5α感受态细胞中，然后接种至卡那霉素浓度为50μg/mL的筛选平板上进行培养，菌落均为阳性菌，挑选阳性菌进行PCR验证（引物为prcKR-up和prcKR-down）和酶切验证（限制性内切酶Kpn I及Pst I）。PCR验证所有泳道均在1370bp左右有清晰条带，与prcKR基因片段大小相符；酶切验证中出现两条清晰的条带（如图2所示），大小分别与质粒pUC18-KL（3.9kb）和prcKR（1.37kb）相符，说明pUC18-KLKR质粒构建成功。

将步骤六获得的自杀质粒pYTKLKRT转化至E.coli DH5α感受态细胞中，然后接种至四环素浓度为50μg/mL、氨苄青霉素（Ampicillin）浓度为100μg/mL的筛选平板上进行培养，菌落均为阳性菌，挑选阳性菌进行PCR验证（引物为Tet-up和Tet-down）和酶切验证（限制性内切酶Kpn I）。PCR验证所有泳道均在1400bp左右有清晰条带，与Tet基因片段大小相符；酶切验证中出现两条清晰的条带（如图3所示），大小分别与质粒pUC18-KLKR（5.3kb）和Tet（1.4kb）相符，说明pYTKLKRT质粒构建成功。

将自杀质粒pYTKLKRT转化至副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)HD1.7细胞中，电转化条件为电压1.8kV、细菌生长浓度为A₆₀₀=0.78，副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)HD1.7经1%甘氨酸处理，采用AEBl电转缓冲液。

将自杀质粒pYTKLKRT电转化的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)HD1.7细胞接种至四环素浓度为50μg/mL、氨苄青霉素（Ampicillin）浓度为100μg/mL的筛选平板上，挑选阳性菌进行培养再将菌液涂布于含有四环素(70μg/mL)和氨苄青霉素(100pg/mL)的LB平板、37℃过夜培养，平板上有菌落长出；而接种副干酪乳杆菌HD1.7细胞的阴性对照平板上无菌落出现。因为自杀质粒pYTKLKRT在副干酪乳杆菌HD1.7细胞中并不能表达，阳性菌落的出现说明自杀质粒pYTKLKRT中的四环素抗性基因tet已经在副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)HD1.7细胞中基因融合、表达。

根据L.paracasei HD1.7（副干酪乳杆菌HD1.7）中prcK基因两侧的序列、以L.paracaseiHD1.7基因组DNA为模板设计出能够扩增包含prcK基因的引物对，然后利用该特异性引物对自杀质粒pYTKLKRT电转化的阳性副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)HD1.7细胞进行PCR扩增，再将扩增出的片段连接到质粒pUC18上，然后转化至E.coli DH5α感受态细胞中，然后接种至卡那霉素浓度为50μg/mL的筛选平板上进行培养，菌落均为阳性菌，说明自杀质粒pYTKLKRT已经敲除了副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)HD1.7中的prcK基因。挑选阳性菌进行PCR验证（引物为Tet-up和Tet-down）和酶切验证（限制性内切酶Kpn I）。PCR验证所有泳道均在1400bp左右有清晰条带，与Tet基因片段大小相符；酶切验证中也有1400bp左右的清晰条带出现。

Claims (8)

1.一种敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT，其特征在于敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT由prcK基因左侧片段prcKL、prcK基因右侧片段prcKR、四环素抗性基因和质粒pUC18构成；片段prcKL的核酸序列如SEQ ID NO：1所示；片段prcKR的核酸序列如SEQID NO：2所示。

2.上述敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT的构建方法，其特征在于敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT按以下步骤进行构建：

一、以L.paracasei HD1.7基因组DNA为模板PCR扩增prcK基因左侧片段prcKL，扩增片段prcKL的上游引物为prcKL-up，prcKL-up的核苷酸序列为5’-CCGGAGCTCTACCTTAATGATTTAGATGCGAGCG-3’，扩增片段prcKL的下游引物为prcKL-down，prcKL-down的核苷酸序列为5’-GTCGGTACCGATTGTTCCTTCGGTGTGGATGTGT-3’，PCR扩增片段prcKL的反应体系为50μL由10μL含Mg²⁺的5×PrimeSTAR Buffer、4μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP Mixture、10μL浓度为25ng/μL的L.paracasei HD1.7基因组DNA、10μL浓度为1pmol/μL的prcKL-up、10μL浓度为1pmol/μL的prcKL-down、0.5μL浓度为2.5U/μL的PrimeSTAR HS DNA聚合酶和5.5μL灭菌ddH₂O组成；PCR扩增片段prcKL的反应条件为98℃预变性3min，98℃变性10s、62℃退火15s、72℃延伸1.5min，共30个循环，再72℃延伸10min；

二、用限制性内切酶Sac I及Kpn I对质粒pUC18和步骤一获得的片段prcKL分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μl由16.5μl prcKL双酶切片段、5μl质粒pUC18双酶切片段、2.5μl10×T4DNA Ligase Buffer和1μl浓度为3U/μL的T4DNA连接酶组成，16℃过夜连接，得到质粒pUC18-KL；

三、以L.paracasei HD1.7基因组DNA为模板PCR扩增prcK基因右侧片段prcKR，扩增片段prcKR的上游引物为prcKR-up，prcKR-up的核苷酸序列为5’-GTCGGTACCGGTTTTGCCGTCATCAGCGCACTTG-3’，扩增片段prcKR的下游引物为prcKR-down，prcKR-down的核苷酸序列为5’-CCGCTGCAGACTAATCAGCTGGACTAAGGTGTAT-3’，PCR扩增片段prcKR的反应体系为50μL由10μL含Mg²⁺的5×PrimeSTAR Buffer、4μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP Mixture、10μL浓度为25ng/μL的L.paracasei HD1.7基因组DNA、10μL浓度为1pmol/μL的prcKR-up、10μL浓度为1pmol/μL的prcKR-down、0.5μL浓度为2.5U/μL的PrimeSTAR HS DNA聚合酶和5.5μL灭菌ddH₂O组成；PCR扩增片段prcKR的反应条件为98℃预变性3min，98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸1.5min，共30个循环，再72℃延伸10min；

四、用限制性内切酶Pst I及Kpn I对质粒pUC18-KL和步骤三获得的片段prcKR分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μl由16.5μl prcKR双酶切片段、5μl质粒pUC18-KL双酶切片段、2.5μl10×T4DNA Ligase Buffer和1μl浓度为3U/μL的T4DNA连接酶组成，16℃过夜连接，得到质粒pUC18-KLKR；

五、以pBR322质粒为模板PCR扩增四环素抗性基因Tet，扩增Tet的上游引物为Tet-up，Tet-up的核苷酸序列为5’-CCGGGTACCTCTCATGTTTGACAGCTT-3’，扩增Tet的下游引物为Tet-down，Tet-down的核苷酸序列为5’-GTCGGTACCTAATAGATATGTTCTGCCAAGGGT-3’，PCR扩增Tet的反应体系为50μL由10μL含Mg²⁺的5×PrimeSTAR Buffer、4μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP Mixture、10μL浓度为25ng/μL的pBR322质粒、10μL浓度为1pmol/μL的Tet-up、10μL浓度为1pmol/μL的Tet-down、0.5μL浓度为2.5U/μL的PrimeSTAR HS DNA聚合酶和5.5μL灭菌ddH₂O组成；PCR扩增Tet的反应条件为98℃预变性3min，98℃变性10s、46℃退火15s、72℃延伸1.5min，共30个循环，再72℃延伸10min；

六、用限制性内切酶Kpn I对质粒pUC18-KLKR和步骤五获得的四环素抗性基因Tet分别进行酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μl由16.5μl四环素抗性基因Tet酶切片段、5μl质粒pUC18-KLKR酶切片段、2.5μl10×T4DNA Ligase Buffer和1μl浓度为3U/μL的T4DNA连接酶组成，16℃过夜连接，即得到敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT。

3.根据权利要求2所述的敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT的构建方法，其特征在于步骤二中质粒pUC18酶切反应体系为20μL由1μL浓度为10U/μL的Sac I、1μL浓度为10U/μL的Kpn I、2μL10×Buffer Tango、7μL浓度为80ng/μL的质粒pUC18和9μL无菌ddH₂O组成；37℃恒温酶切2h，并用酶切产物胶回收酶切片段。

4.根据权利要求2所述的敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT的构建方法，其特征在于步骤二中片段prcKL酶切反应体系为20μL由1μL浓度为10U/μL的Sac I、1μL浓度为10U/μL的Kpn I、2μL10×Buffer Tango、10μL浓度为80ng/μL的片段prcKL和6μL无菌ddH₂O组成；37℃恒温酶切2h，并用酶切产物胶回收酶切片段。

5.根据权利要求2所述的敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT的构建方法，其特征在于步骤四中质粒pUC18-KL酶切反应体系为20μL由1μL浓度为10U/μL的Pst I、1μL浓度为10U/μL的Kpn I、2μL10×Buffer Tango、7μL浓度为80ng/μL的质粒pUC18-KL和9μL无菌ddH₂O组成；37℃恒温酶切2h，并用酶切产物胶回收酶切片段。

6.根据权利要求2所述的敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT的构建方法，其特征在于步骤四中片段prcKR酶切反应体系为20μL由1μL浓度为10U/μL的Pst I、1μL浓度为10U/μL的Kpn I、2μL10×Buffer Tango、7μL浓度为80ng/μL的片段prcKR和9μL无菌ddH₂O组成；37℃恒温酶切2h，并用酶切产物胶回收酶切片段。

7.根据权利要求2所述的敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT的构建方法，其特征在于步骤六中质粒pUC18-KLKR酶切反应体系为20μL由1μL浓度为10U/μL的Kpn I、2μL10×Buffer Tango、7μL浓度为80ng/μL的质粒pUC18-KLKR和10μL无菌ddH₂O组成；37℃恒温酶切2h，并用酶切产物胶回收酶切片段。

8.根据权利要求2所述的敲除prcK基因的自杀质粒pYTKLKRT的构建方法，其特征在于步骤六中四环素抗性基因Tet酶切反应体系为20μL由1μL浓度为10U/μL的Kpn I、2μL10×Buffer Tango、7μL浓度为80ng/μL的四环素抗性基因Tet和10μL无菌ddH₂O组成；37℃恒温酶切2h，并用酶切产物胶回收酶切片段。

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