CN110846331B - 一种酒酒球菌工程菌的构建方法与应用 - Google Patents

一种酒酒球菌工程菌的构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种酒酒球菌工程菌的构建方法与应用，构建方法步骤如下：(1)制备脂肪酶基因lipase；(2)制备带脂肪酶基因的同源臂基因；(3)制备质粒pMG36e‑lipase；(4)制备nisI片段；(5)制备不含有红霉素序列的线性片段；(6)制备表达载体pMG36n‑lipase；(7)将表达载体pMG36n‑lipase转化酒酒球菌感受态细胞，制得酒酒球菌工程菌。本发明获得的具有降解酯类功能的酒酒球菌工程菌可应用于葡萄酒的制造中，避免目前葡萄酒酿造过程中，由于酯类过多造成对葡萄酒的口感香气等产生的不利影响，以减少酒的保藏时间，缩短葡萄酒达到相同口味的生产周期。

Description

一种酒酒球菌工程菌的构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种酒酒球菌工程菌的构建方法与应用，属于微生物工程技术领域。
背景技术
酒酒球菌(Oenococcus oeni)是乳酸菌的一种，是一种在葡萄酒生产过程中除了酵母菌外，非常重要的菌种。其作用主要是在葡萄酒的后熟，也就是在葡萄酒酿造后期，利用酒酒球菌特殊的作用，将发酵中产生的大量苹果酸，降解成乳酸和CO2，从而提升葡萄酒的口感，并降低其酸度，这一特有的发酵过程称为苹果酸-乳酸发酵(MalolacticFermentation MLF)。因此，酒酒球菌和酵母菌是各国葡萄酒生产中被允许添加的仅有的菌种。
中国专利文献CN104845811A(申请号201510237503.5)公开了一种利用酒酒球菌降解氨基甲酸乙酯的黄酒酿造方法，包括浸米、蒸饭、淋水、落缸搭锅、加曲加水、发酵和后处理，在发酵后第5～20天，向发酵液中接种酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066。本发明通过添加能产生EC降解酶的酒酒球菌CICC6066，来降解在酿酒过程中所产生的EC。酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066属于乳酸菌，它的添加不会引入基因改造菌株，也无需后续处理，能有效克服目前降解氨基甲酸乙酯的两种途径存在的弊端。
葡萄酿酒中，酯的存在对其口味及品质影响极大。其中如果在发酵过程中产生过多的酯类，比如乙酸乙酯，丁酸乙酯，己酸乙酯等会对酒的口感造成不良影响，从而降低葡萄酒的品质。可是由于酿酒葡萄品质、酿酒工艺等因素，在酿造过程中产生酯类是无法完全避免的，对于这种酯类的处理，最好的办法是使用酯酶(Easterase)将其降解。而目前的适于葡萄酿酒的商用酵母和酒酒球菌，其本身的酯酶活性都很弱。因此，如果采用适当的方法和手段，对酵母或者酒酒球菌进行改造，提高其酯酶活性，就能很好的解决上述问题。考虑到随着发酵的进行，发酵液中的乙醇含量逐渐增加，当酒精浓度达到10％时，大量酵母就要死亡，不能在葡萄酒中长期存在；而酒酒球菌对乙醇则均有更高的耐受性，当酒精浓度到达16％时依然能够存活，可以在葡萄酒中长期存活。基于上述特点，酒酒球菌更加适合酯酶的改造对象。
但由于酒酒球菌直接施用于食品中，而目前对于食品用食用菌的基因改造限制严格，特别是不能采用抗生素抗性基因进行标记，而现有常规的食用菌来源的标记又无法适用于酒酒球菌，导致目前并没有针对酒酒球菌进行基因改造的相关报道，此外，酒酒球菌感受态细胞转化率低，也是制约其改造的主要原因。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种酒酒球菌(Oenococcus oeni)工程菌的构建方法与应用。
本申请以酒酒球菌为研究对象，采取分子生物学方法，从一株具有高脂酶活性的植物乳杆菌中，克隆其酯酶基因lipase，并将其与乳酸菌表达载体pMG36e连接，构建成型的pMG36e-lipase质粒。然后再使用同源重组方法，将质粒中的红霉素抗性片段敲除，置换成符合食品安全的乳酸菌素抗性片段，构建成食品级(GRAS级：Generally Recognized AsSafe)乳酸菌载体pMG36n-lipase，然后转化至宿主酒酒球菌中成功表达。经葡萄酒发酵实验验证，添加经改造的酒酒球菌后，大大降低了发酵液中酯类的含量。
本发明技术方案如下：
一种酒酒球菌(Oenococcus oeni)工程菌的构建方法，步骤如下：
(1)提取植物乳酸杆菌基因组DNA，经PCR扩增，获得脂肪酶基因lipase；
所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
F:5’-ATGCAAGTTATTAAGCAAAAATTAAC-3’SEQ ID NO.1
R:5’-CTAACGATTATCAGCTAGCCATTCAAG-3’SEQ ID NO.2
(2)以质粒pMG36e为模板，经PCR扩增，获得带脂肪酶基因的同源臂基因；
所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
F:5’-AAGCTTGCAAAGTCTGAAAACGA-3’SEQ ID NO.3
R:5’-GAGCTCGAATTACGAATTTTTCTG-3’SEQ ID NO.4
(3)分别将步骤(1)制得的脂肪酶基因lipase和步骤(2)制得的带脂肪酶基因的同源臂基因经线性化后，连接，转化至大肠杆菌，筛选，获得质粒pMG36e-lipase；
(4)以pET30a-nisI质粒为模板，经PCR扩增，获得nisI片段；
所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
F:5’-CCAAATTAAAGAGGGTTATAATGAGAAGATATTTAATACTTATTGTGGCC-3’SEQ ID NO.5
R:5’-CAGTTTATGCATCCCTTAACCTAGTTTCCTACCTTCGTTGCAAG-3’SEQ ID NO.6
(5)以步骤(3)制得的质粒pMG36e-lipase为模板，进行PCR扩增，制得不含有红霉素序列的线性片段；
所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；
F:5’-TATAACCCTCTTTAATTTGGTTATATG-3’SEQ ID NO.7
R:5’-GTTAAGGGATGCATAAACTGCATC-3’SEQ ID NO.8
(6)将步骤(4)制得的nisI片段与步骤(5)制得的不含有红霉素序列的线性片段经连接后，转化乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MG1363感受态细胞，筛选，制得表达载体pMG36n-lipase；
(7)将步骤(6)制得的表达载体pMG36n-lipase转化酒酒球菌Oenococcus oeni感受态细胞，然后在含有Nisin的平板上进行筛选培养，制得酒酒球菌(Oenococcus oeni)工程菌。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增体系如下，总体系50μl:
Figure BDA0002289290740000031
PCR扩增程序如下：
98℃预变性3min，98℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，35个循环；68℃终延伸10min。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增体系如下，总体系50μl:
Figure BDA0002289290740000032
PCR扩增程序如下：
98℃预变性3min，98℃变性30s，50℃退火30s，68℃延伸4min，35个循环；68℃终延伸10min。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，筛选为将转化后的大肠杆菌涂布于含浓度为200μg/L红霉素的LB固体平板培养基上，在35～37℃条件下培养20～28小时，选取转化子，经测序验证，即得。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，PCR扩增体系如下，总体系50μl:
Figure BDA0002289290740000033
Figure BDA0002289290740000041
PCR扩增程序如下：
98℃预变性3min，98℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，35个循环；68℃终延伸10min。
根据本发明优选的，所述步骤(5)中，PCR扩增体系如下，总体系50μl:
Figure BDA0002289290740000042
PCR扩增程序如下：
98℃预变性3min，98℃变性30s，50℃退火30s，68℃延伸4min，35个循环；68℃终延伸10min。
根据本发明优选的，所述步骤(6)中，筛选为将转化后的乳酸乳球菌经复苏培养后，涂布于含浓度为40U/mL乳酸菌素Nisin的M17培养基的平板上，37℃静置培养48h，选取阳性菌落，经测序验证，即得。
根据本发明进一步优选的，所述复苏培养为在M17复苏培养基中，37℃静置培养2～3h。
根据本发明进一步优选的，所述M17培养基组份如下：
大豆蛋白胨5.0g/L，酵母提取物5.0g/L，动物蛋白胨5.0g/L，硫酸镁0.25g/L，抗坏血酸0.5g/L，牛肉浸膏5.0g/L，β-甘油磷酸二钠19g/L，葡萄糖5.0g/L，固体培养基还要添加琼脂15g/L。
更优选的，所述M17复苏培养基组份如下：
添加了葡萄糖0.5g/L，蔗糖17.1g/L，氯化镁1.0mol/L，氯化钙1.0mol/L的M17培养基。
根据本发明优选的，所述步骤(7)中的酒酒球菌Oenococcus oeni感受态细胞，采用如下步骤制备：
将酒酒球菌Oenococcus oeni使用添加质量百分比2.5～3.5％甘氨酸的mFT80培养基活化，培养至对数期OD600＝0.35，离心收集细胞，然后用含0.5mmoL/L蔗糖、10％(体积百分比)甘油溶液室温下冲洗3～5次，制得酒酒球菌Oenococcus oeni感受态细胞。
根据本发明进一步优选的，所述mFT80培养基组份如下：
牛肉浸粉5.0g/L，酵母粉4.0g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，氯化钾0.45g/L，氯化钙0.13g/L，硫酸镁0.13g/L，硫酸锰0.003g/L，吐温80 1mL，L-苹果酸10g/L，果糖35g/L，葡萄糖5.0g/L。
根据本发明优选的，所述步骤(7)中的转化，条件为：1.25KV，200Ω，25μF电转1.0秒。
根据本发明优选的，所述步骤(7)中，含有Nisin的平板为含有浓度15～25U/mLNisin的mFT80固体培养基。
根据本发明优选的，所述步骤(7)中，筛选培养，步骤如下：
将转化后的酒酒球菌Oenococcus oeni加入含0.5moL/L蔗糖的mFT80培养基中，27～30℃静止培养3～5h，离心取细胞，涂布于含20U/mL Nisin的mFT80固体培养基中，27～30℃静止培养6～8天。
根据本发明进一步优选的，所述mFT80固体培养基组份如下：
添加了琼脂15g/L的mFT80液体培养基。
一株酒酒球菌(Oenococcus oeni)工程菌，采用上述构建方法制备。
上述酒酒球菌(Oenococcus oeni)工程菌做为酯类降解菌在制备酒中的应用。
根据本发明进一步优选的，所述酒为酒精度低于16度的果酒或粮食酒。
有益效果
1、本发明首次利用脂肪酶基因lipase改造酒酒球菌，并利用分子生物学手段对其进行一系列改造，获得了一株具有降解酯类功能的酒酒球菌工程菌；该菌株应用于葡萄酒的制造中时，可以避免目前葡萄酒酿造过程中，由于酯类过多造成对葡萄酒的口感香气等产生的不利影响，以减少酒的保藏时间，缩短葡萄酒达到相同口味的生产周期；
2、本发明通过采用乳酸链球菌素抗性片段标记，由于不含有抗生素抗性基因，发酵过程中不用添加抗生素进行诱导，完全符合食品安全需要；
3、本发明首次发现，当采用特定培养基活化酒酒球菌Oenococcus oeni后，可以显著增加表达载体pMG36n-lipase转化的成功率。
具体实施方式
以下实施例是为了更好地说明本发明的内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护权利要求范围不限于所提供的案例。
材料与试剂
酒酒球菌Oenococcus oeni CICC 6057，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，现有已知菌株，普通市售产品；
植物乳杆菌HX1(Lactobacillus plantarum HX1)，2017年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No.M 2017522，现有已知菌株，可参见中国专利文献CN108077826A；
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MG1363，普通市售菌株，购自普如汀生物技术(北京)有限公司；
质粒pMG36e、质粒pET30a-nisI普通市售产品，购自普如汀生物技术(北京)有限公司；
基因组提取，质粒提取，基因纯化以及重组酶试剂等均购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
培养基成分
M17肉汤培养基：购自北京陆桥技术股份有限公司
mFT80培养基组：牛肉浸粉5.0g/L，酵母粉4.0g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，氯化钾0.45g/L，氯化钙0.13g/L，硫酸镁0.13g/L，硫酸锰0.003g/L，吐温80 1mL，L-苹果酸10g/L，果糖35g/L，葡萄糖5.0g/L。
酸性番茄培养基(ATB基础培养基)：蛋白胨1％，酵母浸出物0.5％，葡萄糖1％，MgSO4·7H2O 0.02％，MnSO4·4H2O 0.005％，盐酸半胱氨酸0.5g/L，番茄汁25％，液体培养基调节p H值至4.8。
实施例1
一种酒酒球菌(Oenococcus oeni)工程菌的构建方法，步骤如下：
(1)根据细菌基因组DNA提取试剂盒的方法进行植物乳酸杆菌基因组的提取，加入50μL ddH2O，-20℃保存；
(2)在GenBank上植物乳酸杆菌的脂肪酶基因，设计如下引物
F:5’-ATGCAAGTTATTAAGCAAAAATTAAC-3’SEQ ID NO.1
R:5’-CTAACGATTATCAGCTAGCCATTCAAG-3’SEQ ID NO.2
(3)将步骤(2)脂肪酶基因引物，以步骤(1)植物乳酸杆菌基因组为模板，PCR扩增脂肪酶基因lipase片段；
所述步骤PCR扩增体系如下，总体系50μl:
Figure BDA0002289290740000061
PCR扩增程序如下：
98℃预变性3min，98℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，35个循环；68℃终延伸10min；
(4)根据质粒pMG36e序列，设计带脂肪酶基因的同源臂的引物，同源臂序列位于质粒多克隆位点MCS区域两侧，引物序列如下：
F:5’-AAGCTTGCAAAGTCTGAAAACGA-3’SEQ ID NO.3
R:5’-GAGCTCGAATTACGAATTTTTCTG-3’SEQ ID NO.4
(5)用质粒提取盒提取pMG36e质粒，以此为模板，用步骤(4)引物PCR扩增pMG36e的线性片段；
所述步骤PCR扩增体系如下，总体系50μl:
Figure BDA0002289290740000071
PCR扩增程序如下：
98℃预变性3min，98℃变性30s，50℃退火30s，68℃延伸4min，35个循环；68℃终延伸10min；
(6)按照基因重组连接试剂盒的要求，将步骤(3)(5)纯化后的线性pMG36e-片段与lipase片段进行重组连接。
(7)将步骤(6)连接后的产物通过热击转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含红霉素(200μg/L)的LB固体平板培养基上，挑选转化子进行提取质粒进行lipase基因PCR扩增，测序验证，验证成功后的转化子就是含有新构建质粒pMG36e-lipase。
(8)用NCBI上查询到的nisI序列，设计带pMG36e同源臂的引物，同源臂位于质粒中红霉素抗性基因两侧；
F:5’-CCAAATTAAAGAGGGTTATAATGAGAAGATATTTAATACTTATTGTGGCC-3’SEQ ID NO.5
R:5’-CAGTTTATGCATCCCTTAACCTAGTTTCCTACCTTCGTTGCAAG-3’SEQ ID NO.6
以pET30a-nisI质粒为模板，以上引物PCR扩增nisI片段；
所述步骤PCR扩增体系如下，总体系50μl:
Figure BDA0002289290740000081
PCR扩增程序如下：
98℃预变性3min，98℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，35个循环；68℃终延伸10min；
(9)根据质粒pMG36e-lipase不含红霉素序列的片段，设计如下引物：
F:5’-TATAACCCTCTTTAATTTGGTTATATG-3’SEQ ID NO.7
R:5’-GTTAAGGGATGCATAAACTGCATC-3’SEQ ID NO.8
以步骤(7)中提取的pMG36e-lipase质粒为模板，进行PCR扩增，其产物是质粒不含有红霉素序列的线性片段；
所述步骤PCR扩增体系如下，总体系50μl:
Figure BDA0002289290740000082
PCR扩增程序如下：
98℃预变性3min，98℃变性30s，50℃退火30s，68℃延伸4min，35个循环；68℃终延伸10min；
(10)按照同源重组酶试剂盒要求，将步骤(8)(9)纯化后的片段进行同源重组连接，与200μL制作好的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MG1363感受态细胞混合后，移入间距为2mm的电转杯中，冰上静置5min，使用高压脉冲电转仪电击转化，电转参数为：电压1.5KV，电阻200。电击常数5ms，电容25μF，进行电击转化。
电击完毕后，迅速向电转杯中加入1800μLMRS复苏培养基。37℃静置培养2-3h。取200μl复苏的菌液，涂布含40U/mL乳酸菌素Nisin的M17培养基的平板上，37℃静置培养48h。挑选阳性菌落扩大培养，提取质粒，分别用nisI引物与lipase引物进行扩增，并进行测序验证。如果验证正确，说明表达载体pMG36n-lipase的构建成功。
(11)将酒酒球菌Oenococcus oeni使用添加3％甘氨酸mFT80培养基活化，培养至对数期OD600＝0.35，离心收集，用含0.5mmoL/L蔗糖，10％(v/v)甘油溶液室温下冲洗4次，加入含有5mmoL/L磷酸钾，0.2mmoL/L Mgcl2，10％(v/v)乙醇的溶液分装保藏，制备成Oenococcus oeni感受态。
(12)将500ng步骤(10)中的pMG36n-lipase质粒与100μL步骤(11)的Oenococcusoeni感受态混合，放入2mm电转杯，1.25KV，200Ω，25μF电转，立即1mL加入含0.5moL/L蔗糖的mFT80培养基中，28℃静止培养4h。然后离心，涂板于含有20U/mL浓度Nisin的mFT80固体培养基中，培养7d。
挑选阳性菌落扩大培养，提取质粒，分别用nisI引物与lipase引物进行扩增，并进行测序验证。如果验证正确，说明转化成功，新的菌株为Oenococcus oeni/pMG36n-lipase。
实施例2上述酒酒球菌Oenococcus oeni工程菌在生产葡萄酒中的应用
将本发明构建的菌种，经过添加了10mg/L的SO2，10％(体积百分比)无水乙醇以及20U/mL浓度Nisin的酸性番茄培养基(ATB培养基)驯化3-5d；再以5％的质量百分比添加到葡萄汁中，在20℃培养5d进行扩大培养；然后按照1-3％的质量百分比添加到前期已经过酵母发酵的葡萄酒发酵液中进行后熟，同时按照10-20U/mL浓度添加食品添加剂Nisin。
实施例3
葡萄酒中乙酸乙酯，乙酸丁酯，乙酸异戊酯以及己酸乙酯的测定，参照QBT4850-2015标准。
通过添加不同的酒酒球菌，测定以上酯类的含量，检测结果如下：
Figure BDA0002289290740000091
结果分析
通过对上述检测结果进行分析，得出酒酒球菌Oenococcus oeni工程菌对以上酯类都有一定程度的降解作用，尤其是针对乙酸乙酯效果非常明显，其含量降低了80％以上。
对比例1
如实施例1所述的菌株的建立方法，不同之处在于，步骤(4)(5)(6)的方法改为传统的质粒酶切，然后与克隆片段连接的方法。
通过使用DNAMAN软件对植物乳杆菌酯酶基因lipase进行分析，发现其序列中竟然有21种限制性内切酶位点，再根据pMG36e图谱中提供的多克隆位点MCS，选择了两种限制性内切酶Sac I和Hind III，通过设计含有酶切位点的引物进行PCR扩增，然后与克隆载体连接，转化，再经过提质粒，酶切，连接，再次转化，虽然也能构建成功pMG36e-lipase，但是至少要2-3天的时间。
结果分析
由于本发明所克隆的来自植物乳杆菌HX1(Lactobacillus plantarum)脂肪酶基因序列内部含有多个和限制性内切酶相同的序列，将PCR产物进行酶切后与载体连接，如果酶切位点和基因内部序列相同，会造成基因内部断裂，无法获得完整的克隆片段；而本发明采用同源重组酶进行连接的方法，解决了以上问题，只要克隆片段和载体的线性片段有相似的序列(同源臂)，就会被酶识别并连接。并且连接时间短，不到1小时，而传统的酶切、连接方法需要过夜，花费时间较长。
对比例2
如实施例1所述的菌株的建立方法，不同之处在于，省略了步骤(8)(9)(10)，直接用质粒pMG36e-lipase转化到酒酒球菌Oenococcus oeni中。
当pMG36e-lipase成功转化到酒酒球菌Oenococcus oeni后，将Oenococcus oeni/pMG36e-lipase经过放大培养，然后按比例添加到葡萄酒中进行后熟发酵，通过对发酵后的葡萄酒进行分析，同样达到了降低乙酸乙酯等酯类的效果。
结果分析
虽然Oenococcus oeni/pMG36e-lipase也具有酯酶功能，但是如果将其运用到葡萄酒发酵中，为了确保细胞中的质粒不丢失，要在发酵过程中添加一定的红霉素，这是不符合食品安全生产规范的。而本发明中的pMG36n-lipase是将原质粒中的红霉素抗性片段置换成乳酸菌素(Nisin)抗性片段，Nisin是乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp)产生的一种小肽，对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌有强烈的抑制作用，可作为乳酸菌表达系统的筛选标记。Nisin食用后在人体的生理条件和α-胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不会改变人体肠道内的正常菌群，也不会产生其它抗生素抗性基因引起的抗性问题，已经被美国FDA及多国政府批准为一种允许在食品生产中使用的添加剂。因此实施例1中构建的菌种，按照实施例2中的方法运用到葡萄酒的生产中，是完全符合食品安全生产规范的。
对比例3
如实施例1所述的菌株的建立方法，不同之处在于，步骤(11)甘氨酸的添加比例为0％，1％，5％。
按照对比例3中甘氨酸浓度的制备的Oenococcus oeni感受态，与实施例1中的感受态，在其他参数相同的条件下与质粒一起电转，经复苏后培养后平板上生成的转化子数量如下表所示。
Figure BDA0002289290740000101
从上表可知，实施例1中甘氨酸浓度所制备的感受态细胞，其转化子生成数量要远高于对比例3中的不同甘氨酸浓度制备的感受态细胞，说明其具有更高的转化效率。
序列表
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种酒酒球菌工程菌的构建方法与应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
atgcaagtta ttaagcaaaa attaac 26
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
ctaacgatta tcagctagcc attcaag 27
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
aagcttgcaa agtctgaaaa cga 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
gagctcgaat tacgaatttt tctg 24
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
ccaaattaaa gagggttata atgagaagat atttaatact tattgtggcc 50
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
cagtttatgc atcccttaac ctagtttcct accttcgttg caag 44
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 7
tataaccctc tttaatttgg ttatatg 27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 8
tataaccctc tttaatttgg ttatatg 27

Claims (18)

1.一种酒酒球菌（Oenococcus oeni）工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
（1）提取植物乳酸杆菌基因组DNA，经PCR扩增，获得脂肪酶基因lipase；
所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述的植物乳酸杆菌为植物乳酸杆菌HX1，菌种保藏编号为CCTCC No.M 2017522；
（2）以质粒pMG36e为模板，经PCR扩增，获得带脂肪酶基因的同源臂基因；
所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
（3）分别将步骤（1）制得的脂肪酶基因lipase和步骤（2）制得的带脂肪酶基因的同源臂基因经线性化后，连接，转化至大肠杆菌，筛选，获得质粒pMG36e-lipase；
（4）以pET30a-nisI质粒为模板，经PCR扩增，获得nisI片段；
所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
（5）以步骤（3）制得的质粒pMG36e-lipase为模板，进行PCR扩增，制得不含有红霉素序列的线性片段；
所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；
（6）将步骤（4）制得的nisI片段与步骤（5）制得的不含有红霉素序列的线性片段经连接后，转化乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）MG1363感受态细胞，筛选，制得表达载体pMG36n-lipase；
（7）将步骤（6）制得的表达载体pMG36n-lipase转化酒酒球菌Oenococcus oeni感受态细胞，然后在含有Nisin的平板上进行筛选培养，制得酒酒球菌（Oenococcus oeni）工程菌；
所述酒酒球菌Oenococcus oeni感受态细胞，采用如下步骤制备：
将酒酒球菌Oenococcus oeni使用添加质量百分比2.5～3.5%甘氨酸的mFT80培养基活化，培养至对数期OD600=0.35，离心收集细胞，然后用含0.5mmoL/L 蔗糖、10%（体积百分比）甘油溶液室温下冲洗3～5次，制得酒酒球菌Oenococcus oeni感受态细胞。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中，PCR扩增体系如下，总体系50μl:
10×PCR Buffer 10μL
dNTP 4μL
Pfu Taq 0.7μL
上游引物 1μL
下游引物 1μL
模板 1μL
ddH2O 32.3μL
PCR扩增程序如下：
98℃预变性 3min，98℃变性 30s， 55℃退火 30s， 68℃延伸1 min，35 个循环； 68℃终延伸10min。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中，PCR扩增体系如下，总体系50μl:
10×PCR Buffer 10μL
dNTP 4μL
Pfu Taq 0.7μL
上游引物 1μL
下游引物 1μL
模板 1μL
ddH2O 32.3μL
PCR扩增程序如下：
98℃预变性 3min，98℃变性 30s， 50℃退火 30s， 68℃延伸4 min，35 个循环； 68℃终延伸10min。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，筛选为将转化后的大肠杆菌涂布于含浓度为200µg/L红霉素的LB固体平板培养基上，在35～37℃条件下培养20～28小时，选取转化子，经测序验证，即得。
5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（4）中，PCR扩增体系如下，总体系50μl:
10×PCR Buffer 10μL
dNTP 4μL
Pfu Taq 0.7μL
上游引物 1μL
下游引物 1μL
模板 1μL
ddH2O 32.3μL
PCR扩增程序如下：
98℃预变性 3min，98℃变性 30s， 55℃退火 30s， 68℃延伸1 min，35 个循环； 68℃终延伸10min。
6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（5）中，PCR扩增体系如下，总体系50μl:
10×PCR Buffer 10μL
dNTP 4μL
Pfu Taq 0.7μL
上游引物 1μL
下游引物 1μL
模板 1μL
ddH2O 32.3μL
PCR扩增程序如下：
98℃预变性 3min，98℃变性 30s， 50℃退火 30s， 68℃延伸4 min，35 个循环； 68℃终延伸10min。
7.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（6）中，筛选为将转化后的乳酸乳球菌经复苏培养后，涂布于含浓度为40U/mL乳酸菌素Nisin 的M17培养基的平板上，37℃静置培养48h，选取阳性菌落，经测序验证，即得。
8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述复苏培养为在M17复苏培养基中，37℃静置培养2～3h。
9.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于所述M17培养基组份如下：
大豆蛋白胨5.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，动物蛋白胨5.0 g/L，硫酸镁 0.25 g/L，抗坏血酸0.5 g/L，牛肉浸膏5.0g/L，β-甘油磷酸二钠19 g/L，葡萄糖5.0g/L，固体培养基还要添加琼脂15g/L。
10.如权利要求9所述的构建方法，其特征在于所述M17复苏培养基组份如下：
添加了葡萄糖0.5 g/L，蔗糖17.1g/L，氯化镁1.0 mol/L，氯化钙1.0 mol/L 的M17培养基。
11.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（7）中，所述mFT80培养基组份如下：
牛肉浸粉5.0 g/L，酵母粉 4.0 g/L，磷酸二氢钾0.6 g/L，氯化钾 0.45 g/L，氯化钙0.13 g/L，硫酸镁 0.13 g/L，硫酸锰 0.003 g/L，吐温80 1mL，L-苹果酸 10 g/L，果糖 35g/L，葡萄糖 5.0 g/L。
12.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（7）中的转化，条件为：1.25KV，200Ω，25 μF电转1.0秒。
13.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（7）中，含有Nisin的平板为含有浓度15～25U/mL Nisin的mFT80固体培养基。
14.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（7）中，筛选培养，步骤如下：
将转化后的酒酒球菌Oenococcus oeni加入含0.5moL/L 蔗糖的mFT80培养基中，27～30℃静止培养3～5h，离心取细胞，涂布于含20U/mL Nisin的mFT80固体培养基中，27～30℃静止培养6～8天。
15.如权利要求14所述的构建方法，其特征在于，所述mFT80固体培养基组份如下：
添加了琼脂15 g/L的mFT80液体培养基。
16.一株酒酒球菌（Oenococcus oeni）工程菌，采用权利要求1所述构建方法制备。
17.权利要求16所述酒酒球菌（Oenococcus oeni）工程菌做为酯类降解菌在制备酒中的应用。
18.如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述酒为酒精度低于16度的果酒或粮食酒。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586314A (zh) * 2012-02-15 2012-07-18 白杨 以Nisin作为天然抗性筛选标记的乳酸菌表达质粒的构建
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Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586314A (zh) * 2012-02-15 2012-07-18 白杨 以Nisin作为天然抗性筛选标记的乳酸菌表达质粒的构建
CN104845811A (zh) * 2015-05-12 2015-08-19 浙江大学 一种利用酒酒球菌降解氨基甲酸乙酯的黄酒酿造方法
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A survey of lactic acid bacteria for enzymes of interest to oenology;Matthews等;《AUSTRALIAN JOURNAL OF GRAPE AND WINE RESEARCH》;20061231;第12卷(第3期);第235-244页 *
南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）在乳酸乳球菌MG1363中的表达;尹建洪;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20130115(第1期);第19页第1段，第26页第3-4段，第27页第1段 *
应用体外DNA同源重组技术构建pcDNA3.1-NGF和pcDNA3.1-TrkA;张严等;《江苏大学学报》;20110930;第21卷(第5期);摘要部分，讨论部分 *

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