CN104845811A - 一种利用酒酒球菌降解氨基甲酸乙酯的黄酒酿造方法 - Google Patents

一种利用酒酒球菌降解氨基甲酸乙酯的黄酒酿造方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用酒酒球菌降解氨基甲酸乙酯的黄酒酿造方法，包括浸米、蒸饭、淋水、落缸搭锅、加曲加水、发酵和后处理，在发酵后第5～20天，向发酵液中接种酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066。本发明通过添加能产生EC降解酶的酒酒球菌CICC6066，来降解在酿酒过程中所产生的EC。酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066属于乳酸菌，它的添加不会引入基因改造菌株，也无需后续处理，能有效克服目前降解氨基甲酸乙酯的两种途径存在的弊端。

Description

一种利用酒酒球菌降解氨基甲酸乙酯的黄酒酿造方法
技术领域
本发明涉及食品安全与发酵酿造领域，尤其涉及一种利用酒酒球菌降解氨基甲酸乙酯的黄酒酿造方法。
背景技术
氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，简称为EC)伴随发酵食品(如面包、酸牛奶、酱油等)和酒精饮料(如葡萄酒、啤酒、中国黄酒和日本清酒等)酿造过程产生，是由氨甲酰类化合物与乙醇自发反应所生成的致癌物。
目前普遍认为EC的产生有两种途径：一种是酵母的尿素循环途径(参考文献：Uthurry CA，Varela F，Colomo B.Ethyl carbamate concentrations oftypical Spanish red wines[J].Food Chemistry，2004，88：329-336)，在酒类酿造过程中，酵母降解精氨酸生成尿素和鸟氨酸。细胞中的尿素不会立即进行降解，而是根据细胞对氮代谢的调节，部分被释放到酒液中，与乙醇自发反应形成EC；另一种是乳酸菌的精氨酸脱亚胺酶途径(参考文献：Liu SQ，Pritchard G G，Hardman M L，et al.Occurrence of arginine deiminasepathway enzymes in arginine catabolism by wine lactic acid bacteria.Appliedand Environment Microbiology[J]，1995，61(1)：310-316)，精氨酸在精氨酸脱亚胺酶的作用下生成瓜氨酸，瓜氨酸在鸟氨酸氨甲酰基转移酶的作用下生成鸟氨酸，瓜氨酸也能与乙醇形成EC。
现阶段，对于酒类酿造过程中氨基甲酸乙酯含量的控制主要通过一下两种途径：一是低产尿素的酵母菌株的选育。清酒发酵中为了达到降低精氨酸代谢的目的，采用了基因敲除原理构建了精氨酸酶基因缺失的清酒酵母，在清酒酿制过程中未发现尿素的积累，但细胞生长速度受到显著抑制(参考文献：Beltran G，Novo M，Rozes N，et al.Nitrogen cataboliterepression in Saccharomyces cerevisiae during wine fermentations[J].FEMSYeast Research，2004，4：625-632)，且由于生物安全性原因，基因工程菌株在食品生产中的应用越来越受到限制；二是使用酸性脲酶控制酒类成品中尿素含量，Liu等在黄酒成品酒中添加酸性脲酶以研究酸性脲酶对成品酒中尿素的降解情况(参考文献：Jun Liu，et al.Optimization production ofacid urease by nterobacter sp.in an approach to reduce urea in Chinese ricewine.Bioprocess Biosyst Eng，2012，35：651-657)，但存在酶解处理问题，工艺步骤繁琐，费时费力且存在酶活损失的问题，造成了在生产使用过程中酸性脲酶对氨基甲酸乙酯的抑制效果不稳定等难题。
氨基甲酸乙酯降解酶，能够专一降解发酵液中的EC，对EC的产生起到显著的抑制作用，但因其较难得到，应用难以推广。
酒酒球菌(Oenococcus oeni)一般用于葡萄酒酿造过程中的二次发酵，将苹果酸转化为乳酸，降低葡萄酒的酸度。
发明内容
为降解酿酒过程中产生的氨基甲酸乙酯(EC)，现有技术需要添加存在生物安全性的基因工程菌株，或者添加难以后处理的酶，针对现有技术的上述不足，本发明提供一种通过添加可产生EC降解酶的乳酸菌，来降解在酿酒过程中产生的EC的方法，该方法不引入基因改造的菌株，也无需后续处理，能有效克服目前降解EC的两种途径所存在的弊端。
一种利用酒酒球菌降解氨基甲酸乙酯的黄酒酿造方法，包括浸米、蒸饭、淋水、落缸搭锅、加曲加水、发酵和后处理，在发酵后第5～20天，向发酵液中接种酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066。
酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066，购于中国工业微生物菌株保藏管理中心。酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066可产生EC降解酶。
酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066可以产生EC降解酶，在黄酒酿造的发酵阶段，会产生EC，在发酵阶段加入酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066，可有效降解黄酒酿造过程中产生的EC。
黄酒的酿造过程包括浸米、蒸饭、淋水、落缸搭锅、加曲加水、发酵和后处理。本发明的选取的酿造原料是糯米。
浸米：将主料大米浸入水中，浸米时间根据米质，水温不同而有所差异；
蒸饭：保留附着在大米上的水进行蒸煮；
淋水：用洁净的冷水从蒸熟的米饭上淋下，使其迅速降温至适合微生物繁殖的发酵的温度，一般应为25℃～30℃；
落缸搭锅：落缸时加入酒药，使酒药粉与糯米充分拌匀后搭成凹形窝。落缸后30～40小时(优选36小时)加入麦曲和水，组成发酵液进行发酵；
发酵：包括前发酵和后发酵，前发酵温度控制在25～30℃，后发酵温度控制在15～20℃；
后处理：包括榨酒、澄清等。
作为优选，以发酵液的质量计，酒药的加入量为0.1％～0.5％；麦曲的加入量为5％～15％。
作为优选，在发酵后第8～15天，向发酵液中接种酒酒球菌(Oenococcusoeni)CICC6066；再优选，在发酵后第10天，向发酵液中接种酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066。
作为优选，以发酵液的体积计，所述酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066的接入量为1.0mL～1.5mL，所述酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066的菌液浓度为106～1011cfu/L；再优选，所述酒酒球菌(Oenococcusoeni)CICC6066的菌液浓度为108～1010cfu/L；最优选，所述酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066的菌液浓度为109cfu/L。
所述酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066的菌液制备过程为：将酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066接种到MRS培养基中，在pH6.0～6.5、温度30℃条件下发酵培养30h～40h，培养得到酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066的菌液；
所述MRS培养基组成为：蛋白胨19g/L，酵母浸膏5g/L，牛肉浸膏10g/L，柠檬酸三铵2g/L，乙酸钠2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸锰0.25g/L，硫酸镁0.58g/L，葡萄糖20g/L，吐温1mL/L，琼脂15g/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过添加能产生EC降解酶的酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066，来降解在酿酒过程中所产生的EC。酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066属于乳酸菌，它的添加不会引入基因改造菌株，也无需后续处理，能有效克服目前降解氨基甲酸乙酯的两种途径存在的弊端。
具体实施方式
为更好的理解本发明，下面结合实施例来阐释本发明。
一、产生EC降解酶菌株
酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066主要用于葡萄酒后熟，将其接种于以EC作为唯一碳源的培养基上，能在培养基上长出菌落，说明该菌株可以降解、利用EC，可产生EC降解酶。
1、酶活力测定：
(1)酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066的培养：
乳酸菌培养基(MRS)：蛋白胨19g/L，酵母浸膏5g/L，牛肉浸膏10g/L，柠檬酸三铵2g/L，乙酸钠2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸锰0.25g/L，硫酸镁0.58g/L，葡萄糖20g/L，吐温1mL/L，琼脂15g/L，pH6.2。
将酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066接种于含有50mL MRS培养基的锥形瓶中，30℃发酵培养36h。
在发酵过程中，每隔3h测一次培养液的OD600，同时取0.1mL发酵液于0.9mL无菌水中稀释10倍，按同样的方法依次稀释至106倍，测其吸光度，涂布平板测其菌落数。得到培养时间和吸光度的生长曲线以及培养时间和菌落数的曲线。选取吸光度值介于0.8～1.4的菌液，即可得到109cfu/L的酒酒球菌。
(2)酶液的制备：
将酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066接种于含有50mL MRS培养基的锥形瓶中，30℃发酵培养2d后，将发酵液离心，所得的菌体在4℃下利用超声波破碎20min，上层清液为酶液。将获得的酶液置于4℃保存。
(3)酶活测定原理：在一定条件下，该菌株的酶液与底物(3％EC，pH4.4)反应后，利用终止剂、显色剂I、显色剂II分别作用后，在一定范围内其颜色的深浅与酶的活力成正比，在625nm下进行比色，计算酶活力。
其中，显色剂I：称取15g苯酚和0.625g亚硝基铁氰化钠用超纯水定容至250mL；
显色剂II：称取13.125g NaOH和7.5mL NaClO用超纯水定容至250mL；
终止剂：称取10g三氯乙酸用超纯水定容至100mL。
酶活定义：在常压、37℃、pH4.4条件下，酶在每分钟分解底物产生1μmol氨为一个酶活单位。
酶活计算公式：酶活＝ΔOD625×n×k×10/30。
式中，ΔOD625：酶反应后样品测定与空白试验光密度值之差；
n：酶活测定液稀释倍数；
k：标准曲线斜率的倒数；
10：1mL样品液稀释至10mL的倍数；
30：酶反应的时间(min)。
(4)氨离子标准曲线的绘制：
NH4 +标准溶液制备：1mL氨水溶于底物反应液(3％EC，pH4.4)，定容至145mL，配成0.1mol/L的NH4 +溶液，并以此为母液，用相同的底物反应液(3％EC，pH4.4)配制成0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L的NH4 +标准溶液。
分别取不同梯度的NH4 +标准溶液于37℃下保温30min，加入1mL终止剂，振荡混匀。再依次加入1mL显色剂I和显色剂II，使之充分混匀，反应20min。超纯水定容至10mL，在625nm下比色测定OD值，以OD值为纵坐标，NH4 +梯度为横坐标作图，得到标准曲线。
(5)酶活的测定步骤：
在试管中分别加入1mL底物反应液(3％EC，pH4.4)，再依次加入1mL酶液，(1mL超纯水作为空白对照)。37℃反应30min后加入1mL终止剂，混匀后加入1mL的显色剂I和1mL显色剂II，震荡，继续保温15min后取出，用超纯水稀释至10mL，625nm处比色并记录OD值，计算出酶活。
表1 酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066的EC降解酶酶活情况
2、乙醇耐受度的测定：
在1mLMRS液体培养基中分别加入0mL，0.06mL，0.1mL，0.14mL，0.2mL的无水乙醇，分别配制成0％，6％，10％，14％，20％浓度的乙醇，30℃下培养2天，在600nm处比色并记录OD值。酒酒球菌(Oenococcusoeni)CICC6066的乙醇耐受度如表2所示。
表2 酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066的乙醇耐受
由表2看出，随着酒精含量的增加，酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066菌体浓度随之减少，在酒精含量小于20％时，酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066具有较好的乙醇耐受度。黄酒属于低度酿造酒，一般发酵过程中酒精含量低于14％。
二、利用酒酒球菌降解氨基甲酸乙酯的黄酒酿造方法：
1、黄酒的酿造：
本发明选取的酿造原料是糯米，酿造黄酒。
将糯米与水按1∶1.2的比例，即糯米1.25kg，洁净水1.5L，在28℃下浸米2天；待米粒松软后，保留附着在大米上的水进行蒸煮；取煮熟后的糯米淋水；待淋水后糯米的品温下降到30℃后，落缸搭锅，落缸时加入0.2％的酒药，使酒药粉与糯米充分拌匀后搭成凹形窝。
落缸36小时养窝结束后，加入10％麦曲和1.5L水进行发酵，在发酵第10天时加入菌浓为109cfu/L的酒酒球菌CICC6066。前发酵温度控制在28℃，后发酵温度控制在18℃。
2、EC浓度的测定：反相液相色谱法(HPLC)。
色谱条件：色谱柱为C18反相柱(250×4.6mm，4μm)；
          流动相为甲醇和水；
          激发波长233nm，发射波长600nm；
          柱温35℃；
          进样量20μl；
          跑样时间55min，梯度洗脱。
取1ml样品进样，在色谱检测条件下测定对应的峰面积值(A)，以峰面积值A为纵坐标，氨基甲酸乙酯浓度C为横坐标，绘制标准曲线，经统计处理求得氨基甲酸乙酯浓度与峰面积的线性回归方程为：A＝12419C-1666.9(R2＝0.9996)。
3、氨基酸含量检测：全自动氨基酸分析仪L-8900。
4、风味物质检测：气相质谱联用仪ABCZD10684。
实施例1
实验组在发酵第10天加入酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066，对照组未进行任何处理，每隔5天取样分析，测定发酵液中EC降解酶的酶活，结果见表3。
由结果可知，自然发酵的对照组中EC降解酶的酶活近乎为零，而添加了酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066的实验组有显著酶活，表明酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066确实有降解EC的能力。
表3 添加酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066对黄酒发酵中EC降解酶的酶活影响
实施例2
实验组在发酵第10天加入酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066，对照组未进行任何处理，每隔5天取样分析，测定发酵液中EC的含量，结果见表4。
由结果可知，添加酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066的实验组中EC含量低于自然发酵的对照组，且在发酵后期，即25天以后，EC水平有了显著降低，可以推测，随着发酵时间的延长，实验组中EC含量更是会明显低于对照组。
表4 添加酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066对黄酒发酵中EC含量的影响
实施例3
实验组在发酵第10天加入酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066，对照组未进行任何处理。黄酒发酵结束后，煎酒后澄清。测定黄酒中氨基酸含量，结果见表5。
由结果可知，添加酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066的实验组中总氨基酸含量低于自然发酵的对照组，除苏氨酸、缬氨酸外，其他氨基酸均低于对照组，酒酒球菌的加入使发酵液的氨基酸含量有所下降。
表5 添加酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066对黄酒发酵中氨基酸含量的影响
实施例4
实验组在发酵第10天加入酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066，对照组未进行任何处理。黄酒发酵结束后，煎酒澄清，测定黄酒中风味物质含量，结果见表6。
从表中数据可以看出，造成黄酒主要芳香物质的苯乙醇和异戊醇，实验组相对含量高于对照组，琥珀酸二乙酯较例外，实验组含量高于对照组。乙酸乙酯同样作为重要的风味物质，在实验组中未见存在。其他物质差异不明显。可见酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066的加入会对黄酒的风味物质有一定影响，但影响不大。
表6 添加酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066对黄酒发酵中氨基酸含量的影响
综上可知，在黄酒酿造过程中，酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066的添加，可以在发酵液中产生EC降解酶，降解酿造过程中产生的EC，并且不影响黄酒的风味。

Claims (7)

1.一种利用酒酒球菌降解氨基甲酸乙酯的黄酒酿造方法，包括浸米、蒸饭、淋水、落缸搭锅、加曲加水、发酵和后处理，其特征在于，在发酵后第5～20天，向发酵液中接种酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066。
2.根据权利要求1所述的黄酒酿造方法，其特征在于，在发酵后第8～15天，向发酵液中接种酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066。
3.根据权利要求1所述的黄酒酿造方法，其特征在于，以发酵液的体积计，所述酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066的接入量为1.0mL～1.5mL，所述酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066的菌液浓度为106～1011cfu/L。
4.根据权利要求3所述的黄酒酿造方法，其特征在于，所述酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066的菌液浓度为108～1010cfu/L。
5.根据权利要求3所述的黄酒酿造方法，其特征在于，所述酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066的菌液浓度为109cfu/L。
6.根据权利要求1所述的黄酒酿造方法，其特征在于，落缸时加入酒药，以发酵液的质量计，酒药的加入量为0.1％～0.5％。
7.根据权利要求1所述的黄酒酿造方法，其特征在于，落缸后30～40小时加入麦曲和水，以发酵液的质量计，麦曲的加入量为5％～15％。
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