CN114807102A

CN114807102A - 一种耐乙醇酰胺酶、基因、表达载体、工程菌及制备方法和应用

Info

Publication number: CN114807102A
Application number: CN202210528649.5A
Authority: CN
Inventors: 刘庆涛; 薛正莲; 钱森和; 赵世光; 刘艳
Original assignee: Anhui Polytechnic University
Current assignee: Anhui Polytechnic University
Priority date: 2022-05-16
Filing date: 2022-05-16
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2042-05-16
Also published as: CN114807102B

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种耐乙醇酰胺酶、基因、表达载体、工程菌及制备方法和应用，所述酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该酰胺酶能够耐受高浓度乙醇、可降解氨基甲酸乙酯，但不降解尿素。本发明所获得的酰胺酶可在含有高浓度乙醇条件下高效降解氨基甲酸乙酯且不降解尿素，有助于该酶高效的运用于酒精饮料中氨基甲酸乙酯的降解。本发明为实现酒精饮料中致癌物氨基甲酸乙酯的降解奠定了基础，具有巨大的经济及社会效益。

Description

一种耐乙醇酰胺酶、基因、表达载体、工程菌及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种耐乙醇酰胺酶、基因、表达载体、工程菌及制备方法和应用。

背景技术

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate或Urethane,简称EC)，是一种具有遗传毒性及较强致癌性的物质，广泛存在于多种传统发酵食品和酒精饮料中。鉴于EC的致癌性，尤其是乙醇可以增强EC的致癌性，世界各国和国际卫生组织对酒中的EC含量制订了严格的限量标准。人体摄取氨基甲酸乙酯主要是通过饮用酒精饮料和食物。氨基甲酸乙酯已成为影响人类健康的一个不可忽视的因素。采取有效方法消除发酵食品或酒精饮料中的氨基甲酸乙酯迫在眉睫。

目前为止，EC的消减主要有两种策略，一是间接法，即消减形成EC的前体物质(主要针对尿素)，从而减少EC的形成。此策略主要包含工艺优化法、代谢工程策略改造酒用酵母减少尿素代谢、添加酸性酶法直接降解尿素。由于尿素并非形成EC唯一前体物质，间接法不能消减其它前体物所形成的EC，并且对已经形成的EC也无法消减。第二种策略是直接法，即利用EC水解酶(Urethanase,简称UH)直接降解EC。EC水解酶可直接高效的将EC降解为无毒性的乙醇、氨和二氧化碳，是最有希望彻底解决发酵食品及酒精饮料中因EC而存在的食品安全问题的方法。目前尚无可有效应用于酒精饮料中EC直接降解的酶，主要是目前所发现的EC水解酶生化特性存在重大缺陷。其一，EC与尿素分子结构相似，目前所发现的能够降解EC的酰胺酶也可降解尿素。酒精饮料中尿素(约50mg/L)含量是EC含量(100-750μg/L)的60-500倍，它们之间存在巨大的底物竞争。其二，大部分酰胺酶类EC水解酶乙醇耐受性差，在高浓度乙醇(10％，v/v)中即失去活力，不能应用于酒精饮料中EC的降解。因此解除尿素与EC之间的底物竞争、筛选出对乙醇具有高耐受性的EC降解酶是解决酒精饮料中EC消减瓶颈问题的关键。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种耐乙醇酰胺酶、基因、表达载体、工程菌及制备方法和应用，以解决酰胺酶乙醇耐受性差及EC降解时存在的尿素与EC之间的底物竞争性问题。

基于上述目的，本发明提供了一种耐乙醇酰胺酶，所述酰胺酶的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。该酰胺酶能够耐受高浓度乙醇且不降解尿素。

所述氨基酸序列是经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸得到的，且编码具有耐乙醇、可降解氨基甲酸乙酯的蛋白质。比如在C端或N端添加或缺失一个或数个氨基酸残基、添加融合标签等，虽然在形式上进行修饰但不改变蛋白的酶活。

本发明还提供一种编码所述耐乙醇酰胺酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

可选的，表达基因的宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳酸乳球菌或酵母菌中的任意一种。优选的，表达基因的宿主菌为大肠杆菌BL21DE3。

所述酰胺酶，是通过全基因合成SEQ ID NO:1所示的基因序列，然后将酰胺酶基因在宿主菌中进行表达而得到的。

本发明还提供含所述耐乙醇酰胺酶基因的表达载体。

本发明还提供含所述耐乙醇酰胺酶基因的工程菌。

本发明还提供所述耐乙醇酰胺酶的工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)全基因合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的酰胺酶基因Leuh；

(2)将基因Leuh连接载体pRSFDuet-1得到重组质粒pRSFDuet-Leuh；

(3)将步骤(2)获得的重组质粒pRSFDuet-Leuh导入大肠杆菌BL21DE3中获得重组大肠杆菌BL21DE3/pRSFDuet-Leuh，Leuh基因在重组菌中表达受T7启动子调控；

(4)利用重组菌BL21DE3/pRSFDuet-Leuh发酵生产酰胺酶。

所述的重组质粒可以是市售的质粒、粘粒、噬菌体等经分子生物学技术手段将所述脲酶基因序列连接入而构建而成，优选pRSFDuet-1。

所述重组菌的发酵，可以是：将E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-Leuh基因工程菌培养到一定菌体浓度(如OD₆₀₀＝0.6-0.8)，添加诱导剂(如IPTG最终浓度为1mM)，培养一定时间(如10-30h)，高效表达耐乙醇、不可降解尿素的酰胺酶。

本发明还提供所述耐乙醇酰胺酶在氨基甲酸乙酯降解中的应用。

本发明还提供所述耐乙醇酰胺酶在发酵食品及酒精饮料中的应用。

本发明的有益效果：本发明所获得的酰胺酶可在含有高浓度乙醇条件下高效降解氨基甲酸乙酯且不降解尿素，有助于该酶高效的运用于酒精饮料中氨基甲酸乙酯的降解。该酶在大肠杆菌中进行表达，以EC为底物时，重组细胞破碎后粗酶液的比酶活力为6.0U/mg，经Ni-NTA亲和层析纯化后，以EC为底物时比酶活力为23.7U/mg，对尿素无降解活力。同时此氨基甲酸乙酯水解具有高的乙醇耐受性，在含有10％的乙醇(v/v)条件下，4℃保温2h后依然可以保持60％以上的活性。本发明制备的重组酶为实现传统发酵食品及酒精饮料中EC的消减及EC水解酶工业化生产奠定了基础，具有巨大的经济及社会效益。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明表达质粒pRSFDuet-Leuh的构建示意图；

图2为本发明重组菌E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-Leuh表达产物的SDS-PAGE蛋白电泳图；其中1为重组菌诱导后全细胞，2为重组菌诱导后细胞破碎上清液，3为经Ni-NTA亲和层析纯化后的蛋白样品；

图3为本发明LeUH与氨基甲酸乙酯经分子对接后的复合结构图；其中LeUH的3D结构为同源建模所得；

图4为本发明基因工程菌株表达的重组酰胺酶LeUH的底物特异性对比图；

图5为本发明基因工程菌株表达的重组酰胺酶LeUH的乙醇耐受性曲线图；(A)LeUH在不同乙醇浓度存在条件下的相对酶活力，(B)LeUH在不同浓度乙醇中的稳定性。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。

需要说明的是，除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本发明中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。

本发明中，采用的LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L(固定培养基另加1.5％的琼脂粉)。

TB培养基：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4ml。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100ml灭菌的0.17mmol/LKH₂PO₄，0.72mmol/LK₂HPO₄的溶液。

下面的商品化质粒和大肠杆菌用于基因克隆和表达：

pRSFDuet-1(Novagen，美国)

E.coli BL21(DE3)(Novagen，美国)

酶活力测定方法：取两支10mL比色管，分别加入1mL酶液和1mL灭活的酶液。然后在两管中分别加入1mL 3％底物溶液(如EC或尿素等)，其中底物用20mM pH 7.4的磷酸盐缓冲液配制，在37℃恒温水浴箱中反应30min后，在两管各加入1mL终止剂(10％三氯乙酸)，混匀后加入1mL的显色剂I(15g苯酚和0.625g亚硝基铁氰化钠用超纯水定容至250mL)和1mL显色剂II(13.125g NaOH和7.5mLNaClO用超纯水定容至250mL)，强烈震荡，继续在37℃恒温水浴箱中保温20min后取出，用超纯水稀释到10mL，625nm处比色，测定OD值，计算酶活(采用氯化铵绘制标准曲线)。

酶活力单位定义：在常压，20mM pH 7.4的磷酸盐缓冲液及37℃条件下，每分钟降解底物(EC或尿素等)生成1μmol NH₄ ⁺所需要的酶量为一个酶活力单位。

实施例1

酰胺酶重组表达菌株构建

按照发明专利ZL2015102185971中所述重组大肠杆菌构建方法，构建EC降解酶重组表达菌株。与发明专利ZL2015102185971不同的是，本发明所用的EC降解酶基因序列为全基因合成所得。具体构建过程如下：以NCBI中来自于长孢洛德酵母Lodderomyceselongisporus NRRL YB-4239的未知功能蛋白(本发明中命名为LeUH)氨基酸序列(GeneBank Accession number:XP_001524600.1)为依据，对该未知功能蛋白编码基因(本发明中命名为Leuh)序列以大肠杆菌表达系统的基础进行密码子优化，密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO.1所示；在金唯智公司全基因合成SEQ ID NO.1所示的Leuh基因序列；全基因合成的Leuh基因，经BamH I和Xho I双酶切，切胶回收后，与经BamH I和Xho I双酶切的pRSFDuet-1质粒连接，转入E.coli BL21DE3感受态细胞，涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体平板上，37℃培养12h，用如SEQ ID NO.3所示的正向引物F(5'-ATG CTG ACC GATAAC TGG AAA GAT C-3')及如SEQ ID NO.4所示的反向引物R(5'-TCA GCC GCG CAG AATCTG CGC AAT TTC C-3')，PCR鉴定阳性克隆(扩增条件为：95℃ 5min 1个循环，95℃ 30s，54℃10s，72℃ 2min，25个循环，72℃ 10min一个循环)。将菌落PCR鉴定正确的阳性克隆接入含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒，进行质粒双酶切验证。经BamHI和Xho I双酶切验证正确的质粒送往上海生工生物公司测序。由此得到重组LeUH的异源表达重组菌BL21(DE3)/pRSFDuet-Leuh。

酰胺酶LeUH的重组异源表达

挑取基因工程菌BL21(DE3)/pRSFDuet-Leuh单菌落，接种于25mL、含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。第二天按1％接种量转接至含有50μg/mL卡那霉素的TB培养基中，培养至菌浓OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L诱导，30℃培养10h，离心收集菌体，用20mM pH4.5柠檬酸-柠檬酸缓冲液重悬细胞，通过超声破壁、离心取上清，测定上清液中的蛋白含量及EC水解酶活力,并通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况(图2)，经检测重组细胞破碎后以EC为底物时的粗酶液的比酶活力为6.0U/mg。

分别通过I-TASSER(https://zhanggroup.org/I-TASSER/)及BSP-SLIM(https:// zhanggroup.org/BSP-SLIM/)在线网站对LeUH进行同源建模及与EC分子的分子对接，获得了LeUH与EC分子的复合物结构(图3)，由此说明，EC分子可很好的结和到该酶的催化活性口袋中，从而被该酶所降解，这也与实验结果中该酶可以降解EC相符合。

酰胺酶LeUH的亲和层析纯化

重组酶蛋白的N端在设计时添加了6×his-tag标签蛋白，因此可以使用HisTrap^TMFF 5ml镍柱进行蛋白纯化。平衡缓冲液A液：20mM磷酸盐，500mM NaCl，20mM咪唑，pH 7.4，洗脱缓冲液B液：20mM磷酸盐，500mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4。流速5mL/min，采用梯度洗脱(8％B、20％B、60％B、100％B)的方法洗脱蛋白，目的蛋白在60％B的梯度下洗脱下来。洗脱液经透析脱盐后进行SDS-PAGE检测及比酶活力检测。由图2可知，该蛋白LeUH获得了较好的纯化效果，经检测得知该纯化的酶以EC为底物时的比酶活力为23.7U/mg。

酰胺酶LeUH的底物特异性

将上述所获得的经亲和层析纯化后的LeUH酶液，分别与质量分数为3％的氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、氨基甲酸丁酯、乙酰胺、丙烯酰胺、及尿素混合，按照材料与方法中所述的酶活力测定方法，测定相应酶活，以酶对氨基甲酸乙酯的酶活为100％，换算得到酶对其他底物的相对酶活力，结果如图4所示：相对于以氨基甲酸乙酯、氨基甲酸甲酯为底物，该酶对酰胺类的化合物具有更强的降解能力，这也符合酰胺酶家族酶类的底物降解特性；同时该结果也显示，该酶LeUH对尿素无降解能力。文献报导，大多数对EC降解能力的酰胺酶对尿素也具有降解能力，由于酒精饮料中尿素(约50mg/L)含量是EC含量(100-750μg/L)的60-500倍，它们之间存在巨大的底物竞争，致使目前所发现的EC降解酶不能用于酒精饮料中EC的直接降解。本发明所发现的EC水解酶LeUH可有效解决这一难题，具有巨大潜在应用价值。

酰胺酶LeUH的乙醇耐受性

测定乙醇存在条件下对酶活力的影响：以不含乙醇条件下所测定的酶活力为100％，按照材料与方法中所述的酶活力测定方法，测定所获得的纯化后的LeUH酶液在含有不同乙醇浓度(5％，10％，15％，20％及25％(v/v))条件下的酶活。结果如图5A所示，该酶在含有10％乙醇条件下，相对于不含乙醇条件下，依然具有40％以上的酶活力。

测定酶在乙醇中的稳定性时：以未经乙醇处理的酶，所测得的酶活力为100％。将所获得的纯酶液LeUH添加到不同浓度的乙醇中(5％，10％，15％，20％及25％(v/v))，4℃放置2h后，按照材料与方法中所述酰胺酶的酶活测定方法，分别检测样品的EC水解酶活力。测定结果如图5B所示，该酶经10％(v/v)乙醇，4℃放置2h后依然可以保持60％及以上的酶活力。

以上结果表明：该酶LeUH具有良好的乙醇耐受性，具有应用于酒精饮料中EC降解的潜力。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 安徽工程大学

<120> 一种耐乙醇酰胺酶、基因、表达载体、工程菌及制备方法和应用

<141> 2022-05-16

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1656

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgctgaccg ataactggaa agatctggcg ggcaaagcgc agagcacctt tcagaacagc 60

ctgaaacaag cgattgatct ggcggatttt gatgatgaac tggcgaaaaa atatcgcatt 120

ctgccgagcg cgattggcac caactgcgaa gattttggca gcccggcgga atatccgctg 180

gaagaatatc tgaaaaccct gccgcagaaa gtgctggata ttaccgaaaa agatccggtg 240

gaactgctga aagatctgaa atgcaaaaaa gtgacctgcg tggaagtgct gaaagcgtat 300

accgcggcga gcattgtggc gagcaaactg accaactgcg tgcaagaatt tctgccggtg 360

gaagcgctgc agtatgcgca gcagctggat gcgaactatg aaagcaaaaa acatctgccg 420

ctgtatggcc tgccgtttag cattaaagaa atgattccgt ttgtgggccg cagcgtgacc 480

catggcagcc tgtgctatct ggatcgcgtg gtggattata acgcggatat tgtgaacatt 540

ctgattgcga acggcgcgta tccgtttgtg cgcaccacca acccgcagag cctgatgatg 600

ctggaatgcg tgagctttgc gcatggccgc accgtgaaca gccacaatgg caatttaacg 660

agcggcggca gcagcggggg ggagggcgca ctaaacggtc tgcgtgcgtc gccgtttggc 720

ctgggcagcg atattggcgg cagcattcgc tgcccggcgg cgtttaacgg catttatggc 780

ctgcgcacca ccctgggccg cattccgacc gcggattatt ttagctgcaa catgggcagc 840

gaaagcattc tgagcgtgac cggcccgctg agccgcagcc tggataccgt gaacctggtg 900

atgaaaaccg tgattgaagc gaaaccgtgg ctgattgatc cgaccctggt gccgctgagc 960

tggaaaaaac cgtatcagcg caaatatcgc gtgggcattt attggagcga taaaattgtg 1020

aacccgagcc cgccgattaa acgcgcgctg accgtggtga gcaaaaaact gaacagcctg 1080

ggcaactttg aagtggtgcc gtttgaaccg tataaaccgg aaaaagtggc tcagattctg 1140

ggcaaactgt attttgaaga tggcgcgcgc gattttcgca gcaccctgca gaccggcgaa 1200

ccgctgctgg aacagacccg ctgggcgatt gaaggcgcgg aagatctgga tatgcatgaa 1260

cagtggtatt ggaacctgga aaaacaagcg tatcgcaaaa aatttctgaa acattggtgc 1320

ggctataccg atgcggatgg caacgtgctg gatgcggtga ttgcgccggt gtttccgaac 1380

gtggcggcga aacatgaaac caccaaatat tggacctata cgagtcagtg gaacctgctg 1440

gattatccgg tgctggcgtt tccggtgacc aacgtggatg aaagcctgga tcagccgtat 1500

accgattata ccccgctgaa cgatctggat aaatattttt ataaacagta tgatagcccg 1560

agcagcttta gcaaagcgcc ggcgaacctg tgcctggtgg gcctgcgctt taccgatgaa 1620

aaactggtgg aaattgcgca gattctgcgc ggctga 1656

<210> 2

<211> 566

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Arg Thr Glu Asp Trp Lys Ile Leu Ala Ala Glu Ala Gln Glu Thr

1 5 10 15

Phe Asn Asp Ser Leu Thr Lys Ala Ile Lys Leu Ala Glu Phe Asp Asp

20 25 30

Ser Leu Lys Ser Lys Tyr Asp Ala Leu Pro Ser Ala Lys Gly Glu Thr

35 40 45

Thr Asp Asp Tyr Gly Ser Pro Thr Lys His Pro Val Asp Val Tyr Leu

50 55 60

Lys Thr Val Pro Gln Leu Val Leu Asp Ile Thr Glu Lys Asp Pro Ile

65 70 75 80

Asp Leu Leu Lys Asp Leu Lys Asp Lys Lys Ile Thr Cys Val Asp Val

85 90 95

Leu Lys Ala Tyr Thr Thr Ala Ala Ile Ile Ala Asn Lys Leu Thr Asn

100 105 110

Cys Val Gln Glu Phe Leu Pro Ile Glu Ala Leu Lys Phe Ala Gln Glu

115 120 125

Leu Asp Glu Lys Tyr Glu Glu Lys Lys Asn Leu Pro Leu Tyr Gly Leu

130 135 140

Pro Phe Ser Ile Lys Glu Met Ile Pro Phe Val Gly Arg Ser Val Thr

145 150 155 160

His Gly Ser Leu Cys Tyr Leu Asp Arg Val Val Asp Tyr Asn Ala Asp

165 170 175

Ile Val Asn Ile Leu Met Asp Asn Gly Ala Tyr Pro Phe Val Arg Thr

180 185 190

Thr Asn Pro Gln Ser Leu Met Met Leu Glu Cys Val Ser Tyr Met His

195 200 205

Gly Arg Thr Val Asn Thr Phe Asn Ser Asp Leu Thr Ser Gly Gly Ser

210 215 220

Ser Gly Gly Glu Gly Val Leu Asn Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Phe Gly

225 230 235 240

Leu Gly Ser Asp Ile Gly Gly Ser Ile Arg Ser Pro Ala Ala Phe Asn

245 250 255

Gly Ile Tyr Gly Leu Arg Thr Thr Leu Gly Arg Ile Pro Thr Ala Asp

260 265 270

Tyr Phe Ser Cys Asn Ile Gly Ser Glu Ser Ile Leu Ser Val Thr Gly

275 280 285

Pro Leu Ser Arg Ser Leu Gly Thr Val Glu Leu Val Met Lys Ser Ile

290 295 300

Ile Asp Ser Lys Pro Trp Leu Val Asp Pro Thr Leu Ala Ala Ile Glu

305 310 315 320

Trp Lys Thr Phe Asp Ser Gln Gln Glu Lys Pro Lys Phe Arg Ile Gly

325 330 335

Val Leu Met Ser Asp Gly Ile Val Thr Pro Ser Pro Pro Ile Leu Arg

340 345 350

Ala Leu Asn Ile Val Lys Glu Lys Leu Ala Ser Leu Gly Asn Ile Glu

355 360 365

Leu Val Pro Phe Glu Pro Phe Glu His Glu Arg Thr Ala Glu Ile Leu

370 375 380

Gly Lys Leu Tyr Phe Glu Asp Gly Ala Arg Asp Phe Lys Ala Thr Val

385 390 395 400

Ala Asp Thr Lys Glu Pro Ile Leu Glu Gln Thr Thr Trp Ala Ile Asp

405 410 415

Gly Ala Lys Asp Leu Glu Met His Asp Gln Trp Phe Trp Asn Leu Glu

420 425 430

Lys Gln Lys Tyr Arg Lys Gln Tyr Leu Lys His Trp Met Ser Tyr Thr

435 440 445

Asp Lys Gln Gly His Val Leu Asp Ala Val Ile Ala Pro Val Phe Pro

450 455 460

Asn Val Ala Pro Lys His Asn Thr Ser Lys Tyr Trp Gly Tyr Thr Cys

465 470 475 480

Gln Trp Asn Leu Leu Asp Tyr Pro Val Leu Val Phe Pro Val Thr Ile

485 490 495

Val Asp Glu Asn Leu Asp Val Pro Phe Lys Asp Tyr Lys Pro Lys Asn

500 505 510

Glu Ser Asp Glu Phe Phe Tyr Lys Gln Tyr Asp Ser Pro Lys Ser Phe

515 520 525

Ala Lys Ala Pro Val Asn Leu Gly Leu Val Gly Leu Arg Asn Thr Asp

530 535 540

Glu Lys Leu Ile Glu Ile Ala Lys Ile Leu Arg Gln Glu Ile Gly Asp

545 550 555 560

Ile Phe Ala Gly Gln Gln

565

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgctgaccg ataactggaa agatc 25

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcagccgcgc agaatctgcg caatttcc 28

Claims

1.一种耐乙醇酰胺酶，其特征在于，所述酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述耐乙醇酰胺酶，其特征在于，所述氨基酸序列是经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸得到的，且编码具有耐乙醇、可降解氨基甲酸乙酯的蛋白质。

3.一种编码权利要求1所述耐乙醇酰胺酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，表达基因的宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳酸乳球菌或酵母菌中的任意一种。

5.一种含权利要求3或4所述基因的表达载体。

6.一种含权利要求3或4所述基因的工程菌。

7.根据权利要求1所述耐乙醇酰胺酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)全基因合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的酰胺酶基因Leuh；

(2)将基因Leuh连接载体pRSFDuet-1得到重组质粒pRSFDuet-Leuh；

(4)利用重组菌BL21DE3/pRSFDuet-Leuh发酵生产酰胺酶。

8.根据权利要求1所述耐乙醇酰胺酶在氨基甲酸乙酯降解中的应用。

9.根据权利要求1所述耐乙醇酰胺酶在传统发酵食品及酒精饮料中的应用。