CN116355881A - 酸耐受性提高的β-木糖苷酶突变体D395G及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酸耐受性提高的β‑木糖苷酶突变体D395G及其应用，涉及基因工程技术领域。该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该突变体D395G的最适pH为4.5，最适温度为50℃，与氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的重组野生β‑木糖苷酶JB13GH39P28相比，该突变体在酸性条件下的稳定性提高，其在pH＝3.0‑6.0下处理60min仍能具备95％以上的活性，有利于在较低pH值要求下的生物技术领域中的应用。本发明提供的β‑木糖苷酶突变体D395G在食品、酿酒、果汁澄清、饲料等行业中具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种酸耐受性提高的β-木糖苷酶突变体D395G及其应用。
背景技术
木聚糖是半纤维素的主要成分，是自然界中储量第二大的自然多糖。木聚糖的完全降解需要一系列酶协同作用，其中，在β-1,4-内切木聚糖酶水解木聚糖主链后，β-木糖苷酶通过水解低聚木糖的末端释放木糖残基，不仅在木聚糖的彻底降解过程中起着重要作用，而且可以缓解木寡糖对木聚糖酶和纤维素酶的抑制作用，因此，β-木糖苷酶在诸多领域都有较为广泛的应用。例如，食品工业中，β-木糖苷酶和内切木聚糖酶协同作用水解木聚糖后可产生大量木糖，木糖是生产木糖醇的原料，此外，作为无热量甜味剂，木糖可作为糖尿病人的食糖替代品；在酿造工业中，β-木糖苷酶可以降低葡萄汁的粘稠度和浑浊度，提高过滤的澄清度，提升酒的稳定性；此外，酵母工程中可以利用木糖发酵产生生物乙醇、乳酸和其它化学品(NaiduDSetal.Carbohydratepolymers,2018,179:28-41)。
然而，大多数工业过程的实现都伴随着极端pH，如生产乳制品、食用酸、细菌素的过程中，常伴有乳酸、醋酸、丙酮酸等酸性代谢产物的形成，这些酸性物质的积累降低了发酵环境的pH。发酵环境的酸化，严重限制了中性酶的活性。耐酸的酶能在酸性条件下保持相对较高的酶活性，在较低的pH值下能够稳定的发挥作用，例如，β-木糖苷酶一般用作浸渍酶，主要用于萃取和澄清果汁，提高果汁品质，但是，果汁的pH值通常较低，介于2.0至4.5之间，耐酸的β-木糖苷酶才能在这样低pH值的环境中发挥作用。而现有的β-木糖苷酶在酸性条件下的耐受性较差，活性较低，极大的限制了其在酸性较低环境中的应用。此外，耐酸的β-木糖苷酶还可用于饲料、工业废料处理等多个领域，能有效减少加工工艺中化学试剂的消耗，降低副产物的形成，减少环境污染，具有重大经济社会效益(YeginS.Foodchemistry,2017,221:67-75.)。
发明内容
本发明的目的是提供一种酸耐受性提高的β-木糖苷酶突变体D395G及其应用，该突变体D395G的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，与氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的重组野生酶JB13GH39P28相比，该突变体在酸性条件下的稳定性提高，其在pH为3.0-6.0条件下处理60min仍能保持95％以上的活性，在较低pH值要求下的生物技术领域中具有潜在的应用价值。
为了达到上述目的，本发明提供了一种酸耐受性提高的β-木糖苷酶突变体D395G，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该突变体D395G在pH＝3.0下处理60min后仍具有95.57％的酶活。
本发明还提供了β-木糖苷酶突变体D395G的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种包含上述编码基因的重组质粒。
优选地，上述重组质粒选自pET-28a(+)。
本发明还提供了一种包含上述编码基因的重组菌。
优选地，上述重组菌选自大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明提供的β-木糖苷酶突变体D395G可被用于有较低pH值要求的行业中，包括食品行业和饲料行业。
优选地，本发明提供的突变体D395G可被用于酿酒或果汁澄清，还可用于饲料的生产等。
本发明的一种酸耐受性提高的β-木糖苷酶突变体D395G，解决了野生型β-木糖苷酶酸耐受性差，应用范围较窄等问题，具有以下优点：
与重组野生酶JB13GH39P28相比，突变体D395G的最适温度和最适pH不变，在酸性条件下的稳定性显著提高。重组野生酶JB13GH39P28的最适温度为50℃，在10℃、20℃、30℃、40℃、60℃和70℃时分别具有10.67％、23.94％、43.61％、69.58％、77.97％和19.49％的酶活；突变体D395G的最适温度也为50℃，在10℃、20℃、30℃、40℃、60℃和70℃时分别具有10.18％、22.98％、47.89％、67.64％、15.93％和23.46％的酶活。重组野生酶JB13GH39P28和突变体D395G的最适pH为4.5。在pH＝3.0下处理60min，重组野生酶JB13GH39P28只有3％的酶活，而突变体D395G仍保持95.57％的酶活；在pH＝4.0-6.0下处理60min，重组野生酶JB13GH39P28的酶活提高到97.79％，而突变体D395G一直保持98％以上的酶活。本发明的耐酸的β-木糖苷酶突变体D395G可应用于食品、酿酒、果汁澄清、饲料等行业。
附图说明
图1为本发明中重组野生酶JB13GH39P28和突变体D395G的SDS-PAGE分析结果。
图2为本发明中重组野生酶JB13GH39P28和突变体D395G的pH活性对比结果。
图3为本发明中重组野生酶JB13GH39P28和突变体D395G在不同pH中稳定性对比结果。
图4位本发明中重组野生酶JB13GH39P28和突变体D395G的热活性对比结果。
图5本发明中重组野生酶JB13GH39P28和突变体D395G在50℃的热稳定性对比结果。
图6位本发明中重组野生酶JB13GH39P28和突变体D395G在60℃的热稳定性对比结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中所用到的部分实验材料和试剂：
1)菌株及载体：大肠杆菌EscherchiacoliBL21(DE3)购于北京博迈德基因技术有限公司；pET-28a(+)表达载体来源于江苏苏州泓迅生物科技有限公司。
2)酶类及其它生化试剂：pNPX购自Sigma公司；Nickel-NTA蛋白纯化树脂购自QIAGEN公司；QuickMutationTM基因定点突变试剂盒购自碧云天生物技术公司；Dpn1消化酶购自Takara生物技术公司；其他都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3)培养基：LB培养基：Peptone10g，Yeastextract5g。NaCll0g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实验例1重组野生β-木糖苷酶JB13GH39P28表达载体的构建和转化
1)从GenBank中下载氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的β-木糖苷酶JB13GH39(编号为AZC12019.1)及其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的编码基因jb13gh39(编号为MG838204.1)，去除jb13gh39编码信号肽的序列(第1-57位核苷酸)后，委托苏州泓迅生物科技股份有限公司对jb13gh39编码成熟肽的序列(第58-1614位核苷酸)进行密码子优化，结果序列的GC含量由60％降低至48％，将密码子优化后所获得的目的片段命名为jb13gh39p28，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其长度为1557bp，也可以通过基因合成得到jb13gh39p28。
2)通过PCR的方式在jb13gh39p28的5’和3’端分别引入限制性酶切位点NcoⅠ(5’CCATGG3’)和XhoⅠ(5’CTCGAG3’)，得到序列nxjb13gh39p28，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，通过限制性酶酶切上述产物和表达载体pET-28a(+)，将nxjb13gh39p28和pET-28a(+)的酶切产物通过连接酶连接，获得包含nxjb13gh39p28的重组质粒nxjb13gh39p28-pET-28a(+)。
3)以nxjb13gh39p28-pET-28a(+)为模板，设计2条突变引物(F1和R1)，具体序列如下所示。通过PCR去除重组时在C端组氨酸标签前引入的1个亮氨酸和1个谷氨酸序列，PCR反应参数为：95℃变性30sec；然后95℃变性15sec，70℃退火15sec，72℃延伸3min30sec，30个循环；72℃保温5min。最终获得包含jb13gh39p28的重组质粒jb13gh39p28-pET-28a(+)，重组后的jb13gh39p28形成的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码重组野生酶JB13GH39P28的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
突变引物序列如下(5’→3’):
F1(SEQ ID NO.9)：
GAACGTAAACACCACCACCACCACCACTGAGAT
R1(SEQ ID NO.10)：
GTGGTGGTGTTTACGTTCTTTCGGTGCAATACT
4)将重组质粒jb13gh39p28-pET-28a(+)通过热激方式转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得包含jb13gh39p28的重组菌株BL21(DE3)/jb13gh39p28。
实验例2突变体D395G表达载体的构建和转化
1)将实验例1中所得包含重组质粒jb13gh39p28-pET-28a(+)的重组菌株以0.1％含量接种于LB培养基中(含50μg/mL卡那霉素)，37℃下过夜培养，通过试剂盒提取质粒。
2)以重组质粒jb13gh39p28-pET-28a(+)为模板，设计2条突变引物(F2和R2)，具体序列如下所示。利用QuickMutationTM基因定点突变试剂盒进行突变，PCR反应参数为：95℃变性30sec；然后95℃变性15sec，70℃退火15sec，72℃延伸3min30sec，30个循环；72℃保温5min。PCR扩增得到包含核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码基因d395g的线性化重组质粒d395g-pET-28a(+)，该编码基因编码的突变体D395G，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。d395g和d395g-pET-28a(+)也可以通过基因合成得到。
突变引物序列如下(5’→3’):
F2(SEQ ID NO.11)：
TGTGGGGTGGCAACAACCGAAACAACCGGTT
R2(SEQ ID NO.12)：
TTGTTGCCAACCCCACAGCAGAACTTCGGTACTAGA
3)对PCR产物进行Dpn1酶消化，于37℃消化3h。
4)将消化产物通过热激方式转入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到包含D395G编码基因d395g的重组菌株BL21(DE3)/d395g。
实验例3重组野生β-木糖苷酶JB13GH39P28和突变体D395G的制备
1)将实验例2中所得的重组菌株BL21(DE3)/jb13gh39p28和BL21(DE3)/d395g以0.1％的接种量分别接种于LB(含50μg/mL卡那霉素)培养液中，37℃、180rpm/min摇床中振荡16h进行活化。
2)将1)中活化的菌液以1％接种量分别接种到新鲜的LB(含50μg/mL卡那霉素)培养液中，于37℃、180rpm/min摇床中振荡培养约2-3h(OD600达到0.6-1.0)后，加入终浓度0.7mM的IPTG进行诱导，于20℃、160rpm/min摇床中继续振荡培养约20h诱导重组蛋白产生。
3)于4℃、6000rpm/min离心8min，收集菌体。用适量的pH＝7.0McIlvaine buffer悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经12000rpm/min离心l0min后，吸取上清并用Nickel-NTAAgarose和0-500mM的咪唑分别亲和和纯化目的蛋白。两个纯化所得的蛋白SDS-PAGE结果如图1所示，其中M为蛋白质Marker，W为野生酶，D395G为突变体。结果表明，重组野生酶JB13GH39P28和突变体D395G得到了表达和纯化，产物为单一条带。
4)把样品体积量100倍的透析液(pH＝7.0McIlvainebuffer)加入透析装置。将透析袋(mw:14000)剪成适当长度(10-20cm)的小段，在沸水中煮沸30min后，用蒸馏水彻底清洗透析袋，将3)中得到的纯化的重组野生酶JB13GH39P28和突变体D395G分别装入透析袋，透析袋两端预留3-5cm的长度用透析夹夹住。将透析样品放在透析缓冲液中，置于4℃透析，每隔2小时更换透析液，更换3次。
实验例4重组野生β-木糖苷酶JB13GH39P28及突变体D395G的性质测定
1)重组野生酶JB13GH39P28和突变体D395G的活性分析
活性测定方法采用PNP法，以对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(pNPX)为底物测定纯化的重组野生酶JB13GH39P28及突变体D395G的活性。将pNPX溶于缓冲液中，使其终浓度为2mM；反应体系含50μL酶液，450μL的含底物的缓冲液；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后加2mL1MNa2CO3终止反应，冷却至室温后在405nm波长下测定释放出的pNP的量；1个酶活单位(U)定义为每分钟分解底物产生1μmolpNP所需的酶量。
2)重组野生酶JB13GH39P28及突变体D395G在不同pH中的活性测定
将实验例3中纯化的酶置于pH＝3.0-8.0(3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0)McIlvainebuffer中，于37℃的条件下进行酶促反应，测定纯化的重组野生酶JB13GH39P28及突变体D395G的酶活。
重组野生酶JB13GH39P28和突变体D395G的pH活性对比结果如图2所示，结果表明，纯化的重组野生酶JB13GH39P28及突变体D395G的最适pH为4.5。
3)重组野生酶JB13GH39P28及突变体D395G在不同pH中的稳定性测定
将实验例3中纯化的酶置于pH＝3.0-10.0缓冲液中(pH＝3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0：McIlvainebuffer，pH＝9.0、10.0：1mol/LGlycine-NaOHBuffer)，在37℃下处理60min。按照酶活力测定方法，在pH＝4.5及37℃条件下进行酶促反应，以pNPX为底物，反应10min，测定纯化的重组野生酶JB13GH39P28及突变体D395G的酶活。
重组野生酶JB13GH39P28和突变体D395G在不同pH中稳定性对比结果如图3所示，结果表明，与重组野生酶JB13GH39P28相比，突变体D395G在酸性条件下的稳定性提高，在pH＝3.0下处理60min，野生酶JB13GH39P28有3％的酶活，而突变体D395G保持有95.57％的酶活；在pH＝4.0-6.0下处理60min，野生酶JB13GH39P28的酶活提高到97.79％，而突变体D395G一直保持98％以上的酶活。
4)重组野生酶JB13GH39P28及突变体D395G的热活性测定
在pH＝4.5的缓冲液中，于0-70℃下进行酶促反应。以pNPX为底物，反应10min，测定纯化的重组野生酶JB13GH39P28及突变体D395G的酶学性质。
重组野生酶JB13GH39P28和突变体D395G的热活性对比结果如图4所示，结果表明，纯化的重组野生酶JB13GH39P28和突变体D395G的最适温度为50℃。野生酶JB13GH39P28在10℃、20℃、30℃、40℃、60℃和70℃时分别具有10.66％、23.94％、43.61％、69.58％、77.97％和19.49％的酶活；突变体D395G在10℃、20℃、30℃、40℃、60℃和70℃时分别具有17.67％、34.91％、62.69％、94.92％、63.36％和23.46％的酶活。
5)重组野生酶JB13GH39P28及突变体D395G的热稳定性测定
将同样酶量的酶液置于50℃、60℃处理60min，每10min测一次酶活，在pH＝4.5及37℃条件下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPX为底物，反应l0min，测定纯化的重组野生酶JB13GH39P28和突变体D395G的酶活。
重组野生酶JB13GH39P28和突变体D395G在50℃的热稳定性对比结果如图5所示，其在60℃的热稳定性对比结果如图6所示，结果表明，50℃处理60min后，野生酶JB13GH39P28的酶活下降至83.17％，而突变体D395G的酶活下降至62.89％；野生酶JB13GH39P28在60℃时的半衰期约为10min，而突变体D395G在60℃下处理10min酶活下降至33.46％，野生酶JB13GH39P28和突变体D395G在60℃下处理60min几乎没有酶活。
综上可知，本发明提供的β-木糖苷酶突变体D395G与重组野生酶JB13GH39P28相比，该突变体在酸性条件下的稳定性提高，其在pH为3.0-6.0条件下处理60min仍能保持95％以上的活性，有利于较低pH值要求下的生物技术领域中的应用。本发明提供的β-木糖苷酶突变体D395G在食品行业和饲料行业等需要较低pH值的行业中具有潜在的应用价值，包括酿酒、果汁澄清等，还可用于饲料的生产等。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (9)
1.一种酸耐受性提高的β-木糖苷酶突变体D395G，其特征在于，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该突变体D395G在pH＝3.0下处理60min后仍具有95.57％的酶活。
2.如权利要求1所述酸耐受性提高的β-木糖苷酶突变体D395G的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.包含如权利要求2所述编码基因的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述的质粒选自pET-28a(+)。
5.包含如权利要求2所述编码基因的重组菌。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述的菌选自BL21(DE3)。
7.如权利要求1所述酸耐受性提高的β-木糖苷酶突变体D395G在食品行业中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的食品行业包括酿酒或果汁澄清。
9.如权利要求1所述酸耐受性提高的β-木糖苷酶突变体D395G在饲料行业中的应用。
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