CN116376875B - 耐热性提高的n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐热性提高的N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体及其应用，涉及基因工程技术领域。该酶突变体为MutNΔ120，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该突变体MutNΔ120的最适温度为45℃，其在10℃、20℃和30℃时分别具有25％、58％、67％的酶活力；37℃处理60min后，仍能保持78％的酶活力，与氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的野生酶相比，37℃处理60min的酶活力提高了42％。本发明提供的N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体可应用于功能性食品生产或海产品加工等行业。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种耐热性提高的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体及其应用。
背景技术
氨基葡萄糖苷及其衍生物应用于保健品和医药等大健康领域，具有重要经济价值。氨基葡萄糖苷及其衍生物食用安全性已得到广泛认可，可预防和治疗骨关节炎等慢性炎症，还具有抗炎症、抗氧化、抗衰老、抗纤维化、神经保护和心脏保护等多种作用；它也是医药中有效成分辅助剂，还是生产唾液酸的前体(Ma et al.Appl Microbiol Biot,2019,103(19):7883–7889)。β-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶(GlcNAcases，β-N-acetyl-D-glucosaminidases，EC 3.2.1.52)可协同几丁质酶降解富含几丁质的环境废弃物(如虾壳或真菌菌丝体等)，从几丁寡糖非还原末端逐个切割生产功能性乙酰氨基葡萄糖苷。
JB10NagA是一种低温耐盐耐产物抑制的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。该酶的最适温度为50℃，而37℃下处理60min酶活力仅剩余36％。该酶低温活性偏低，热稳定性较差，极大的限制其应用推广。因此，利用蛋白质工程提高野生酶JB10NagA的耐热性和降低其在低温下活性，有利于其在功能性食品生产或海产品加工等行业的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐热性提高的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体及其应用，为解决野生的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶低温活性偏低，热稳定性较差等问题，与氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的野生酶相比，该突变体的耐热性显著提高，可应用于功能性食品生产或海产品加工等行业。
为了达到上述目的，本发明提供了一种耐热性提高的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体，该突变体为MutNΔ120，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该突变体在37℃处理60min后，仍保持78％的酶活。
本发明还提供了上述耐热性提高的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种包含上述编码基因的重组表达载体。
优选地，上述的重组表达载体选自pET-22b(+)。
本发明还提供了一种包含上述编码基因的重组表达菌。
优选地，上述的重组表达菌选自BL21(DE3)。
本发明提供的耐热性提高的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体可应用于食品行业中，尤其可用于功能性食品生产或海产品加工。
本发明提供的耐热性提高的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体，解决了野生型N-乙酰氨基葡萄糖苷酶热稳定性差的问题，与野生酶JB10NagA-opt相比，突变体MutNΔ120的低温热活性和37℃耐热性得到了提高。野生酶JB10NagA-opt的最适温度为50℃，37℃处理60min剩余酶活力为36％；而突变体MutNΔ120的最适温度为45℃，37℃处理60min剩余酶活力为78％；与野生酶相比，突变体MutNΔ120最适温度降低了5℃，37℃处理60min的酶活力提高了42％。本发明的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体有利于在功能性食品生产或海产品加工等行业推广应用。
附图说明
图1为本发明提供的野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ120的SDS-PAGE分析结果。
图2为本发明提供的野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ120的热活性测定结果。
图3为本发明提供的野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ120的热稳定性测定结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
多数蛋白质的一条多肽链通常包含多个结构域，其中，每个结构域是自我稳定的，且与蛋白质链的其他部分通过连接肽连接。它们可以独立发生，也可以作为复杂的多结构域蛋白质结构的一部分。结构域的截断、插入或重组是蛋白质功能进化的重要方式之一。已有研究表明，截断或插入酶的非催化结构域可以改变酶的热稳定性(Li et al.JAgri FoodChem,2018,66(41):10788-10798)。
说明：本发明实施例中提到的野生型N-乙酰氨基葡萄糖苷酶JB10NagA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其GenBank登录号为AQM74372。编码该酶的基因为N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因jb10nagA，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，其GenBank登录号为KX014621。
本发明以下实施例中的部分实验材料和试剂：
1、菌株及载体：大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)和表达载体pET-22b(+)购于Novagen公司。
2、酶类及其它生化试剂：Nickel-NTA Agarose购自QIAGEN公司，DNA聚合酶、dNTP及II试剂盒购自南京诺唯赞公司，对硝基苯酚-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷(pNPGlcNAc)购自上海源叶公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基
LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实验例1突变体MutNΔ120表达载体的构建和转化
对野生N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因jb10nagA的核苷酸序列进行密码子优化，并在其起始密码子之后引入编码序列9，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，在其终止密码子之前引入编码序列10，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，具体如下所示；因本实施例中所用的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因jb10nagA是构建在载体pET-22b(+)中的，引入的编码序列9和10分别对应为氨基酸片段‘ELAL和KGQF’的核苷酸片段，可以降低由原载体pEasy-E2更换为本实施例中现用载体pET-22b(+)引起的表达序列差异对酶学性质的影响。优化后得到核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶优化基因jb10nagA-opt，该优化基因jb10nagA-opt由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成，并构建了包含该优化基因jb10nagA-opt的重组表达质粒pET22b-jb10nagA-opt，并将该重组表达质粒pET22b-jb10nagA-opt转入了BL21(DE3)中，获得包含该优化基因的重组表达菌。该优化基因所表达的蛋白即为优化后的野生酶JB10NagA-opt，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
引入的编码序列如下所示(5’→3’)：
编码序列9(SEQ ID NO.9)：GAATTGGCACTT；
编码序列10(SEQ ID NO.10)：AAGGGACAATTC。
1)根据核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的野生酶优化基因jb10nagA-opt的序列和质粒pET-22b-jb10nagA-opt，使用CE Design软件设计重组引物F和R，具体序列如下：
其中，重组引物序列如下所示(5’→3’)：
F(SEQ ID NO.7)：
GGCACTTGGTCGTAATACCCCGCCG；
R(SEQ ID NO.8)：
GTATTACGACCAAGTGCCAATTCCATATGTATATCTCC。
以质粒pET-22b-jb10nagA-opt为模板进行PCR扩增，获得线性化pET-22b-mutNΔ120的PCR产物。其中，该PCR扩增的反应程序为：95℃变性30sec；然后95℃变性15sec，64℃退火15sec，72℃延伸3min 30sec，共30个循环；72℃保温5min。
2)在50μL线性化pET-22b-mutNΔ120的PCR产物中，加入1μL DpnI，于37℃消化1h。
3)根据II试剂盒的说明书，在3)中的消化产物加入2μL ExnasⅡ，于37℃下重组连接30min，即可获得含有突变体MutNΔ120编码基因的重组表达载体pET-22b-mutNΔ120，通过测序进一步确认可知，突变体MutNΔ120编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，同时可知，突变体MutNΔ120的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
可知，突变体MutNΔ120的氨基酸序列与优化后的野生酶JB10NagA-opt(SEQ IDNO.5)氨基酸序列相比，MutNΔ120不含有位于野生酶JB10NagA-opt的N端的第一个结构域P6-A124序列。
4)将4)中的重组表达载体通过热激方式转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得包含表达载体pET-22b-mutNΔ120的重组表达菌。
实验例2野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ120的制备
将含野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ120编码基因的重组表达菌株分别以0.1％的接种量，接种于LB(含100μg mL-1氨苄青霉素)培养液中，37℃快速振荡16h，对菌株进行活化。
将上述活化的菌液以1％接种量分别接种到新鲜的LB(含100μg mL-1氨苄青霉素)培养液中，快速振荡培养约2-3h(OD600达到0.6-1.0)后，加入终浓度0.7mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH＝6.0McIlvainebuffer悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经13000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTAAgarose和0-500mM的咪唑分别亲和和纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果如图1所示，其中，M为蛋白质Marker；泳道1为野生酶的细胞裂解液样；JB10NagA-opt为纯化的野生酶JB10NagA-opt；泳道2为突变体的细胞裂解液样；MutNΔ120为纯化的突变体MutNΔ120。结果表明，野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ120都获得了纯化，产物为单一条带。
实验例3野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ120的性质测定
1)纯化的野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ120的活性分析
活性测定方法采用对硝基苯酚(pNP)法：将底物pNPGlcNAc溶于缓冲液中，使其终浓度为2mM；反应体系含50μL的酶液(该酶液的浓度为0.5mg/mL)，450μL底物；底物在反应温度下预热5min后，随后加入酶液反应10min，然后加2mL的1M Na2CO3终止反应，冷却至室温后在405nm波长下测定OD值；1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol pNP所需的酶量。
2)纯化的野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ120的最适pH测定
将酶液置于37℃下和pH＝3.0–12.0的缓冲液中进行酶促反应。缓冲液为0.1MMcIlvaine buffer(pH＝3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)和0.1M glycine–NaOH(pH＝9.0、10.0、11.0、12.0)。以pNPGlcNAc为底物，反应10min，测定纯化的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的酶学性质。根据测定结果可知，野生酶JB10NagA-opt的最适pH为6.0，突变体MutNΔ120的最适pH为5.5-6.0。
3)纯化的野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ120的热活性及热稳定性测定
酶的热活性测定：本次测定的方案为在最适温度未知的情况下，采取两次测定，第一次在每间隔10℃的温度点进行活性测定，第二次在每间隔10℃进行活性测定，同时在活性最高的温度点左和右5℃所在的温度点进行测定，可以在测定的样本量基本不变的情况下，精确和验证测定结果。在pH＝6.0的缓冲液中，先于0-60℃下进行酶促反应，从0℃开始每隔10℃测一次酶活，得出野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ120的分别在50℃和40℃时的酶活性最高。再在pH＝6.0的缓冲液中，于0-60℃下进行酶促反应，从0℃开始每隔10℃测一次酶活，同时野生酶在45℃和55℃时进行酶活测定，突变体在35℃和45℃时进行酶活测定。
酶的热稳定性测定：分别将野生酶和突变体同样酶量的酶液置于37℃处理60min，每10min取样测一次酶活，在pH＝6.0及30℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPGlcNAc为底物，反应10min，测定纯化的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的酶学性质。
野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ120的热活性测定结果如图2所示，野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ120的热稳定性测定结果如图3所示。结果表明，野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ120的最适温度分别为50℃和45℃，突变酶MutNΔ120在10℃、20℃和30℃时分别具有25％、58％、67％的酶活力；37℃处理60min后，仍能保持78％的酶活力，而野生酶JB10NagA-opt在37℃处理60min剩余酶活力仅为36％，表明，该突变体相比野生酶的耐热性显著提高。
4)不同金属离子及化学试剂对纯化的野生酶JB10NagA-opt和突变体Mut NΔ120活力的影响
在酶促反应体系中加入1mM和10mM或0.5％(v/v)和1％(v/v)的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在30℃和pH＝6.0条件下，以pNPGlcNAc为底物测定酶活性，结果下表1所示。
表1不同金属离子及化学试剂对野生酶JB10NagA-opt和MutNΔ120活力的影响
由表1可知，1mM和10mM的AgNO3、HgCl2和SDS可完全抑制野生酶JB10NagA-opt和突变体MutNΔ120活力；在10mM的Pb(CH3COO)2和1％(v/v)Tween 80中，突变体MutNΔ120的活力比野生酶JB10NagA-opt的活力分别提高30％和22％。
综上可知，本发明利用基因工程技术，截断野生酶JB10NagA-opt的N端第一个结构域序列P6-A124，获得了突变体MutNΔ120，该突变体的最适温度活性为45℃，37℃处理60min后，仍能保持78％的酶活力，相比野生型N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，本发明提供的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体MutNΔ120耐热性显著提高，在37℃处理60min后的酶活力提高了42％；且低温活性也有所提高，在10℃、20℃和30℃时酶活力分别提高了17％、35％、21％。本发明提供的突变体MutNΔ120具有更宽的应用范围，这种特性可被用于功能性食品的生产或海产品加工等行业，具有显著的应用价值。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (8)
1.一种耐热性提高的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，该突变体为MutNΔ120，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该突变体在37℃处理60min后，仍能保持78％的酶活。
2.如权利要求1所述耐热性提高的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.包含如权利要求2所述编码基因的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述的载体选自pET-22b(+)。
5.包含如权利要求2所述编码基因的重组表达菌。
6.根据权利要求5所述的重组表达菌，其特征在于，所述的菌选自BL21(DE3)。
7.如权利要求1所述耐热性提高的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体在食品行业中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，该应用包含功能性食品生产或海产品加工。
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