CN105483101A - 低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA - Google Patents

低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶，β-N-乙酰葡糖胺酶氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示；制备方法包括：包含β-N-乙酰葡糖胺酶基因jb10nagA的重组载体，重组载体为pEasy-E2-jb10nagA，将乙酰葡糖胺酶基因插入到表达载体中，使核苷酸序列与表达调控序列相连接，用重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA表达；回收所表达的β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA。本发明的酶可催化水解几丁寡糖并与内切几丁质酶协同降解几丁质。本发明的β-N-乙酰葡糖胺酶可应用于海产品加工、生物燃料、医学、功能性食品等行业。

Description

低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶。
背景技术
几丁质是由N-乙酰-D-胺基葡萄糖单体通过β-1,4键形成的多聚糖，广泛存在于真菌、昆虫细胞壁以及甲壳类动物外骨骼中，其蕴藏量仅次于纤维素，居天然生物多聚高分子的第二位，但大量的几丁质并未得到有效利用，每年超过80000吨的几丁质被废弃(Patiletal.,EnzymeandMicrobialTechnology,2000,26:473–483)。β-N-乙酰葡糖胺酶属于几丁质降解酶系中的一种水解酶，可催化几丁寡糖降解为N-乙酰-D-胺基葡萄糖单体，在几丁质的彻底水解中起到关键性作用。根据氨基酸序列同源性，β-N-乙酰葡糖胺酶主要归类于糖苷水解酶第3、20、73和84家族(Cantareletal.,Nucleicacidsresearch,2009,37:D233–D238)。β-N-乙酰葡糖胺酶被广泛应用于功能性食品、保健品、化妆品、制药、饲料添加剂、生物燃料及生物防治等领域(Yangetal.,JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2014,62:5181–5190)。因为大多数β-N-乙酰葡糖胺酶易受到水解产物即N-乙酰-D-胺基葡萄糖的抑制，所以耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶可更有效地使几丁质彻底水解；另外，β-N-乙酰葡糖胺酶可解除几丁寡糖对内切几丁质酶的抑制作用，从而与内切几丁质酶产生协同作用(Yangetal.,JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2014,62:5181–5190)。耐盐酶在高浓度NaCl下仍然具有催化活性，可应用于高盐食品和海产品加工及其它高盐环境生物技术领域，在高盐环境下加工食品还可以防止微生物的污染并节省灭菌等所消耗的能源(Madernetal.Extremophiles,2000,4:91–98)。低温酶在低温环境中具有较高的酶活，相对于中温或高温酶有其特有的应用优势，如水产生境常常为10–25℃；将中温或者高温加工的过程转为低温加工过程还可起到降低能耗的作用(Cavicchiolietal.MicrobialBiotechnology,2011,4:449–460)。低温耐盐的β-N-乙酰葡糖胺酶在降解海洋生物来源的几丁质方面具有独特的优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶，旨在解决大量的几丁质并未得到有效利用的问题。
本发明是这样实现的，一种低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶，所述低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
进一步，所述低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶本总共含666个氨基酸，理论分子量为70.94kDa。
本发明的另一目的在于提供一种所述低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶的制备方法，所述低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶的制备方法包括以下步骤：
包含β-N-乙酰葡糖胺酶基因jb10nagA的重组载体，重组载体为pEasy-E2-jb10nagA，将乙酰葡糖胺酶基因插入到表达载体中，使核苷酸序列与表达调控序列相连接，用重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
培养重组菌株，诱导重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA表达；
回收所表达的β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA。
进一步，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21，得到重组菌株BL21/jb10nagA。
本发明的另一目的在于提供一种所述低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶的重组载体。
进一步，所述重组载体是将乙酰葡糖胺酶基因插入到表达载体中，使核苷酸序列与表达调控序列相连接。
本发明的另一目的在于提供一种所述低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶的重组菌株，重组菌株为BL21/jb10nagA。
本发明提供的低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶是一种新活性的β-N-乙酰葡糖胺酶：该酶的最适pH值为6，在pH5.0–7.0的范围内维持30％以上的酶活性；经pH6.0–8.0的0.1MMcIlvainebuffer处理1h，该酶酶活剩余85％以上；该酶最适温度为50℃，在0℃、10℃和20℃分别具有2.0％、8.5％和22.5％活性；在30℃以下处理1h，该酶活力基本无影响；在20％(w/v)的NaCl中，该酶仍然具有55％的活性；在反应体系中加入终浓度为20mM的N-乙酰-D-胺基葡萄糖时，该酶仍保留约82％的活性；该酶可催化水解几丁寡糖并与内切几丁质酶协同降解几丁质。本发明的β-N-乙酰葡糖胺酶可应用于海产品加工、生物燃料、医学、功能性食品等行业。
附图说明
图1是本发明实施例提供的低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的在大肠杆菌中表达的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA的SDS-PAGE分析；
图中：M：蛋白质Marker；CK：含载体pEasy-E2大肠杆菌菌体破碎上清液；S1：含有重组载体pEasy-E2-jb10nagA的大肠杆菌菌体破碎上清液；S2：纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA。
图3是本发明实施例提供的纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA的pH活性。
图4是本发明实施例提供的纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA的pH稳定性。
图5是本发明实施例提供的纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA的热活性。
图6是本发明实施例提供的纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA的热稳定性。
图7是本发明实施例提供的纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA在不同浓度NaCl中的活性。
图8是本发明实施例提供的纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA水解二乙酰壳二糖及四乙酰壳四糖的产物分析；
图中：M：N-乙酰-D-胺基葡萄糖；CK1：二乙酰壳二糖与灭活的JB10NagA；S1：二乙酰壳二糖与有活性的JB10NagA；CK2：四乙酰壳四糖与灭活的JB10NagA；S2：四乙酰壳四糖与有活性的JB10NagA。
图9是本发明实施例提供的纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA在不同浓度N-乙酰-D-胺基葡萄糖中的活性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例的低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶制备方法包括以下步骤：
S101：包含β-N-乙酰葡糖胺酶基因jb10nagA的重组载体，优选为pEasy-E2-jb10nagA，将乙酰葡糖胺酶基因插入到表达载体中，使核苷酸序列与表达调控序列相连接，用重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
S102：培养重组菌株，诱导重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA表达；
S103：回收所表达的β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA。
本发明的低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶可得自申氏杆菌(Shinellasp.)；JB10NagA的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
申氏杆菌(Shinellasp.)，遗传资源取自微生物，获取方式为自行采集；于2010年10月由周峻沛在中国、云南省、红河哈尼族彝族自治州采集。
本发明的β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA总共含666个氨基酸，理论分子量为70.94kDa。该酶的最适pH值为6，在pH5.0–7.0的范围内维持30％以上的酶活性；经pH6.0–8.0的0.1MMcIlvainebuffer处理1h，该酶酶活剩余85％以上；该酶最适温度为50℃，在0℃、10℃和20℃分别具有2.0％、8.5％和22.5％活性；在30℃以下处理1h，该酶活力基本无影响；在20％(w/v)的NaCl中，该酶仍然具有55％的活性；在反应体系中加入终浓度为20mM的N-乙酰-D-胺基葡萄糖时，该酶仍保留约82％的活性；该酶可催化水解几丁寡糖并与内切几丁质酶协同降解几丁质。
本发明提供了编码上述β-N-乙酰葡糖胺酶的基因jb10nagA，该基因序列如SEQIDNO.2所示。
本发明通过基因组测序的方法克隆了β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA的编码基因jb10nagA，其全长2001bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA。
经BLAST比对，该β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA全序列与GenBank中的Rhizobiumsp.Root1212来源的糖苷水解酶第20家族β-N-乙酰葡糖胺酶(WP_056316341)具有最高的氨基酸序列一致性，为69.9％。该Rhizobium来源的蛋白序列只是通过序列相似性判断为糖苷水解酶第20家族β-N-乙酰葡糖胺酶，其与JB10NagA具有较大的序列差异，其活性也还未研究，无法得知该蛋白的pH活性范围、热活性范围、耐盐性及N-乙酰-D-胺基葡萄糖对其的抑制程度等酶学性质。因此，JB10NagA所具有的酶学性质无法预测。
本发明还提供了包含上述β-N-乙酰葡糖胺酶基因jb10nagA的重组载体，优选为pEasy-E2-jb10nagA。将本发明的乙酰葡糖胺酶基因插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的β-N-乙酰葡糖胺酶基因和表达载体pEasy-E2通过T-A方式相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEasy-E2-jb10nagA。
本发明还提供了包含上述β-N-乙酰葡糖胺酶基因jb10nagA的重组菌株，优选为重组菌株BL21(DE3)/jb10nagA。
其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3)/jb10nagA。
下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。
试验材料和试剂
1、菌株及载体：申氏杆菌(Shinellasp.)同文献报道菌种性质，如中国普通微生物菌种保藏管理中心菌株ShinellazoogloeoidesCGMCC1.6838；大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)和表达载体pEasy-E2购于Novagen公司。
2、酶类及其它生化试剂：DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；pNP(p-nitrophenol)、pNP-GlcNAc(p-nitrophenylβ-N-acetylglucosaminide)、p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside、p-nitrophenylβ-D-glucopyranoside购自Sigma公司；pNP-GalNAc(p-nitrophenylβ-N-acetylgalactosaminide)、二乙酰壳二糖及四乙酰壳四糖购自百灵威科技公司；GenomicDNAClean&Concentration试剂盒购自ZymoResearch公司；TureseqTMDNASamplePreparationKit购自Illumima公司；商业内切几丁质酶(来源于Streptomycesgriseus)购于上海源叶生物科技有限公司；其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
LB培养基：Peptone10g，Yeastextract5g，NaCl10g，加蒸馏水至1000ml，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
4β-N-乙酰葡糖胺酶基因jb10nagA的克隆
提取申氏杆菌基因组DNA：将菌株培养6d后取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液，裂解液组成为：50mMTris，20mMEDTA，NaCl500mM，2％SDS(w/v)，pH8.0，70℃水浴裂解60min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。
用超声打断仪Biorupter将5μg的申氏杆菌基因组打断为400–600bp的片段，用GenomicDNAClean&Concentration试剂盒对打断的DNA片段进行纯化，纯化后用TureseqTMDNASamplePreparationKit进行DNA片段的末端补平、3'端加A碱基和加接头、及DNA片段的PCR扩增(操作按试剂盒说明书进行)。用MiSeq基因组测序仪(Illumima公司)对上述制备好的文库进行基因组测序。
基因组测序得到的数据经读码框预测和本地BLAST比对，得到β-N-乙酰葡糖胺酶基因jb10nagA，该基因序列如SEQIDNO.2所示。
5重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA的制备
以5'CCCGCCCTCGAAACCATGTT3'和5'GTGTCCGGAAGATCCGTAAAGCAC3'为引物对，申氏杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，53℃退火2min，72℃延伸2min，30个循环后72℃保温10min。PCR结果得到β-N-乙酰葡糖胺酶基因jb10nagA，并将该酶基因jb10nagA与表达载体pEasy-E2相连接，获得含有β-N-乙酰葡糖胺酶基因jb10nagA的重组质粒pEasy-E2-jb10nagA，将pEasy-E2-jb10nagA转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/jb10nagA。
取含有重组质粒pEasy-E2-jb10nagA的重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/jb10nagA，以0.1％的接种量接种于LB(含50μgmL-1Amp)培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含50μgmL-1Amp)培养液中，快速振荡培养约2–3h(OD600达到0.6–1.0)后，加入终浓度0.7mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0Tris-HCl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体，破碎后在4℃下13,000rpm离心10min，吸取上清进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE结果(图2)表明，重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA在大肠杆菌中得到了表达，经纯化后，产物为单一条带。
下面对纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA的性质及应用效果作详细的描述。
1、纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA的活性分析
纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA的活性测定方法采用pNP法：将底物溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为2mM；反应体系含50μL适量酶液，450μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后加2mL1MNa2CO3终止反应，冷却至室温后在405nm波长下测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解pNP类化合物产生1μmolpNP所需的酶量。对底物二乙酰壳二糖、四乙酰壳四糖、几丁质的活性测定方法采用DNS法：将底物溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为0.5％(w/v)；反应体系含100μL适量酶液，900μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后加1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值；1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol还原糖(以乙酰葡糖胺计)所需的酶量。
2、纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA的pH活性和pH稳定性测定：
酶的最适pH测定：将β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA在37℃下和0.1MpH4.0–9.0的缓冲液中进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将酶液置于0.1MpH5.5–10.0的缓冲液中，在37℃下处理1h，然后在pH7及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为：0.1MMcIlvainebuffer(pH4.0–8.0)、0.1MTris-HCl(8.0–9.0)及0.1Mglycine-NaOH(pH9.0–10.0)。以pNP-GlcNAc为底物，反应10min，测定JB10NagA的酶学性质。结果表明：JB10NagA的最适pH为6，在pH5.0–7.0的范围内维持30％以上的酶活性(图3)；经pH6.0–8.0的McIlvainebuffer处理1h，该酶剩余85％以上酶活(图4)。
3、纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA的热活性及热稳定性测定：
酶的最适温度测定：在pH6的缓冲液中，于0–60℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于30℃、37℃、50℃中，处理0–60min后，在pH6及50℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNP-GlcNAc为底物，反应10min，测定JB10NagA的酶学性质。结果表明：JB10NagA的最适温度为50℃，在0℃、10℃和20℃分别具有2.0％、8.5％和22.5％活性(图5)；该酶在30℃下处理1h，酶活力基本无影响(图6)。
4、不同金属离子及化学试剂对纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA活力的影响：
在酶促反应体系中加入1mM和10mM或0.5％(v/v)和1％(v/v)的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在50℃及pH6条件下，以pNP-GlcNAc为底物测定酶活性。结果(表1)表明，1mM和10mM的AgNO3、SDS和HgCl2可完全抑制JB10NagA活性；10mM的CuSO4和1％(v/v)的Tween-80对JB10NagA的抑制较强；其余金属离子和化学试剂对JB10NagA的作用较弱或无影响。
表1.金属离子及化学试剂对重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA活力的影响
5、纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA在NaCl中的活性：
酶在NaCl中的活性测定：在酶促反应体系中加入3.0–30.0％(w/v)NaCl，于pH6及30℃下进行酶促反应。以pNP-GlcNAc为底物，反应10min，测定纯化的JB10NagA的酶学性质。结果表明：JB10NagA具有良好的耐盐性，在反应体系中加入20％(w/v)的NaCl，该酶仍然具有55％的活性(图7)。
6、纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA对不同底物的降解：
在pH6及50℃下，重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA对pNP-GlcNAc、pNP-GalNAc、二乙酰壳二糖、四乙酰壳四糖的酶活分别为23.91Umg-1、5.18Umg-1、35.36Umg-1、26.71Umg-1，对几丁质、p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside、p-nitrophenylβ-D-glucopyranoside均无酶活。
7、纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA水解几丁寡糖的产物分析：
产物分析反应体系含80μL0.5％(w/v)的几丁寡糖和80μL纯酶液，在pH6及37℃下，反应6h。采用薄层层析法进行产物分析，薄层层析法步骤如下：
(1)配制展开剂(冰醋酸、双蒸水、正丁醇体积比为1：1：2，配制适量)倒入展开槽，静置约30min；
(2)将硅胶板放于110℃烘箱活化30min，冷却后划线，点样(每次0.5μL，吹干，共点3次)；
(3)将点样的一端硅胶板朝下放入展开槽，点样点不可没入展开剂；
(4)待展开剂到硅胶板上沿1.5cm时，取出硅胶板，吹干，再展一次；
(5)第二次展开结束后，硅胶板直接浸入适量显色剂(1g二苯胺溶入50ml丙酮，溶解后加1ml苯胺及5ml85％的磷酸，混匀，现用现配)；
(6)几秒后，立即取出硅胶板并放入90℃烘箱10-15min，使斑点显色
结果表明，JB10NagA可将二乙酰壳二糖、四乙酰壳四糖水解为N-乙酰-D-胺基葡萄糖单糖(图8)。
8、N-乙酰-D-胺基葡萄糖对重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA活性的影响
在酶促反应体系中加入终浓度为0–20mM的N-乙酰-D-胺基葡萄糖，于pH6.0及50℃下进行酶促反应。以pNP-GlcNAc为底物，反应10min，测定纯化的JB10NagA的酶学性质。结果表明：当反应体系加入终浓度为20mM的N-乙酰-D-胺基葡萄糖时，该酶仍保留约82％的活性，表明N-乙酰-D-胺基葡萄糖对JB10NagA抑制作用较低(图9)。
9、纯化的重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA与内切几丁质酶的协同作用
几丁质预处理：几丁质用85％磷酸溶解后，再用双蒸水一直洗涤至pH呈中性，成为胶体几丁质。在pH6及25℃条件下，采用DNS法，分别用海源叶生物科技有限公司的商业内切几丁质酶和JB10NagA水解胶体几丁质，反应2h；同时添加内切几丁质酶和JB10NagA水解胶体几丁质；内切几丁质酶和JB10NagA在不同时间条件下水解胶体几丁质。协同作用度的定义是协同作用产生的还原糖与每一种酶单独作用于底物时所生成还原糖总和的比值。
结果(表2)表明β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA与商业内切几丁质酶可协同降解胶体几丁质：同时添加内切几丁质酶和JB10NagA所生成的还原糖量是两种酶单独作用胶体几丁质所生成的还原糖量的2.8倍；内切几丁质酶和JB10NagA在不同时间条件下先后水解胶体几丁质，还原糖生成量大约是两种酶单独作用胶体几丁质所生成的还原糖量的2倍。
表2.β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA与商业内切几丁质酶协同降解几丁质
注：CK1：商业内切几丁质酶与底物作用2h；CK2：JB10NagA与底物作用2h；S1：商业内切几丁质酶与JB10NagA共同作用2h；S2：商业内切几丁质酶作用30min后加入JB10NagA再作用1h30min；S3：商业内切几丁质酶作用1h后加入JB10NagA再作用1h；S4：商业内切几丁质酶作用1h30min后加入JB10NagA再作用30min；协同作用度：协同作用产生的还原糖与每一种酶单独作用于底物时所生成还原糖总和的比值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶，其特征在于，所述低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.如权利要求1所述的低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶，其特征在于，所述低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶本总共含666个氨基酸，理论分子量为70.94kDa。
3.一种编码权利要求1所述的β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA的β-N-乙酰葡糖胺酶基因jb10nagA，其特征在于其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
4.一种如权利要求1所述低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶的制备方法，其特征在于，所述低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶的制备方法包括以下步骤：
首先包含β-N-乙酰葡糖胺酶基因jb10nagA的重组载体，重组载体为pEasy-E2-jb10nagA，将乙酰葡糖胺酶基因插入到表达载体中，使核苷酸序列与表达调控序列相连接，用重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
然后培养重组菌株，诱导重组β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA表达；
最后回收所表达的β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA。
5.如权利要求4所述的低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21，得到重组菌株BL21/jb10nagA。
6.一种包含权利要求1所述低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶的重组载体。
7.如权利要求6所述重组载体，其特征在于，所述重组载体是将乙酰葡糖胺酶基因插入到表达载体中，使核苷酸序列与表达调控序列相连接。
8.一种包含如权利要求1所述低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶的重组菌株，重组菌株为BL21/jb10nagA。
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