CN117737039A - 一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7及其制备与应用，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明解决了野生型N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶在最适温度附近的热稳定性差的问题。本发明的突变体的最适温度为35℃，在37℃耐受1h后仍能保持53%以上的酶活；与野生酶相比，该突变体的最适温度下降了10℃，且其在37℃耐受1h后的剩余酶活提升了42%；该突变体有利于拓宽其在功能性食品生产领域的应用，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7及其制备与应用。
背景技术
氨基葡萄糖苷及其衍生物具有重要的经济价值，可广泛应用于医药大健康领域和食品加工行业等。现有文献1（Liu et al. Revisiting glycoside hydrolase family 20β-N-acetyl-D-hexosaminidases: Crystal structures, physiological substratesand specific inhibitors, Biotechnol Adv, 2018, 36(4): 1127–1138）公开氨基葡萄糖苷及其衍生物预防和治疗骨关节慢性炎症疾病，促进软骨损伤的愈合，改善肠道消化吸收功能，调节胎儿心脏的生长发育；也可用于生产唾液酸、生物乙醇和单细胞蛋白质等。文献2（Ma et al. Categories and biomanufacturing methods of glucosamine, ApplMicrobiol Biot, 2019,103(19):7883–7889）公开乙酰氨基葡萄糖苷酶（GlcNAcases，N-acetyl-glucosaminidases，EC 3.2.1.52）作为生物制备法生产氨基葡萄糖苷及其衍生物的关键酶制剂之一，可协同几丁质酶降解富含几丁质的环境废弃物，如虾壳或真菌菌丝体等。文献3（Zhang et al. Enzymatic properties of β-N-acetylglucosaminidases,Appl Microbiol Biot, 2018, 102(1): 93–103）公开从几丁寡糖非还原末端逐个切割生产功能性乙酰氨基葡萄糖苷。
HJ5Nag是一种高活性、耐产物抑制的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，但是其最适温度为45℃，35℃仅为最高酶活力的50%左右，而相似的温度下其热稳定性较差，在37℃下处理1h剩余酶活力仅为11%，最适温度和热稳定性的不一致，极大限制了其生产功能性乙酰氨基葡萄糖苷的应用。
因此，利用蛋白质工程改造野生酶HJ5Nag，提高其在最适温度的热稳定性，有利于其在功能性食品生产领域，具有重要的应用意义和经济价值。
发明内容
发明的目的是提供一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7及其制备与应用，解决了野生型N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在最适温度附近的热稳定性差的问题。
为了达到上述目的，本发明提供了一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了一种如所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供了一种包含如所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7的编码基因的重组表达载体。
优选地，所述的重组表达载体选自pEASY-E2。
本发明提供了一种包含如所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7的编码基因的重组表达菌。
优选地，所述的重组表达菌选自大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明提供了一种如所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7的制备方法，包含以下步骤：
（1）以含有野生酶编码基因如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的重组质粒为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6突变引物对进行突变扩增，得到含有如SEQ IDNO.2所示核苷酸序列的突变体编码基因的重组质粒；
（2）将步骤（1）得到的重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，获得转化子，筛选阳性克隆，即得到重组表达菌；
（3）培养步骤（2）得到的重组表达菌接种至LB液体培养基中，进行诱导表达，纯化得到所述N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7。
本发明提供了一种如所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7或如所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7的编码基因在功能性食品生产领域中的应用。
本发明提供了一种如所述的重组表达载体在功能性食品生产领域中的应用。
本发明提供了一种如所述的重组表达菌在功能性食品生产领域中的应用。
本发明的一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7及其制备与应用，解决了野生型N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在最适温度附近的热稳定性差的问题，具有以下优点：
本发明利用基因工程技术，提供了一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7，其最适温度为35℃，在37℃耐受1h后仍能保持53%以上的酶活。与野生酶相比，De259AΔ7最适温度下降了10℃，且其在37℃耐受1h后的剩余酶活提升了42%。本发明的突变体有利于拓宽其在功能性食品生产领域的应用，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明提供的野生酶HJ5Nag和突变体De259AΔ7的SDS-PAGE分析结果。
图2为本发明提供的野生酶HJ5Nag和突变体De259AΔ7的最适pH测定结果。
图3为本发明提供的野生酶HJ5Nag和突变体De259AΔ7的最适温度测定结果。
图4为本发明提供的野生酶HJ5Nag和突变体De259AΔ7的37℃热稳定性测定结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
说明：本发明实施例中提到的野生型N-乙酰氨基葡萄糖苷酶HJ5Nag，是插入pEASY-E2表达载体的重组区域的表达产物。该酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，GenBank登录号为ARJ33352；编码该酶的基因为N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因hj5nag，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，GenBank登录号为KX400857。
本发明以下述实施例中采用的部分实验材料和试剂：
1.菌株及载体：大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)购自北京擎科生物技术有限公司、表达载体pEASY-E2购于Novagen公司。
2.酶类及其它生化试剂：Nickel-NTA Agarose购自QIAGEN公司，QuickMutationTM基因定点突变试剂盒购自上海碧云天公司，对硝基苯酚-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷（pNPGlcNAc）购自上海源叶公司，其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。
3.培养基
LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加蒸馏水至1000 mL，pH自然（约为7）。固体培养基在此基础上加2.0%（w/v）琼脂。
说明：本实施例中未作详细具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1 突变体De259AΔ7表达载体的构建和转化:
本发明以野生型N-乙酰氨基葡萄糖苷酶HJ5Nag的核苷酸序列作为参考，其GenBank登录号为KX400857，删除信号肽（该肽的核苷酸序列：AATCGTCGCCGAGGACGGGCCATCGCCGCCGCCACGGTGCTCGCCGCGTCGCTGGCG，该肽的氨基酸序列：NRRRGRAIAAATVLAASLA），其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
（1）根据核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的野生酶基因hj5nag的序列和质粒pEASY-E2-hj5nag，使用CE Design软件设计重组引物F和R，具体序列如下：
其中，重组引物序列如下所示（5’→3’）：
F（SEQ ID NO.5）：GCGAGACCCTGCCCGAGAGCGGCACGCCCTACC；
R（SEQ ID NO.6）：TCTCGGGCAGGGTCTCGCGCATCGGGTCGGTGA。
根据QuickMutationTM基因定点突变试剂盒的制造商说明，以质粒pEASY-E2- hj5nag为模板进行PCR扩增，获得pEASY-E2-de259AΔ7的PCR产物。其中，该PCR扩增的反应程序为：95℃预变性30min；然后95℃变性30sec，60℃退火30sec，68℃延伸7min，共20个循环；68℃延伸、补全15min；4℃暂时存放30min。
（2）PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1μL DpnI，混匀后37℃水浴锅中孵育5min。DpnI消化完毕后可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。
（3）转化及鉴定：将PCR消化产物通过热激的方法转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，挑取单菌落培养保种后，可获得包含表达载体pEASY-E2-de259AΔ7的重组表达菌。通过北京擎科生物技术公司测序结果确认可知，突变体De259AΔ7编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，同时可知，突变体De259AΔ7的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，De259AΔ7是删除了氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的野生酶HJ5Nag第259-265位的AAATGGA氨基酸残基片段。
实施例2 野生酶HJ5Nag和突变体De259AΔ7的制备:
将含野生酶HJ5Nag和突变体De259AΔ7编码基因的重组表达菌株分别以0.1%（v/v）的接种量，接种于LB（含100µg mL−1氨苄青霉素）培养液中，37℃、180rpm过夜培养，得到活化的菌液。
将上述活化的菌液以1%（v/v）接种量分别接种到新鲜的LB（含100 µg mL−1氨苄青霉素）培养液中，用37℃、180 rpm恒温摇床快速振荡培养约2~3 h，当培养液的OD600达到0.6~1.0之间，加入终浓度为0.7 mM IPTG进行诱导，20℃和160 rpm恒温摇床培养约20 h。将诱导后的菌液放在4℃、6000 rpm的低温离心机里离心10 min，收集菌体。用适量的pH=7.0McIlvaine buffer悬浮菌体后，于冰水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经12000 rpm离心10 min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose和0~500 mM的咪唑分别亲和和洗脱目的蛋白。
如图1所示，本发明提供的野生酶HJ5Nag和突变体De259AΔ7的SDS-PAGE分析结果，其中，M为蛋白质Marker；HJ5Nag粗酶液为未纯化的野生酶HJ5Nag；HJ5Nag为纯化的野生酶HJ5Nag；De259AΔ7为纯化的突变体De259AΔ7。由图1可知，野生酶HJ5Nag和突变体De259AΔ7都获得了纯化，产物为单一条带。
实施例3 野生酶HJ5Nag和突变体De259AΔ7的性质测定:
（1）纯化的野生酶HJ5Nag和突变体De259AΔ7的活性分析
活性测定方法采用对硝基苯酚（pNP）法：将底物pNPGlcNAc溶于缓冲液中，使其终浓度为2mM；反应体系含50μL的适量酶液，450 μL底物；底物预热5 min后，随后加入酶液反应10 min，然后加2 mL的1M Na2CO3终止反应，冷却至室温后在405nm波长下测定OD值；1个酶活单位（U）定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1 μmol pNP所需的酶量。
（2）纯化的野生酶HJ5Nag和突变体De259AΔ7的最适pH测定
采取两步法测定野生酶和突变体的最适pH，第一次在每间隔1个pH单位点进行活性测定，第二次在活性最高的pH单位点及其左和右0.5个pH单位所在的点进行测定，可以在测定的样本量基本不变的情况下，精确和验证测定结果。在30℃下，缓冲液为0.1MMcIlvaine buffer（pH=5.0~8.0）和0.1M glycine–NaOH（pH=9.0）。以pNPGlcNAc为底物，反应10 min，测定纯化的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的酶活力。首先将酶液置pH=5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的缓冲液中进行上述条件酶促反应。得出野生酶HJ5Nag和突变体De259AΔ7均在pH 6.0的酶活力最高。再测定野生酶和突变体分别在pH=5.5、6.0和6.5的缓冲液中的酶活性。
如图2所示，本发明提供的野生酶HJ5Nag和突变体De259AΔ7的最适pH测定结果。由图2可知，野生酶HJ5Nag的最适pH为6.0，突变体De259AΔ7的最适pH为6.0~6.5。
（3）纯化的野生酶HJ5Nag和突变体De259AΔ7的热活性测定
采取两步法测定野生酶和突变体的最适温度，第一次在每间隔10℃的温度点进行活性测定，第二次在活性最高的温度点及其左和右5℃所在的温度点进行测定，可以在测定的样本量基本不变的情况下，精确和验证测定结果。在pH=6.0的缓冲液中，先于0~60℃下进行酶促反应，从0℃开始每隔10℃测一次酶活，得出野生酶HJ5Nag在40℃时的酶活性最高，突变体De259AΔ7在30℃时的酶活性最高。后在pH=6.0的缓冲液中，测定野生酶在35℃、40℃和45℃时酶活力，突变体De259AΔ7在25℃、30℃和35℃时酶活力。
如图3所示，本发明提供的野生酶HJ5Nag和突变体De259AΔ7的最适温度测定结果。由图3可知，野生酶HJ5Nag和突变体De259AΔ7的最适温度分别为45℃和35℃。
（4）纯化的野生酶HJ5Nag和突变体De259AΔ7的热稳定性测定
将相同单位的野生酶和突变体的酶液分别置于37℃条件下处理，在热处理10min、20min、30min和60min时间点取样，取出的样品在pH=6.0和30℃下测定剩余酶活力，以未热处理酶液的酶活力作为对照。
如图4所示，本发明提供的野生酶HJ5Nag和突变体De259AΔ7的37℃热稳定性测定结果。由图4可知，突变体De259AΔ7在37℃处理1h后，仍能保持53%以上的酶活力，而野生酶HJ5Nag在37℃处理1h后酶活力仅剩余11%，相比野生N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在37℃处理1h后的酶活力提高了42%，最适温度附近的耐热性显著提高。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (10)
1.一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7，其特征在于，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7的编码基因，其特征在于，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种包含如权利要求2所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7的编码基因的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体选自pEASY-E2。
5.一种包含如权利要求2所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7的编码基因的重组表达菌。
6.根据权利要求5所述的重组表达菌，其特征在于，所述的重组表达菌选自大肠杆菌BL21(DE3)。
7.一种如权利要求1所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
（1）以含有野生酶编码基因如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的重组质粒为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6突变引物对进行突变扩增，得到含有如SEQ IDNO.2所示核苷酸序列的突变体编码基因的重组质粒；
（2）将步骤（1）得到的重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，获得转化子，筛选阳性克隆，即得到重组表达菌；
（3）培养步骤（2）得到的重组表达菌接种至LB液体培养基中，进行诱导表达，纯化得到所述N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7。
8.一种如权利要求1所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7或如权利要求2所述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De259AΔ7的编码基因在功能性食品生产领域中的应用。
9.一种如权利要求3所述的重组表达载体在功能性食品生产领域中的应用。
10.一种如权利要求5所述的重组表达菌在功能性食品生产领域中的应用。
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