WO2005085447A1 - β-フルクトフラノシダーゼ変異体 - Google Patents

β-フルクトフラノシダーゼ変異体 Download PDF

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WO2005085447A1
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amino acid
substitution
acid residue
group
seq
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Hirofumi Nakamura
Akitaka Nakane
Hidetoshi Kubota
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Meiji Seika Kaisha, Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01026—Beta-fructofuranosidase (3.2.1.26), i.e. invertase

Definitions

  • the present invention relates to a ⁇ -fructofuranosidase mutant that selectively and efficiently generates a specific fratatooligosaccharide from sucrose, and more particularly, to a ⁇ -fructofruit that efficiently produces 1-kestose.
  • the present invention relates to a furanosidase mutant and a j8-fructo furanosidase mutant that efficiently produces nystose.
  • fratato-oligosaccharides are oligosaccharides in which one to three molecules of fructose are linked to fructose of sucrose at positions C1 and C2
  • the technology to produce large quantities from sucrose using the reaction has been established and is industrially produced.
  • the j8-fructofuranosidase currently used for industrial production of fratatooligosaccharides uses intracellular j8-fructofuranosidase derived from Aspergillus niger.
  • the gene encoding the 13-fructofuranosidase is disclosed in WO97Z34004.
  • the j8-fructofuranosidase produces fratato-oligosaccharide as a mixture of 1-kestose, nystose and 1-fructosylnystose, and fructo-oligosaccharide is manufactured and provided as a syrup or powder of an oligosaccharide mixture.
  • j8-fructofuranosidase that can selectively and efficiently produce 1-kestose or nystose as a single component is obtained, the following utility exists.
  • the enzyme used in this method As the characteristics of the enzyme used in this method, a high conversion rate of sucrose to 1-kestose and a low production amount of nystose are required by industrial production methods. Similarly, when -stose is produced as a single component, the industrial conversion method requires that the conversion rate to nystose is high and that 1 the amount of fructosyl nystose produced is low. ing.
  • An object of the present invention is to provide a j8-fructofuranosidase mutant whose reaction characteristics are improved so as to be suitable for production of a single component of a fratatooligosaccharide, for example, 1-kestose or -stose, and its gene. .
  • the present inventors have determined that a j8-fructofuranosidase mutant in which an amino acid residue at a specific position in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has been substituted with another amino acid residue is a 1-kestose or a ha-stose. It has been found that it has reaction characteristics suitable for the production of
  • the mutant j8-fructofuranosidase according to the present invention is advantageous in that a single component of a fratatooligosaccharide can be industrially produced more easily and inexpensively than in the past.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and homologs thereof are aligned.
  • the upper row shows the amino acid sequence of J8-fructofuranosidase from AikgE (SEQ ID NO: 2)
  • the middle row shows the amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase from S. brevicaulis (SEQ ID NO: 6)
  • the lower row shows the amino acid sequence of P. roaueforiti.
  • 1 shows the amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase (SEQ ID NO: 4).
  • the numbers in the figure represent the amino acid numbers when the ⁇ terminus of A ⁇ JlkgE is the first.
  • the part indicated by the frame indicates a specific mutation part.
  • FIG. 2 is a continuation of the amino acid sequence of FIG.
  • the variants according to the first and second aspects of the present invention are those in which a mutation has been introduced into at least one of the specific amino acid residues of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and homologs thereof.
  • the position of the amino acid residue into which the mutation is introduced corresponds to the amino acid residue number in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • mutant means substitution, deletion, and insertion.
  • substitution means that a specific amino acid residue has been removed and another amino acid residue has been inserted at the same position.
  • “Insertion” means that one or more amino acid residues are inserted before or after a specific amino acid residue, specifically, a specific amino acid residue. It means that one or more, preferably one or several, amino acid residues are bonded to the a carboxyl group or the a amino group of the amino acid residue.
  • the number of specific mutations introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and its homologue is as follows: although not particularly limited, it can be one or several, one to three, or one or two.
  • the mutation introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a homolog thereof are preferably substitutions.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and its homologues at positions 62, 122, 128, 165, 221, 395, and 550 is preferably as follows.
  • the mutant according to the first aspect of the present invention at least one of the amino acid residues of Nos. 170, 300, 313, and 386 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and homologs thereof
  • the group may further have a mutation, preferably a substitution.
  • the j8-fructofuranosidase having these mutations is advantageous in that 1-kestose can be selectively and efficiently produced (see, for example, WO99Z13059).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a homolog thereof can be introduced at positions 170, 300, 313, and 386.
  • the exchange is preferably as follows.
  • preferred multiple mutations that can be introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and its homologue include the amino acid residue at position 165; And a triple mutation of the amino acid residue at position 313, more preferably a triple substitution, and particularly preferably, a group power of the amino acid residue at position 165, which is tributophan, phenylalanine, and tyrosine.
  • Substitution with the selected aromatic amino acid (most preferably substitution with phenylalanine), and substitution of amino acid residue 300 with the selected amino acids of tryptophan, phenylalanine, tyrosine and balinka (Most preferably, substitution for phosphorus) and the group force of amino acid residue 313, which is lysine, arginine, and histidine.
  • substitution of groups of amino acids include also a triple substitution with force.
  • the substitution introduced into the amino acid residues at positions 40, 379, and 381 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a homolog thereof is preferably Is as follows.
  • the term "homolog” refers to at least one Or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 having a plurality of mutations and having ⁇ -fructofuranosidase activity.
  • the number of mutations can be one to several, or one, two, three, or four.
  • whether or not a homologue has the / 3 fructofuranosidase activity is evaluated, for example, by allowing a protein having the amino acid sequence to act on a substrate and detecting a reaction product. For example, it can be evaluated according to the method described in Example 2.
  • the position of the specific mutation according to the present invention in the homologue is determined based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the amino acid residue number of SEQ ID NO: 2 corresponding to the homologue.
  • the "mutation of the 62nd amino acid residue” in the homologue means the homologue corresponding to the 62nd amino acid residue of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 which is not the mutation of the 62nd amino acid residue of the homologue.
  • the alignment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with the homolog can be performed using analysis software for examining sequence identity. Needless to say, such software is well known and can be appropriately selected and used by those skilled in the art. For example, the BLAS method (Basic local alignment search tool; Altschul, S.. Et al.,
  • J. Mol. Biol., 215, 403-410 (1990) can be used to align the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with the homolog to determine the corresponding amino acid residue.
  • homologues include one or more (eg, one to several, or one, two, three, or four) mutations that do not affect the / 3 fructofuranosidase activity.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is exemplified.
  • examples of the “mutation that does not affect the activity” include conservative substitution.
  • Constant substitution refers to the replacement of one or more amino acid residues with another, chemically similar amino acid residue without substantially altering the activity of the protein. For example, there is a case where a certain hydrophobic residue is substituted with another hydrophobic residue, and a case where a certain polar residue is replaced with another polar residue having the same charge.
  • Functionally similar amino acids that can make such substitutions are known in the art for each amino acid. It is known. Specific examples include non-polar (hydrophobic) amino acids such as alanine, phosphine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine.
  • Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, dartamine, asparagine, and cysteine.
  • Examples of positively charged (basic) amino acids include anoreginin, histidine, and lysine.
  • Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • Examples of the "homolog” also include j8-fructofuranosidase produced by a microorganism belonging to the genus Aspergillus, Penicillium and Scopulariopsis.
  • j8-fructofuranosidase produced by a microorganism belonging to the genus Aspergillus, Penicillium and Scopulariopsis.
  • ⁇ -funorectofurano derived from Aspergillus niger Among ferns ⁇ -fructofuranosidase from Penicillium roaueforti and ⁇ -fructofuranosidase from ScoDulariopsis brevicaulis are mentioned.
  • Examples of j8-fructofuranosidase derived from Penicillium roaueforti include a protein (SEQ ID NO: 4) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in W099Z13059.
  • examples of j8-fructofuranosidase derived from ScoDulariopsis brevicaulis include a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in WO99Z13059 (SEQ ID NO: 6).
  • the DNA sequence encoding it is easily determined by referring to a so-called codon table. Therefore, various amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 into which the specific mutation according to the present invention has been introduced and homologs thereof, for example, various amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, and 6 into which the specific mutation according to the present invention has been introduced, The DNA sequence can be appropriately selected. Therefore, the specific mutation according to the present invention has been introduced.
  • the DNA sequence encoding the fructofuranosidase mutant has a DNA mutation corresponding to the specific amino acid mutation according to the present invention.
  • 8-fructofuranosidase gene A DNA sequence which has the same DNA sequence except that codons having the degenerate relationship are used, and which encodes a ⁇ -fructofuranosidase mutant.
  • the DNA sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, and 6 in which the specific mutation according to the present invention has been introduced refers to SEQ ID NOs: 1, 3, and 5 having one or more mutations described in Table 3 described below.
  • 5 Not only the DNA sequence of the present invention but also a DNA sequence which has the same DNA sequence except that the degenerate codons are used and encodes a j8-fructofuranosidase mutant.
  • ⁇ 8-fructofuranosidase mutants can be produced by recombinant DNA technology, polypeptide synthesis technology, and the like. If recombinant DNA technology is used, DNA that encodes
  • 8-fructofuranosidase eg, the DNA sequence of SEQ ID NO: 1, 3, or 5
  • a method for introducing a site-specific mutation of a gene a method well known to those skilled in the art such as a gapped duplex method and a Kunkel method can be used. These methods can be used to generate mutations at specific sites in the DNA encoding j8-fructofuranosidase.
  • a commonly used method such as an error-blown PCR method can be employed.
  • the nucleotide sequence of the DNA after the mutation treatment can be confirmed by the chemical modification method of Maxam's Gilbert, dideoxynucleotide chain termination method, etc., and the amino acid sequence of the ⁇ -fructofuranosidase mutant It can be decoded from the sequence.
  • the ⁇ 8-fructofuranosidase mutant is a recombinant DNA fragment that is linked to a DNA molecule, particularly a DNA expression vector, that is capable of replicating and expressing the gene in host cells. It can be prepared by preparing a vector, introducing the recombinant vector into a host to obtain a transformant, and culturing the transformant under appropriate culture conditions.
  • the vector used in the present invention can be appropriately selected from viruses, plasmids, cosmid vectors and the like in consideration of the type of host cell used.
  • host When the vesicle is Escherichia coli, pUC and pBR plasmids, for Bacillus subtilis, pUB plasmid, and for yeast, YEp, YRp and YCp plasmid vectors.
  • a plasmid can be used as a recombinant vector.
  • the plasmid preferably contains a transformant selectable marker.
  • a drug resistance marker or an auxotrophic marker can be used.
  • Preferred examples thereof include an ampicillin resistance gene, a kanamycin resistance gene, a tetracycline resistance gene when the host cell used is a bacterium, and a tryptophan synthesis gene (TRP1) and a peracil synthesis gene (URA3) when the host cell is a yeast.
  • LEU2 leucine synthesis gene
  • Hyg hygromycin resistance gene
  • Bar bialaphos resistance gene
  • niaD nitrate reductase gene
  • the DNA molecule as the expression vector according to the present invention includes a DNA sequence required for expression of the mutant gene, for example, a transcription control signal such as a promoter, a transcription initiation signal, a ribosome binding site, a translation termination signal, and a transcription termination signal; It preferably has a translation control signal and the like.
  • a transcription control signal such as a promoter, a transcription initiation signal, a ribosome binding site, a translation termination signal, and a transcription termination signal; It preferably has a translation control signal and the like.
  • promoter not only a promoter that can function in a host contained in the inserted fragment, but also a promoter such as ratatosupoperon (lac) and tryptophan operon (trp) in Escherichia coli, and an alcohol dehydrogenase in yeast Promoters such as the gene (ADH), acid phosphatase gene (PHO), galactose gene (GAL) and dali cellaldehyde triphosphate dehydrogenase gene (GPD); ) Can be preferably used.
  • ADH gene
  • PHO acid phosphatase gene
  • GAL galactose gene
  • GPD dali cellaldehyde triphosphate dehydrogenase gene
  • any host can be used as long as a host vector system has been established, and preferably, mold and yeast are used.
  • the transformant obtained by the transformation of the host cell is cultured under appropriate conditions, and the resulting culture broth is subjected to fractionation and purification of the enzyme by a common method to obtain j8-fructofuranofurano.
  • a sidase variant can be obtained.
  • the host is Bacillus subtilis, yeast, or mold, it is also advantageous to use a secretory vector to secrete the recombinant j8-fructofuranosidase outside the cells.
  • the mutant according to the present invention produced from the transformant can be obtained as follows.
  • the First the above-mentioned host cells are cultured under appropriate conditions, and a culture supernatant or cells are obtained from the resulting culture by a known method, for example, centrifugation. In the case of cells, this is suspended in an appropriate buffer, the cells are disrupted by freeze-thawing, sonication, grinding, etc., and the cell extract containing the recombinant enzyme is centrifuged or filtered. obtain.
  • the enzyme can be purified by appropriately combining conventional separation and purification methods. For example, methods utilizing differences in heat resistance such as heat treatment, methods utilizing differences in solubility such as salt precipitation and solvent precipitation, and methods such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration and SDS polyacrylamide gel electrophoresis. Methods that use different molecular weights, methods that use charge differences such as ion-exchange chromatography, methods that use specific affinities such as affinity chromatography, hydrophobic chromatography, and reverse-phase chromatography. Examples of the method include a method using the difference in hydrophobicity as described above, and a method using a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing.
  • the present invention there is provided a method for producing a fura-oligosaccharide using the transformant according to the present invention or the ⁇ -fructofuranosidase mutant according to the present invention. That is, the method for producing a fratatooligosaccharide according to the present invention is carried out by contacting the transformant according to the present invention or the
  • the mode of contacting the transformant according to the present invention or the ⁇ -fructofuranosidase mutant according to the present invention with sucrose and the conditions thereof are not particularly limited as long as the mutant can act on sucrose.
  • Preferred embodiments for contacting in a solution are as follows. That is, the concentration of sucrose to be used may be appropriately selected in consideration of the specific activity of the enzyme, the reaction temperature, etc., as long as the used sugar can be dissolved, but should be in the range of 5-80%. It is common and preferably in the range of 30-70%.
  • the reaction temperature and ⁇ conditions for the reaction between the sugar and the enzyme are preferably performed under the optimal conditions for the mutant, for example, generally at about 30-80 ° C and pH 4-10. And preferably 40-70. C, pH5-7.
  • the degree of purification of the mutant can be appropriately selected, and the culture supernatant of the transformant or the cell crushing ability can be used as it is as the crude enzyme.
  • the crude enzyme Was It may be used as a purified enzyme.
  • the enzyme may be used as an enzyme isolated and purified through various purification means.
  • the enzyme may be contacted with sucrose in a state of being immobilized on a carrier according to a conventional method.
  • the produced fratatooligosaccharide can be obtained by purifying the reaction solution according to a known method. For example, there is a method in which the enzyme is deactivated by heating, then decolorized with activated carbon, and further desalted with an ion exchange resin.
  • the present invention provides a method for selectively producing 1-kestose. That is, according to the present invention, a transformant capable of expressing the
  • the mutant of the second embodiment of the present invention is used for the preparation of a fratatooligosaccharide, the amount of nystose produced increases and the amount of 1-kestose produced is suppressed. Therefore, according to the present invention, there is provided a method for selectively producing a steel. That is, according to the present invention, a transformant capable of expressing the polynucleotide encoding the
  • the random mutation was introduced into the j8-fructofuranosidase gene using a commercially available PCR muta genesis kit (Gene Morph, Stratagene) as follows.
  • the j8-fructofuranosidase gene derived from ATCC 20611 strain G ⁇ nkgE) was used as type I DNA.
  • the plasmid pAW20-Hyg described in WO97 / 34004 was used.
  • the PCR reaction solution consisted of 5 ⁇ l of 1 ⁇ 1, 40 mM dNTP 1 ⁇ 1, 10-fold concentration buffer
  • 5 -GCGAATTCATGAAGCTCACCACTACCA-3, (N-terminal) (SEQ ID NO: 7) and 5'-GCGGATCCCGGTCAATTTCTCT-3 '(C-terminal) (SEQ ID NO: 8) DMSO 51 and sterilized water 36 ⁇ l were calored to obtain 501.
  • the reaction was pretreated at 94 ° C for 2 minutes, followed by incubation at 94 ° C for 1 minute (denaturation step), 50 ° C for 2 minutes (annealing step), 72 ° C for 2.5 minutes (extension step). 30 cycles were performed.
  • the obtained transformant was placed in SD-GF medium (0.67% yeast nitrogen base w / o amino acids ⁇ 2% sucrose 1 ⁇ ⁇ s, 2% casamino acids ⁇ 50 ⁇ g / ml ⁇ lacil) at 30 ° C. After culturing for 3 days, a j8-fructofuranosidase mutant was obtained.
  • the DNA base sequence was analyzed.
  • a sequencing reaction was performed using a DNA sequence kit manufactured by Pharmacia.
  • the sample after the reaction was analyzed using a DNA sequencer (ALFred) of Pharmacia to obtain the nucleotide sequence of each DNA fragment.
  • the final nucleotide sequence was obtained using DNA analysis software (DNASIS, Hitachi Software Engineering Co., Ltd.), and the mutation point into which the random mutation was introduced was determined.
  • Table 2 Fructofuranosidase mutants with increased nystose production and reduced 1-kestose production
  • G F 4 1-Funolecto sinorenistose The resulting mutations and the corresponding DNA sequences were as follows. Underline indicates mutated DNA.
  • V165F obtained in Example 2 with G300V and H313K described in WO97Z34004
  • the combined triple substitution mutant was prepared by site-directed mutagenesis. Specifically, a plasmid was prepared by inserting the ⁇ -fructofuranosidase gene into which the mutation of V165F prepared in Examples 1 and 2 was introduced into the EcoRI-BamHI site of pUC118 (Takara Shuzo). Next, mutations of G300V and H313K were sequentially introduced in the same manner as in Example D8 of WO97 / 34004. As a result of examining the DNA base sequence in the same manner as in Example 2, it was confirmed that only the target base sequence was replaced.

Abstract

　本発明は、フラクトオリゴ糖の製造に適するように反応特性が改善されたβ−フルクトフラノシダーゼ変異体の提供を目的とする。本発明によれば、特定のアミノ酸残基において変異を有する配列番号２に記載のアミノ酸配列またはその相同体からなる、β−フルクトフラノシダーゼ変異体が提供される。

Description

明 細 書
β一フルクトフラノシダーゼ変異体
発明の分野
[0001] 本発明は、ショ糖から特定のフラタトオリゴ糖を選択的かつ効率的に生成する βーフ ルクトフラノシダーゼ変異体に関し、より詳細には、 1ーケストースを効率的に生産する β フルクトフラノシダーゼ変異体およびニストースを効率的に生産する j8—フルクト フラノシダーゼ変異体に関する。
背景技術
[0002] 一般にフラタトオリゴ糖は、ショ糖のフルクトースに 1から 3分子のフルクトースが C1と C2の位置で |8結合しているオリゴ糖であり、難消化性の糖質で、腸内のビフィズス菌 増殖促進作用、コレステロールなどの脂質代謝改善作用、難う蝕性、ミネラル吸収促 進作用などの優れた生理機能を有することが見出されている。フラタトオリゴ糖は、天 然には広く植物に分布しており、例えばタマネギ、アスパラガス、キクイモなどに含ま れていることが知られている力 最近では、微生物由来の j8—フルクトフラノシダーゼ の転移反応を利用してショ糖から大量に製造する技術が確立され、工業的に生産さ れている。現在フラタトオリゴ糖の工業的生産に利用されている j8—フルクトフラノシダ ーゼは、ァスペルギルス' -ガー (Aspergillus niger)由来の菌体内 j8—フルクトフラノ シダーゼを J用している。
[0003] 当該 13 フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子は、 WO97Z34004号公報に 開示されている。し力し、当該 j8—フルクトフラノシダーゼは、 1ーケストース、ニストース 、 1 フルクトシルニストースの混合物としてフラタトオリゴ糖を生成するため、フラクトォ リゴ糖はオリゴ糖混合物のシロップあるいは粉末として製造、提供されている。単一成 分として、 1ーケストースあるいはニストースを選択的かつ効率的に生産する j8—フルク トフラノシダーゼが得られれば、次のような有用性が存在する。すなわち、 1ーケスト一 スあるいは-スト一スを高純度に精製し、結晶化させることによって、フラタトオリゴ糖 の生理機能を保持したまま、物性および加工特性上優れた特性を有する単一成分 の結晶フラタトオリゴ糖を製造することが可能となる。 [0004] 一方、ショ糖を原料とした結晶 1ーケストースの工業的製造法は、例えば、 W097/ 21718号公報に開示されている。すなわち、 j8 -フルクトフラノシダーゼをショ糖に作 用させて 1ーケストースに生成させ、クロマト分離法により 1ーケストースを純度 80%以 上に生成した後、これを結晶化原液として純度 95%以上の結晶 1ーケストースを得る 方法である。この方法に用いられる酵素の特性として、ショ糖から 1ーケストースへの 変換率が高 、こと、ニストースの生成量が低 、ことが工業的製造法にぉ 、て求められ ている。また同様に-ストースを単一成分として製造する場合には、ニストースへの変 換率が高!、こと、 1 フルクトシルニストースの生成量が低 、ことが工業的製造法にお いて求められている。
発明の概要
[0005] 本発明は、フラタトオリゴ糖の単一成分、例えば 1ーケストースあるいは-ストースの 製造に適するように反応特性が改善された j8—フルクトフラノシダーゼ変異体および その遺伝子の提供をその目的とする。
[0006] 本発明者らは、配列番号 2のアミノ酸配列中の特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ 酸残基に置換した j8—フルクトフラノシダーゼ変異体力 1ーケストースある 、は-スト ースの製造に適する反応特性を有していることを見出した。
[0007] すなわち本発明の第一の態様によれば、（a) 62番、 122番、 128番、 165番、 221 番、 395番、および 550番のアミノ酸残基において少なくとも 1つの変異を有する、配 列番号 2に記載のアミノ酸配列；または（b)配列番号 2の 62番、 122番、 128番、 165 番、 221番、 395番、および 550番のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基において 少なくとも 1つの変異を有する、配列番号 2に記載のアミノ酸配列の相同体力もなる、 β フルクトフラノシダーゼ変異体が提供される。
[0008] 本発明の第二の態様によれば、（c) 40番、 379番、および 381番のアミノ酸残基に お!、て少なくとも 1つの変異を有する、配列番号 2に記載のアミノ酸配列；または（d) 配列番号 2の 40番、 379番、および 381番のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基に おいて少なくとも 1つの変異を有する、配列番号 2に記載のアミノ酸配列の相同体か らなる、 β -フルクトフラノシダーゼ変異体が提供される。
[0009] 本発明による β フルクトフラノシダーゼ変異体を用いれば、フラタトオリゴ糖を製造 する際の酵素反応液の糖組成を改善することが可能となり、フラタトオリゴ糖の単一成 分の効率的な製造が可能となる。すなわち、本発明による j8—フルクトフラノシダーゼ 変異体によれば、従来と比較して簡便に、かつ安価にフラタトオリゴ糖の単一成分の 工業的製造が可能となる点で有利である。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]図 1は、配列番号 2に記載のアミノ酸配列およびその相同体を整列させた例を 示した図である。上段は A ikgE由来の J8—フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配 列番号 2)、中段は S. brevicaulis由来の β フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配 列番号 6)、下段は P. roaueforiti由来の β フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配 列番号 4)を表す。図中の数字は A^JlkgEの Ν末端を 1番目としたときのアミノ酸番号 を表す。枠で示した部分は、特定変異部分を表す。
[図 2]図 2は、図 1のアミノ酸配列の続きである。
発明の具体的説明
[0011] フルクトフラノシダーゼ変異体およびその遣伝子
本発明による第一および第二の態様による変異体は、配列番号 2に記載のアミノ酸 配列およびその相同体の特定のアミノ酸残基の少なくとも 1つに変異が導入されてな るものである。
[0012] 変異が導入されるアミノ酸残基の位置は、配列番号 2のアミノ酸配列のアミノ酸残基 番号と対応する。
[0013] 本発明にお 、て「変異」とは、置換、欠失、および挿入を意味する。
[0014] 「置換」とは、特定のアミノ酸残基が取り除かれ、かつ他のアミノ酸残基が同じ位置 に挿入されていることをいう。
[0015] 「欠失」とは、特定のアミノ酸残基が取り除かれていることを意味する。
[0016] 「挿入」とは、特定のアミノ酸残基の前にある!/、は後ろに、 1個または複数個のァミノ 酸残基が挿入されていることをいい、具体的には、特定のアミノ酸残基の a カルボ キシル基あるいは a アミノ基に、 1個または複数個、好ましくは、 1個ないし数個、の アミノ酸残基が結合することを 、う。
[0017] 配列番号 2に記載のアミノ酸配列およびその相同体に導入される特定変異の数は 特に限定されないが、 1個ないし数個、 1個ないし 3個、あるいは 1または 2個であるこ とがでさる。
[0018] 本発明の第一および第二の態様による変異体において、配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列およびその相同体に導入される変異は、好ましくは、置換である。
[0019] 本発明の第一の態様による変異体において、配列番号 2に記載のアミノ酸配列お よびその相同体の 62番、 122番、 128番、 165番、 221番、 395番、および 550番の アミノ酸残基に導入される置換は、好ましくは、下記の通りである。
[0020] 62番のアミノ酸残基の、ァスパラギン酸およびグルタミン酸力 なる群力 選択され る酸性アミノ酸、特にグルタミン酸、への置換。
[0021] 122番のアミノ酸残基の、メチォニン、イソロイシン、ロイシン、およびパリンからなる 群力も選択されるアミノ酸、特にメチォニン、への置換。
[0022] 128番のアミノ酸残基の、ァスパラギンおよびグルタミン力もなる群力も選択されるァ ミノ酸、特にァスパラギン、への置換。
[0023] 165番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フエ-ルァラニン、およびチロシンからなる 群から選択される芳香族アミノ酸、特にフエ二ルァラニン、への置換。
[0024] 221番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フエ-ルァラニン、およびチロシンからなる 群から選択される芳香族アミノ酸、特にチロシン、への置換。
[0025] 395番のアミノ酸残基の、ロイシン、メチォニン、イソロイシン、およびパリンからなる 群力 選択されるアミノ酸、特にロイシン、への置換。
[0026] 550番のアミノ酸残基の、セリンおよびスレオニン力 なる群力 選択されるヒドロキ シアミノ酸、特にセリン、への置換。
[0027] 本発明の第一の態様による変異体においては、配列番号 2に記載のアミノ酸配列 およびその相同体の、 170番、 300番、 313番、および 386番の少なくとも 1つのアミ ノ酸残基において、更に変異、好ましくは、置換、を有していてもよい。これらの変異 を有する j8—フルクトフラノシダーゼは、 1ーケストースを選択的にかつ効率的に生産 できる点で有利である（例えば、 WO99Z13059号公報参照）。
[0028] 本発明の第一の態様による変異体において、配列番号 2に記載のアミノ酸配列お よびその相同体の 170番、 300番、 313番、および 386番に導入することができる置 換は、好ましくは、下記の通りである。
[0029] 170番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フエ-ルァラニン、およびチロシンからなる 群から選択される芳香族アミノ酸、特にトリブトファン、への置換。
[0030] 300番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フエ-ルァラニン、チロシンおよびパリンか らなる群力 選択されるアミノ酸、特にパリン、への置換。
[0031] 313番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択 される塩基性アミノ酸、特にリジンまたはアルギニン、への置換。
[0032] 386番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択 される塩基性アミノ酸、特にリジン、への置換。
[0033] 本発明の第一の態様による変異体において、配列番号 2に記載のアミノ酸配列お よびその相同体に導入することができる好ましい多重変異としては、 165番のアミノ酸 残基と、 300番のアミノ酸残基と、 313番のアミノ酸残基の三重変異、より好ましくは 三重置換、が挙げられ、特に好ましくは、 165番のアミノ酸残基の、トリブトファン、フエ 二ルァラニン、およびチロシン力 なる群力 選択される芳香族アミノ酸への置換 (最 も好ましくはフエ-ルァラニンへの置換）と、 300番のアミノ酸残基の、トリプトファン、 フエ-ルァラニン、チロシンおよびバリンカ なる群力 選択されるアミノ酸への置換（ 最も好ましくはノ《リンへの置換)と、および 313番のアミノ酸残基の、リジン、アルギ- ン、およびヒスチジン力もなる群力も選択される塩基性アミノ酸への置換 (最も好ましく はリジンまたはアルギニンへの置換）と力もなる三重置換が挙げられる。
[0034] 本発明の第二の態様による変異体において、配列番号 2に記載のアミノ酸配列お よびその相同体の 40番、 379番、および 381番のアミノ酸残基に導入される置換は、 好ましくは、下記の通りである。
[0035] 40番のアミノ酸残基の、ァスパラギン酸およびグルタミン酸力 なる群力 選択され る酸性アミノ酸、特にァスパラギン酸、への置換。
[0036] 379番のアミノ酸残基の、システィンへの置換。
[0037] 381番のアミノ酸残基の、メチォニン、イソロイシン、ロイシン、およびパリンからなる 群力も選択されるアミノ酸、特にメチォニン、への置換。
[0038] 本発明による第一および第二の態様による変異体において、「相同体」とは、 1個ま たは複数個の変異を有する配列番号 2に記載のアミノ酸配列であって、 β フルクト フラノシダーゼ活性を有するもの、を意味する。変異の数は、 1個ないし数個、あるい は 1、 2、 3、または 4個であることができる。
[0039] 本発明にお 、て、相同体が /3 フルクトフラノシダーゼ活性を有する力否かは、例 えば、そのアミノ酸配列力 なるタンパク質を基質に作用させ、反応産物を検出する ことにより評価することができ、例えば、実施例 2に記載の方法に従って評価すること ができる。
[0040] 相同体における本発明による特定変異の位置は、配列番号 2のアミノ酸配列と当該 相同体とを整列し、相同体に対応する配列番号 2のアミノ酸残基番号を基に決定す る。例えば、相同体における「62番のアミノ酸残基の変異」とは、その相同体の 62番 のアミノ酸残基の変異ではなぐ配列番号 2のアミノ酸配列の 62番のアミノ酸残基に 対応する相同体のアミノ酸残基の変異を意味する。配列番号 2のアミノ酸配列とその 相同体を整列させた例は図 1および図 2に示されている。
[0041] 配列番号 2のアミノ酸配列と当該相同体との整列は、配列同一性を調べるための分 析用ソフトウェアを用いて行うことができる。このようなソフトウェアは周知であり、当業 者であれば適宜選択して使用することができることは言うまでもない。例えば、 BLAS Τ法 (Basic local alignment search tool; Altschul, S. . et al.,
J.Mol.Biol.,215,403-410(1990))を使用して配列番号 2のアミノ酸配列と当該相同体と を整列させて、対応するアミノ酸残基を決定することができる。
[0042] 相同体の例としては、 1個または複数個（例えば、 1個ないし数個あるいは 1、 2、 3、 または 4個）の /3 フルクトフラノシダーゼ活性に影響を与えない変異を有する配列番 号 2に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
[0043] ここで「活性に影響を与えない変異」の例としては、保存的置換が挙げられる。「保 存的置換」とは、タンパク質の活性を実質的に改変しないように 1若しくは複数個のァ ミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例え ば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ 電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換 を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において 公知である。具体例を挙げると、非極性 (疎水性)アミノ酸としては、ァラニン、ノ《リン、 イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フエ-ルァラニン、メチォニンなどが挙 げられる。極性（中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、ダル タミン、ァスパラギン、システィンなどが挙げられる。陽電荷をもつ (塩基性)アミノ酸と しては、ァノレギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性） アミノ酸としては、ァスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
[0044] 「相同体」の例としては、また、 Aspergillus属、 Penicillium属および Scopulariopsis属 に属する微生物力 生産される j8—フルクトフラノシダーゼが挙げられ、例えば、 Aspergillus niger由来の βーフノレクトフラノシダ一で、 Penicillium roaueforti由来の β― フルクトフラノシダーゼ、 ScoDulariopsis brevicaulis由来の β フルクトフラノシダーゼ が挙げられる。 Penicillium roaueforti由来の j8—フルクトフラノシダーゼとしては W09 9Z13059号公報の配列番号 1のアミノ酸配列力もなるタンパク質 (配列番号 4)が挙 げられる。また、 ScoDulariopsis brevicaulis由来の j8—フルクトフラノシダーゼとしては WO99Z13059号公報の配列番号 3のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号 6 )が挙げられる。
[0045] 本発明によれば、本発明による /3 フルクトフラノシダーゼ変異体をコードする遺伝 子が提供される。
[0046] 一般に、タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする DNA配列は 、いわゆるコドン表を参照して容易に定まる。従って、本発明による特定変異が導入 された配列番号 1のアミノ酸配列およびその相同体、例えば、本発明による特定変異 が導入された配列番号 2、 4、および 6のアミノ酸配列、をコードする種々の DNA配列 を適宜選択することが可能である。よって、本発明による特定変異が導入された — フルクトフラノシダーゼ変異体をコードする DNA配列とは、本発明による特定アミノ酸 変異に対応する DNA変異を有する |8—フルクトフラノシダーゼ遺伝子のみならず、そ の縮重関係にあるコドンが使用されている以外は同一の DNA配列を有し、かつ β— フルクトフラノシダーゼ変異体をコードする DNA配列をも意味する。例えば、本発明 による特定変異が導入された配列番号 2、 4、および 6のアミノ酸配列をコードする D NA配列とは、後述する表 3に記載の 1以上の変異を有する配列番号 1、 3、および 5 の DNA配列のみならず、その縮重関係にあるコドンが使用されて 、る以外は同一の DNA配列を有し、かつ j8—フルクトフラノシダーゼ変異体をコードする DNA配列をも 意味する。
[0047] β フルクトフラノシダーゼ変異体の作製
ι8—フルクトフラノシダーゼ変異体は、組換え DNA技術、ポリペプチド合成技術な どによって作製することができる。組換え DNA技術を用いる場合には、 |8—フルクトフ ラノシダーゼをコードする DNA (例えば、配列番号 1、 3、または 5の DNA配列）を取 得し、この DNAに部位特異的変異ある 、はランダム変異を発生させてコードするアミ ノ酸を置換させた後、変異処理を施した DNAを含む発現ベクターで宿主細胞を形 質転換し、形質転換細胞を培養することによって β フルクトフラノシダーゼ変異体を 調製することができる。
[0048] 遺伝子の部位特異的変異を導入するための方法は、 Gapped duplex法や Kunkel法 など当業者に周知の方法を用いることができる。これらの方法は、 j8—フルクトフラノシ ダーゼをコードする DNAの特異的部位に突然変異を発生させることに利用すること ができる。
[0049] また、ランダム変異を導入するためには、エラーブローン PCR法など一般的に行わ れている方法が採用できる。変異処理後の DNAの塩基配列は、マキサム'ギルバー トの化学修飾法ゃジデォキシヌクレオチド鎖終結法などにより確認することができ、 β フルクトフラノシダーゼ変異体のアミノ酸配列は、確認された塩基配列より解読する ことができる。
[0050] β フルクトフラノシダーゼ変異体の生産
ι8—フルクトフラノシダーゼ変異体は、それをコードする DNA断片を、宿主細胞内 で複製可能でかつ同遺伝子を発現可能な状態で含む DNA分子、特に DNA発現 ベクター、に連結してなる組換えベクターを調製し、その組換えベクターを宿主に導 入して形質転換体を得て、その形質転換体を適当な培養条件下で培養することによ り、調製することができる。
[0051] 本発明において利用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案して、ウイ ルス、プラスミド、コスミドベクターなど力 適宜選択することができる。例えば、宿主細 胞が大腸菌の場合は pUC、 pBR系のプラスミド、枯草菌の場合は pUB系のプラスミ ド、酵母の場合は YEp、 YRp、 YCp系のプラスミドベクターが挙げられる。
[0052] 本発明の好ましい態様によれば、組換えベクターとしてプラスミドを使用することが できる。プラスミドは形質転換体の選択マーカーを含むのが好ましぐ選択マーカーと しては薬剤耐性マーカー、栄養要求マーカーを使用することができる。その好ましい 具体例としては、使用する宿主細胞が細菌の場合はアンピシリン耐性遺伝子、カナ マイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などであり、酵母の場合はトリプトフ アン合成遺伝子 (TRP1)、ゥラシル合成遺伝子 (URA3)、ロイシン合成遺伝子 (LE U2)などがあり、カビの場合はハイグロマイシン耐性遺伝子 (Hyg)、ビアラホス耐性 遺伝子 (Bar)、硝酸還元酵素遺伝子 (niaD)などが挙げられる。
[0053] 本発明による発現ベクターとしての DNA分子は、変異遺伝子の発現に必要な DN A配列、例えばプロモーター、転写開始信号、リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナ ル、転写終結シグナルなどの転写調節シグナル、翻訳調節シグナルなどを有してい るのが好ましい。
[0054] プロモーターとしては、挿入断片に含まれる宿主中において機能することができる プロモーターはもちろんのこと、大腸菌においてはラタトースォペロン (lac)、トリプトフ アンオペロン（trp)などのプロモーター、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝 子 (ADH)、酸性フォスファターゼ遺伝子 (PHO)、ガラクトース遺伝子 (GAL)、ダリ セロアルデヒド 3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（GPD)などのプロモーター、カビでは a アミラーゼ遺伝子（amy)、セロビオハイド口ラーゼ I遺伝子（CBHI)などのプロモ 一ターを好ましく用いることができる。
[0055] 宿主としては、宿主 ベクター系が確立されているものであればいずれも利用可能 であり、好ましくは、カビ、酵母が挙げられる。宿主細胞の形質転換により得られた形 質転換体は、適当な条件で培養し、得られた培養液カゝら一般的な方法によって酵素 の分取や精製を行うことにより j8—フルクトフラノシダーゼ変異体を得ることができる。 また、宿主が枯草菌、酵母、カビの場合には、分泌型ベクターを使用して、菌体外に 組換え j8 -フルクトフラノシダーゼを分泌させることも有利である。
[0056] 形質転換体から生産される本発明による変異体は、次のようにして得ることが出来 る。まず前記の宿主細胞を適切な条件下で培養し、得られた培養物から公知の方法 、例えば遠心分離により培養上清あるいは菌体を得る。菌体の場合にはこれを適切 な緩衝液中に懸濁し、凍結融解、超音波処理、磨砕などにより菌体を破砕し、遠心 分離またはろ過により組換え酵素を含有する菌体抽出物を得る。
[0057] 酵素の精製は、慣用されている分離、精製法を適宜組み合わせて実施することが できる。例えば、熱処理のような耐熱性の差を利用する方法、塩沈澱および溶媒沈 澱のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外ろ過、ゲルろ過および SDS ポリ アクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマト グラフィ一のような電荷の差を利用する方法、ァフィユティークロマトグラフィーのよう な特異的親和性を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーの ような疎水性の差を利用する方法、更に等電点電気泳動のような等電点の差を利用 する方法などが挙げられる。
[0058] フラクトオリゴ糖の観告
本発明によれば、本発明による形質転換体または本発明による β フルクトフラノシ ダーゼ変異体を用いた、フラ外オリゴ糖の製造法が提供される。すなわち、本発明 によるフラタトオリゴ糖の製造法は、本発明による形質転換体または本発明による |8— フルクトフラノシダーゼ変異体と、スクロースとを接触させることによって実施される。
[0059] 本発明による形質転換体または本発明による β フルクトフラノシダーゼ変異体と、 スクロースとの接触態様およびその条件は、変異体がスクロースに作用可能な様態 である限り特に限定されな ヽ。溶液中で接触させる場合の好ま ヽ態様を示せば次 の通りである。すなわち、スクロースの使用濃度は、用いる糖が溶解されうる範囲であ れば、本酵素の比活性、反応温度などを考慮して適宜選択してよいが、 5— 80%の 範囲とするのが一般的であり、好ましくは 30— 70%の範囲である。糖と酵素との反応 における反応温度および ρΗ条件は、変異体の最適条件下で行うことが好ましぐ例 えば、 30— 80°C程度、 pH4— 10程度の条件下で行うのが一般的であり、好ましくは 40— 70。C、 pH5— 7の範囲である。
[0060] また、変異体の精製の程度も適宜選択することができ、形質転換体の培養上清ある いは菌体破砕物力も粗酵素のまま用いることもでき、また、各種精製工程で得られた 精製酵素として利用してもよい。さらには各種精製手段を経て単離精製された酵素と して用いてもよい。
[0061] 更に酵素は、常法に準じて担体に固定化された状態でスクロースと接触させてもよ い。
[0062] 生成したフラタトオリゴ糖は、反応液を公知の方法に従い精製することにより得ること が出来る。例えば、加熱して酵素を失活させた後、活性炭により脱色し、さらに、ィォ ン交換樹脂で脱塩する方法が挙げられる。
[0063] 本発明の第一の態様の変異体をフラタトオリゴ糖の調製に用いると、 1—ケストース 生成量が増大し、ニストース生成量が抑制される。従って、本発明によれば 1ーケスト ースの選択的な製造法が提供される。すなわち本発明によれば、第一の態様の |8— フルクトフラノシダーゼ変異体あるいは第一の態様の j8—フルクトフラノシダーゼ変異 体をコードするポリヌクレオチドを発現可能な形質転換体と、スクロースを接触させる 工程を含んでなる、 1-ケストースの製造法が提供される。
[0064] 本発明の第二の態様の変異体をフラタトオリゴ糖の調製に用いると、ニストースの生 成量が増大し、 1ーケストース生成量が抑制される。従って、本発明によれば-スト一 スの選択的な製造法が提供される。すなわち本発明によれば、第二の態様の |8—フ ルクトフラノシダーゼ変異体あるいは第二の態様の j8—フルクトフラノシダーゼ変異体 をコードするポリヌクレオチドを発現可能な形質転換体と、スクロースを接触させるェ 程を含んでなる、ニストースの製造法が提供される。
実施例
[0065] 本発明を下記例により詳細に説明する力 本発明がこれらの例に限定されないこと は言うまでもない。
[0066] rnrnm -. s—フルクトフラノシダーゼ 虽体の作製
j8—フルクトフラノシダーゼ遺伝子へのランダム変異の導入は、市販の PCR muta genesis kit(Gene Morph, Stratagene社)を用いて以下のように行った。铸型 DNAと して、 ATCC20611株 G^ nkgE)由来の j8—フルクトフラノシダーゼ遺伝子を用いた 。具体的には、 WO97/34004に記載のプラスミド pAW20— Hygを使用した。 PCR 反応液は、铸型 DNA 1 ^ 1, 40mM dNTP 1 ^ 1, 10倍濃度の緩衝液 5 μ 1、プラ イマ一として 5，—GCGAATTCATGAAGCTCACCACTACCA—3，（N末）（配列 番号 7)および 5' - GCGGATCCCGGTCAATTTCTCT - 3' (C末）（配列番号 8) 250ng/mlを各 0. 5 1、 Mutazyme 1 1、 DMSO 5 1、滅菌水 36 μ 1をカロえて 5 0 1とした。反応は 94°C、 2分間の前処理後、 94°C、 1分間（変性ステップ）、 50°C、 2分間（アニーリングステップ）、 72°C、 2. 5分間（伸長ステップ）のインキュベーション を 30サイクル行った。最後に 72°C、 3分間のインキュベーションを行い反応を終了さ せた。反応液をフエノール'クロ口ホルム'イソアミルアルコールで抽出し、その後エタ ノール沈殿を行った。沈殿を TE緩衝液に溶解後、ァガロース電気泳動を行い、特異 的に増幅された 1. 9kbpのバンドを常法に従って切り出して DNA断片を回収した。 WO97Z34004に記載の方法で、 1. 9kbpの EcoRI— BamHI断片を pY2831の E coRI— BamHI部位に挿入したプラスミドを ^ cerevisiae MS— 161株に酢酸リチウム 法で導入し、形質転換体を得た。得られた形質転換体を SD - GF培地 (0. 67% yeast nitrogen base w/o amino acids ^ 2% スクロ1 ~~ス、 2% casamino acids ^ 50 ^ g /mlゥラシル)で 30°C、 3日間培養し、 j8 -フルクトフラノシダーゼ変異体を得た。
[0067] m2: —フルクトフラノシダーゼ 虽体の 特件の評
実施例 1で作製した j8—フルクトフラノシダーゼ変異体を用いてスクロースを基質と した酵素反応を基質濃度 48%、 pH7、 40°Cの反応条件で行い、反応液の糖組成を HPLC分析した。野生型 /3 フルクトフラノシダーゼの酵素反応液の糖組成と比較し て、糖組成が変動したものを反応特性が改変された β フルクトフラノシダーゼ変異 体とした。
[0068] 反応特性が改変された β フルクトフラノシダーゼ変異体の変異点を同定するため に、 DNA塩基配列を解析した。フアルマシア社の DNAシークェンスキットを用い、シ ークエンス反応を行った。反応後のサンプルは、フアルマシア社の DNAシークェン サー (ALFred)を用いて解析を行い、各 DN A断片の塩基配列を得た。その後、 DN A解析ソフト（DNASIS、 日立ソフトウェアエンジニアリング社）にて最終的な塩基配 列を得て、ランダム変異の導入された変異点を決定した。その結果、表 1および表 2 に示したように、 1ーケストースを効率的に生産する j8—フルクトフラノシダーゼ変異体 、およびニストースを効率的に生産する j8—フルクトフラノシダーゼ変異体が得られて いることが明ら力となった。
[表 1]
表 1 ： 1 -ケス トース生成量が増大し、 二ス ト一ス生成量が 抑制された β —フルク トフラノシダーゼ変異体
Figure imgf000015_0001
F ： フノレク トース
G ： グノレコース
G F ： スク ロース
G F 2 ： 1 —ケス トース
G F 3 ： ニス トース
G F 4 ： 1—フスレク トシノレニス トース
[表 2] 表 2 ： ニス トースの生成量が増大し、 1 ーケス トース生成量が 抑制された フルク トフラノ シダーゼ変異体
Figure imgf000016_0001
F ： フノレク トース
G ： グノレコース
G F ： スクロース
G F 2 ： 1ーケス ト—ス
G F 3 ： ニス トース
G F 4 ： 1—フノレク ト シノレニス トース 得られた変異とそれに対応する DNA配列は下記の通りであった。下線は変異した DNAを示す。
[表 3]
表 3 ： 変異部分のァミノ酸残基と DN A配列
G 6 2 E GAC GAG GA C
A s p G l u A s p (配列番号 9 )
L 1 2 2 M T T C A Τ G C C C
P h e Me t P r o (配列番号 1 0 )
I 1 2 8 N T C C A AC C C C
S e r A s n P r o (配列番号 1 1 )
V 1 6 5 F G C C T T C GAC
A l a P h e A s p (配列番号 1 2 )
H 2 2 1 Y GT G T A C G G C
V a 1 T y r G 1 y (配列番号 1 3 )
Q 3 9 5 L G C C CTG C A G
A 1 a L e u G i n (配列番号 1 4 )
T 5 5 0 S T T T T C G GAG
Ρ h e S e r G l u (配列番号 1 5 )
G 4 0 D A T C GAC GAC
l i e A s p A s p (配列番号 1 6 )
T 3 8 1 TTG A T G GG C
L e u M e t G 1 y (配列番号 1 7 )
W 3 7 9 C G T C TG C T TG
V a 1 C y s L e u (配列番号 1 8 ) 施例 3: β位指定 による 重置橼体の調靱 特件の評俪
実施例 2で得られた V165Fと WO97Z34004に記載の G300Vと H313Kを組み 合わせた 3重置換変異体を部位特異的変異導入により調製した。具体的には、実施 例 1および 2で調製した V165Fの変異が導入された β フルクトフラノシダーゼ遺伝 子を pUCl 18 (宝酒造)の EcoRI— BamHI部位に挿入したプラスミドを調製した。次 いで、 WO97/34004号公報の実施例 D8と同様の方法で G300Vと H313Kの変異 を順次導入した。実施例 2と同じ方法で DNA塩基配列を調べた結果、 目的の部分 の塩基配列のみが置換されて 、ることを確認した。
3重置換体 V165F + G300V+H313Kの反応特性を実施例 2の方法に従って調 ベた結果は表 3に記載される通りであった。野生型 /3 フルクトフラノシダーゼと比較 すると、 1ーケスト一スの糖組成0 /0は約 10%増大し、ニストースの生成量は 7%減少し た。
[表 4]
表 4 ： 三重置換体の反応特性
Figure imgf000018_0001
F ： フノレク トース
G ： グノレコース
G F ： スク ロース
G F 2 ： 1 —ケス トース
G F 3 ： ニス トース
G F 4 ： 1 ーフノレク トシノレニス トース

Claims

請求の範囲
[1] 下記アミノ酸配列力もなる、 j8—フルクトフラノシダーゼ変異体：
(a) 62番、 122番、 128番、 165番、 221番、 395番、および 550番のアミノ酸残基に お!、て少なくとも 1つの変異を有する、配列番号 2に記載のアミノ酸配列；または
(b)配列番号 2の 62番、 122番、 128番、 165番、 221番、 395番、および 550番の アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基において少なくとも 1つの変異を有する、配列番 号 2に記載のアミノ酸配列の相同体。
[2] 変異が、置換である、請求項 1に記載の変異体。
[3] 置換が、
62番のアミノ酸残基の、ァスパラギン酸およびグルタミン酸力 なる群力 選択され る酸性アミノ酸への置換、
122番のアミノ酸残基の、メチォニン、イソロイシン、ロイシン、およびパリンからなる 群から選択されるアミノ酸への置換、
128番のアミノ酸残基の、ァスパラギンおよびグルタミン力もなる群力も選択されるァ ミノ酸への置換、
165番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フエ-ルァラニン、およびチロシンからなる 群から選択される芳香族アミノ酸への置換、
221番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フエ-ルァラニン、およびチロシンからなる 群から選択される芳香族アミノ酸への置換、
395番のアミノ酸残基の、ロイシン、メチォニン、イソロイシン、およびパリンからなる 群から選択されるアミノ酸への置換、および
550番のアミノ酸残基の、セリンおよびスレオニン力もなる群力 選択されるヒドロキ シアミノ酸への置換
である、請求項 2に記載の変異体。
[4] 配列番号 2に記載のアミノ酸配列およびその相同体の、 170番、 300番、 313番、 および 386番の少なくとも 1つのアミノ酸残基において、更に変異を有する、請求項 1 一 3のいずれか一項に記載の変異体。
[5] 変異が置換である、請求項 4に記載の変異体。
[6] 置換が、
170番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フエ-ルァラニン、およびチロシンからなる 群から選択される芳香族アミノ酸への置換、
300番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フエ-ルァラニン、チロシンおよびパリンか らなる群から選択されるアミノ酸への置換、
313番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択 される塩基性アミノ酸への置換、および
386番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択 される塩基性アミノ酸への置換
である、請求項 5に記載の変異体。
[7] 165番、 300番および 313番のアミノ酸残基において変異を有する、請求項 4一 6 の！、ずれか一項に記載の変異体。
[8] 変異が置換である、請求項 7に記載の変異体。
[9] 置換が、
165番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フエ-ルァラニン、およびチロシンからなる 群から選択される芳香族アミノ酸への置換、
300番のアミノ酸残基の、トリプトファン、フエ-ルァラニン、チロシンおよびパリンか らなる群から選択されるアミノ酸への置換、
313番のアミノ酸残基の、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択 される塩基性アミノ酸への置換
である、請求項 8に記載の変異体。
[10] 下記アミノ酸配列力もなる、 j8—フルクトフラノシダーゼ変異体：
(c) 40番、 379番、および 381番のアミノ酸残基において少なくとも 1つの変異を有 する、配列番号 2に記載のアミノ酸配列；または
(d)配列番号 2の 40番、 379番、および 381番のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残 基において少なくとも 1つの変異を有する、配列番号 2に記載のアミノ酸配列の相同 体。
[11] 変異が、置換である、請求項 10に記載の変異体。
[12] 置換が、
40番のアミノ酸残基の、ァスパラギン酸およびグルタミン酸力 なる群力 選択され る酸性アミノ酸への置換、
379番のアミノ酸残基の、システィンへの置換、および
381番のアミノ酸残基の、メチォニン、イソロイシン、ロイシン、およびパリンからなる 群から選択されるアミノ酸への置換
である、請求項 11に記載の変異体。
[13] 請求項 1一 12のいずれか一項に記載の β フルクトフラノシダーゼ変異体をコード する、ポリヌクレオチド。
[14] 請求項 13に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、組換えベクター。
[15] 請求項 14に記載の組換えベクターを含んでなる、形質転換体。
[16] 請求項 15に記載の形質転換体または請求項 1一 12のいずれか一項に記載の β フルクトフラノシダーゼ変異体とスクロースを接触させる工程を含んでなる、フラクトォ リゴ糖の製造法。
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