JP2016034273A - 改良型β−フルクトフラノシダーゼ - Google Patents

Abstract

【課題】糖アルコールの製造及びフラクトオリゴ糖高純度液の製造のために、スクロースを特異的に分解できる改良型β−フルクトフラノシダーゼの提供。【解決手段】下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなる良型β−フルクトフラノシダーゼ。（ａ）野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスクロース分解活性を有するアミノ酸配列。【選択図】なし

Description

本発明は、改良型β−フルクトフラノシダーゼに関し、特に、スクロースを特異的に分解することができる改良型β−フルクトフラノシダーゼ、そのアミノ酸配列を含むポリペプチド、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組換えベクター、当該ＤＮＡまたは当該組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体ならびにそれらを用いた糖アルコールの製造方法およびフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法に関する。

β−フルクトフラノシダーゼは、末端にフルクトース残基を含む糖質のフルクトースを認識して、加水分解する酵素である。β−フルクトフラノシダーゼの中には、加水分解活性に加えて、加水分解によって生じたフルクトースを基質に転移させるフルクトース転移活性を有するものも存在する。従来、係る加水分解活性とフルクトース転移活性とを有するβ−フルクトフラノシダーゼをスクロースに作用させることにより、工業的にフラクトオリゴ糖が製造されている（特許文献１）。

特開２０１３−２５２０５６号公報

スクロースを基質とし、β−フルクトフラノシダーゼを用いてフラクトオリゴ糖を製造する際には、副生成物としてグルコースおよびフルクトースが生成するほか、基質であるスクロースも反応液中に残存する。これらの不純物はクロマトグラフィーによりフラクトオリゴ糖と分離して除去されるが、このうち、スクロースは２糖であるため、単糖であるグルコースやフルクトースと比較して、フラクトオリゴ糖との分離が困難である。

この点、スクロースを特異的に単糖に分解することができれば、クロマトグラフィーによるフラクトオリゴ糖の分離精製の効率を大きく向上させることができるため、フラクトオリゴ糖は分解せずに、専らスクロースを分解する酵素が求められている。本発明は、このような課題を解決するためになされたものであって、フラクトオリゴ糖をほとんど分解せず、スクロースを特異的に分解することができる改良型β−フルクトフラノシダーゼ、そのアミノ酸配列を含むポリペプチド、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組換えベクター、当該ＤＮＡまたは当該組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体ならびにそれらを用いた糖アルコールの製造方法およびフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意研究の結果、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ ＮＢＲＣ３２５５の野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、フラクトオリゴ糖の生成および分解を抑制して、スクロースを特異的に分解できることを見出した。また、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ ＮＢＲＣ３２５５の野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）に置換するアミノ酸変異と、Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異とを導入することにより、フラクトオリゴ糖の生成および分解を抑制して、スクロースを特異的に分解できることを見出した。そこで、これらの知見に基づいて、下記の各発明を完成した。

（１）本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼの一態様は、下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる；（ａ）配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスクロース分解活性を有するアミノ酸配列。

（２）本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼのもう一つの態様は、下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列からなる；（ｃ）配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、以下のｉ）およびｉｉ）のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列；ｉ）Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）に置換するアミノ酸変異、ｉｉ）Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異、（ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスクロース分解活性を有するアミノ酸配列。

（３）本発明に係るポリペプチドは、（１）または（２）に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含む。

（４）本発明に係るＤＮＡは、（１）または（２）に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードする。

（５）本発明に係る組換えベクターは、（４）に記載のＤＮＡを含む。

（６）本発明に係る形質転換体は、（４）に記載のＤＮＡまたは（５）に記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる、形質転換体である。

（７）本発明に係る糖アルコールの製造方法は、（１）もしくは（２）に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼ、（６）に記載の形質転換体または（６）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させて、前記スクロースを単糖に分解する工程を有する。

（８）本発明に係るフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法は、（１）もしくは（２）に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼ、（６）に記載の形質転換体または（６）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物とフラクトオリゴ糖溶液に含有されるスクロースとを接触させて、前記スクロースを単糖に分解する工程を有する。

本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼによれば、フラクトオリゴ糖をほとんど分解せず、スクロースを特異的に分解することができる。よって、これを用いて、スクロースを含むフラクトオリゴ糖溶液からの、クロマトグラフィーによるフラクトオリゴ糖の分離精製効率を向上させることができる。すなわち、これを用いて、フラクトオリゴ糖の高純度液を製造することができる。また、これを用いて、スクロースから糖アルコールを効率的に製造することができる。

また、本発明に係るポリペプチドや本発明に係るＤＮＡ、本発明に係る組換えベクター、本発明に係る形質転換体によれば、スクロースを特異的に分解することができる改良型β−フルクトフラノシダーゼを得ることができる。

以下、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体ならびにそれらを用いた糖アルコールの製造方法およびフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法について詳細に説明する。

本発明において、「β−フルクトフラノシダーゼ」は、「フルクトシルトランスフェラーゼ」、「サッカラーゼ」、「β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ」、「インベルターゼ」、「インバーターゼ」または「インベルチン」と交換可能に用いられる場合がある。また、本発明における「野生型β−フルクトフラノシダーゼ」とは、遺伝子工学の手法を用いてアミノ酸変異を導入していないアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼをいい、「改良型β−フルクトフラノシダーゼ」とは、野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、１または２以上のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼをいう。

本発明において、「改良型β−フルクトフラノシダーゼがスクロースを特異的に分解する」とは、β−フルクトフラノシダーゼが有する「末端にフルクトース残基を含む糖質に対する加水分解活性」および「フルクトース転移活性」のうち、「スクロースに対する加水分解活性」が主となっている状態をいう。すなわち、「スクロースに対する加水分解活性」のみを呈する場合のほか、「スクロースに対する加水分解活性」を主としつつ「スクロース以外の末端にフルクトース残基を含む糖質に対する加水分解活性」や「フルクトース転移活性」をも呈する場合も含まれる。

本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼの一態様は、下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる；
（ａ）配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、Ｎ末端（アミノ末端）から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスクロース分解活性を有するアミノ酸配列。

また、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼのもう一つの態様は、下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列からなる；
（ｃ）配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、以下のｉ）およびｉｉ）のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列；
ｉ）Ｎ末端（アミノ末端）から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）に置換するアミノ酸変異、
ｉｉ）Ｎ末端（アミノ末端）から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異、
（ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスクロース分解活性を有するアミノ酸配列。

本発明において、「配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列」は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ ＮＢＲＣ３２５５の野生型β−フルクトフラノシダーゼ（以下、「Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼ」と略記する。）のアミノ酸配列を指す。

本発明において、「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、１〜３０個、１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、よりさらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を意味する。

本発明において、あるタンパク質がスクロース分解活性を有するか否かは、常法に従い確認することができ、例えば、後述する実施例２（１）に示すように、当該タンパク質をスクロースを含む反応液中でインキュベートし、または当該タンパク質を発現させた形質転換体をスクロースを含む反応液中で振盪した後、その反応液の含有物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などにより確認する。その結果、グルコースやフルクトースなどのスクロースの加水分解により生じた物質の存在が確認されれば、当該タンパク質はスクロース分解活性を有すると判断することができる。

本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼは常法に従って得ることができ、そのような方法としては、例えば、化学合成する方法や、遺伝子組換え技術による方法を挙げることができる。化学合成する方法としては、例えば、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列情報に基づいて、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などにより合成する方法の他、各種の市販のペプチド合成機を利用して合成する方法を挙げることができる。

また、遺伝子組換え技術による方法としては、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼを好適な発現系にて発現させる方法を挙げることができる。すなわち、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを適当な宿主に導入して形質転換体を得る。あるいは、後述する実施例１に示すように、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを、適当なベクターに挿入して組換えベクターを得た後、その組換えベクターを適当な宿主に導入して形質転換体を得る。そして、得られた形質転換体を培養して改良型β−フルクトフラノシダーゼを発現させることにより、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼを得ることができる。

ここで、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡは、その塩基酸配列情報に基づいて、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて合成することができるほか、野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡや改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行うことにより得ることができる。

例えば、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを得る場合は、後述する実施例１に示すように、まず、導入するアミノ酸変異をコードするＤＮＡプライマーを設計し、そのＤＮＡプライマーを用いて、野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより得ることができる。

上記（ｂ）または（ｄ）の、「アミノ酸配列（ａ）または（ｃ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列」からなる改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡもまた、ＰＣＲにより得ることができる。すなわち、まず、アミノ酸配列（ａ）または（ｃ）において、アミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加された箇所に相当するアミノ酸配列をコードするＤＮＡプライマーを設計し、次に、そのＤＮＡプライマーを用いて、アミノ酸配列（ａ）または（ｃ）をコードするＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより得ることができる。

次に、本発明は、改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。なお、本発明に係るポリペプチドにおいて、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。

本発明に係るポリペプチドは、改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含む限り、その配列長は特に限定されず、改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のみからなるものでもよく、改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端（カルボキシル末端）に、１もしくは複数個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるものでもよい。また、本発明に係るポリペプチドは、上述した改良型β−フルクトフラノシダーゼを得る方法と同様の方法により得ることができる。

次に、本発明は、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを提供する。本発明に係るＤＮＡにおいて、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼおよびポリペプチドと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。

また、本発明は、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。なお、本発明に係る組換えベクターにおいて、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチドおよびＤＮＡと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。

本発明に係る組換えベクターは、例えば、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡをベクターに挿入することにより得ることができる。ＤＮＡのベクターへの挿入は、常法に従って行うことができ、例えば、ＤＮＡと線状化したベクターのＤＮＡ断片とをライゲーションすることにより行うことができる。ここで、ベクターとしては、例えば、ファージベクターやプラスミドベクター、コスミド、ファージミドなどを挙げることができ、宿主や操作性などに応じて適宜選択することができる。また、本発明に係る組換えベクターは、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡのほかに、薬剤耐性マーカー遺伝子や栄養要求マーカー遺伝子などの形質転換体の選択マーカー遺伝子、改良型β−フルクトフラノシダーゼの発現に必要なプロモーター、転写開始信号、リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号などの転写調節信号や翻訳調節信号などを含むものであってもよい。

また、本発明は、形質転換体も提供する。なお、本発明に係る形質転換体において、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡおよび組換えベクターと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。

本発明に係る形質転換体は、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡまたは当該ＤＮＡを含む組換えベクターを宿主に導入して得られる。ここで、宿主としては、例えば、大腸菌や枯草菌などの細菌、酵母、カビ、糸状菌などを挙げることができ、組換えベクターの種類や操作性などに応じて適宜選択することができる。ＤＮＡや組換えベクターの宿主への導入（形質転換）は常法に従って行うことができ、例えば、プラスミドを用いた組換えベクターを大腸菌に導入する場合であれば、大腸菌のコンピテントセルに組換えベクターを加えて氷上で３０分間静置し、続いて４２℃のウォーターバスに入れて４５秒間静置した後、氷上で２分間静置し、その後、培地を加えて、３７℃で１時間振とうすることにより行うことができる。また、宿主の染色体に直接目的のＤＮＡを導入する場合は、相同組換え法などを用いることができる。

次に、本発明は、糖アルコールの製造方法を提供する。本発明に係る糖アルコールの製造方法は、
（ア）本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、本発明に係る形質転換体または本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させて、前記スクロースを単糖に分解する工程
を有する。なお、本発明に係る糖アルコールの製造方法において、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクターおよび形質転換体と同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。

ここで、「糖アルコール」とは、アルドースやケトースのカルボニル基が還元されて生成する糖質である。よって、スクロースを原料として糖アルコールを製造する場合は、スクロースを単糖（フルクトースおよびグルコース）に分解した後、これらの単糖に水素を付加することにより、マンニトール（単糖がフルクトースである場合）やソルビトール（単糖がフルクトースまたはグルコースである場合）といった糖アルコールを製造することができる。

すなわち、本発明に係る糖アルコールの製造方法は、上記（ア）のスクロースを単糖に分解する工程の後に、（イ）単糖に水素を付加する工程を有していてもよい。

（ア）の本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼとスクロースとを接触させる方法としては、例えば、改良型β−フルクトフラノシダーゼをスクロースを含む溶液に添加し、３７℃〜５０℃で２０時間程度静置する方法を挙げることができる。また、（ア）の本発明に係る形質転換体とスクロースとを接触させる方法としては、例えば、宿主が大腸菌の場合は、本発明に係る形質転換体をスクロースを含む溶液に添加し、５０℃で数日間振盪する方法を挙げることができる。

また、（ア）の本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させる方法としては、例えば、本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物をスクロースを含む溶液に添加し、３０℃〜５０℃で２０時間程度静置あるいは振盪する方法を挙げることができる。ここで、培養物は、破砕、磨砕、緩衝液への懸濁、凍結融解、超音波処理、遠心分離、熱処理、塩沈澱、溶媒沈澱、透析、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの何らかの処理に供したものでもよく、処理に供していないものでもよい。

（イ）の単糖に水素を付加する方法としては、例えば、高温高圧の水素雰囲気下にて、ニッケル等の金属触媒を用いて還元する方法（接触還元法）のほか、室温常圧の窒素雰囲気下にて、水素化ホウ素ナトリウム又は水素化アルミニウムリチウム等の還元剤を用いて還元する方法を挙げることができる。接触還元法の場合、より具体的には、単糖（グルコースまたはフルクトース）、適量の水およびニッケル等の金属触媒をオートクレーブに加えて懸濁し、そこに水素を加え、所定の反応温度および反応圧力で一定時間加熱撹拌する方法を挙げることができる。

最後に、本発明は、フラクトオリゴ糖高純度液の製造方法を提供する。本発明に係るフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法は、
（カ）本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、本発明に係る形質転換体または本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物とフラクトオリゴ糖溶液に含有されるスクロースとを接触させて、前記スクロースを単糖に分解する工程
を有する。なお、本発明に係るフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法において、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体および糖アルコールの製造方法と同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。

ここで、「フラクトオリゴ糖」とは、スクロースのフルクトース残基にフルクトースが１〜十数個結合してなる糖類をいう。また、本発明において、「フラクトオリゴ糖高純度液」とは、フラクトオリゴ糖の含有割合が、フラクトオリゴ糖以外の糖類の含有割合と比較して大きい糖類溶液をいう。

（カ）の本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、本発明に係る形質転換体または本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物とフラクトオリゴ糖溶液に含有されるスクロースとを接触させる方法は、上述の「糖アルコールの製造方法」の（ア）の工程におけるものと同様の方法を挙げることができる。

ここで、（カ）のスクロースを含有する「フラクトオリゴ糖溶液」は、例えば、加水分解活性とフルクトース転移活性とを有するβ−フルクトフラノシダーゼをスクロースを含む溶液に添加し、３７℃〜５０℃で２０時間程度反応させることにより得ることができる。

本発明に係るフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法は、（カ）のスクロースを単糖に分解する工程の後に、（キ）前記フラクトオリゴ糖溶液から単糖を除去する工程を有していてもよい。

（キ）のフラクトオリゴ糖溶液から単糖を除去する方法としては、例えば、液体クロマトグラフィー法や膜分離法を挙げることができる。液体クロマトグラフィー法の場合は、単糖を含有するフラクトオリゴ糖溶液を原料液とし、イオン交換水を溶離液として、カラムに陽イオン交換樹脂を充填し、５０℃に加温して各液を供給し、液体クロマトグラフィーを行ってフラクトオリゴ糖と単糖とを分離して、フラクトオリゴ糖を高純度に含むフラクションを分取する方法を挙げることができる。また、膜分離法の場合は、単糖を含有するフラクトオリゴ糖溶液をナノろ過膜（ＮＦ膜；分画分子量２５００）に供して、単糖を高純度に含む透過液とフラクトオリゴ糖を高純度に含む保持液とに分離し、この保持液を回収する方法を挙げることができる。

本発明に係る糖アルコールの製造方法またはフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法には、本発明に係る製造方法の特徴を損なわない限り、他の工程を有してもよく、例えば、結晶化工程、乾燥工程、洗浄工程、濾過工程、殺菌工程、食品添加物を添加する工程などを有してもよい。

以下、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、糖アルコールの製造方法およびフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法について、各実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。

＜実施例１＞ Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼの作成
Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ ＮＢＲＣ３２５５（以下、「Ｇ．ｔｈａｉ」と略記する。）の野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿００７２８１７７４；配列番号２）に対して、Ｎ末から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）を、アスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異（以下、「Ｎ１０５Ｄ」と略記する。）を導入したアミノ酸配列からなる変異体のβ−フルクトフラノシダーゼを作成し、これをＧ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼとした。具体的な手順を以下に示す。

（１）Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの取得
まず、Ｇ．ｔｈａｉのゲノムＤＮＡを常法に従って抽出した。続いて、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの全長の塩基配列（ＧＩ：４５９０１８８７７）（配列番号１）を基に、下記の配列番号３および配列番号４のプライマーを設計し、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片１とした。

《ＰＣＲの条件》
鋳型；Ｇ．ｔｈａｉのゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー；５’−ＡＡＡＴＣＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＣＧ−３’（配列番号３）
リバースプライマー；５’−ＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＡＣＧＴＣＡＴＡＧ−３’（配列番号４）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）

（２）Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターの作成
下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＩＡＭ１０２６、ＡＴＣＣ９４６６）のＰｇｓＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０１６２４５．１）をコードするＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ産物を常法に従って制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、これをＤＮＡ断片２とした。また、ＤＮＡ断片２について、常法に従ってシークエンスを行い、ＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を確認した。確認したＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号５に、それにコードされるＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６にそれぞれ示す。

《ＰＣＲの条件》
鋳型；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＩＡＭ１０２６、ＡＴＣＣ９４６６）のゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー（下線はＮｄｅＩサイトを示す）５’−ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧ−３’（配列番号７）
リバースプライマー（下線はＸｈｏＩサイトを示す）；５’−ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧ−３’（配列番号８）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）

続いて、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで制限酵素処理を行ったｐＣＤＦＤｕｅｔ−１プラスミド（Ｍｅｒｃｋ社）に、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）を用いて添付の使用書に従いＤＮＡ断片２を挿入し、これをｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ組換えベクターとした。その後、下記の条件でＰＣＲを行うことによりｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ組換えベクターのＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片３とした。

《ＰＣＲの条件》
鋳型；ｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＡ−３’(配列番号９)
リバースプライマー；５’− ＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧＡＴＣＡＡ−３‘(配列番号１０)
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ(東洋紡社)

次に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてＤＮＡ断片１およびＤＮＡ断片３を連結することにより、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを作成し、これをｔｈａｉ組換えベクターとした。

（３）改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターの作成
本実施例１（２）のｔｈａｉ組換えベクターを鋳型として、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅した。

《ＰＣＲの条件》
フォワードプライマー；５’−ＧＡＴＧＡＣＣＧＣＧＣＣＴＡＴＡＴＣＧＧＣＴＡＴＴＧＧＴＡＣＡ−３’（配列番号１１）
リバースプライマー；５’−ＧＣＧＧＧＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＡＴＣＡＴＡＡＡＴＣＴＴＧＧＣＡ−３’（配列番号１２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＮＥＯ

得られたＰＣＲ産物に制限酵素ＤｐｎＩを加えて３７℃で１時間消化した後、アガロースゲル電気泳動に供してゲルを切り出して、ＤＮＡ断片を精製した。これに、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈｖｅｒ．２（東洋紡社）およびＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡社）を加えて１６℃で１時間静置することによりＤＮＡ断片のセルフ ライゲーションを行って、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを得た。得られた組換えベクターを、ｔｈａｉ（Ｎ１０５Ｄ）組換えベクターとした。

（４）形質転換および形質転換体の培養と回収
本実施例１（２）のｔｈａｉ組換えベクターおよび本実施例１（３）のｔｈａｉ（Ｎ１０５Ｄ）組換えベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセルに導入して、組換え大腸菌を回収した。続いて、組換え大腸菌から組換えベクターを回収し、これを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（コスモバイオ社）に導入して、形質転換体として組換え大腸菌を得た。これを３０℃で一晩プレート培養した後、組換え大腸菌のクローンをピックアップしてＭ９ ＳＥＥＤ培地０．５ｍＬに植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで２０時間振盪培養した。続いて、培養物のうち５μＬをＭ９ Ｍａｉｎ培地５ｍＬに植え継ぎ、２５℃、２００ｒｐｍで２４時間振盪培養した。その後、培養物を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより組換え大腸菌を集菌した。Ｍ９ ＳＥＥＤ培地およびＭ９ Ｍａｉｎ培地の組成を以下に示す。

Ｍ９ ＳＥＥＤ培地（計１００ｍＬ）；水 ７２ｍＬ、５×Ｍ９塩 ２０ｍＬ、２０％ カザミノ酸 ５ｍＬ、２０％ Ｄ−グルコース ２ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ チミン １ｍＬ、５０ｍＭ ＣａＣｌ_２ ０．２ｍＬ、２．５Ｍ ＭｇＣｌ_２ ４０μＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ＦｅＳＯ_４ ２８μＬ、抗生物質（終濃度５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン）。
Ｍ９ Ｍａｉｎ培地（計１００ｍＬ）；水 ６７ｍＬ、５×Ｍ９塩 ２０ｍＬ、２０％ カザミノ酸 ５ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ チミン １ｍＬ、５０ｍＭ ＣａＣｌ_２ ０．２ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ＦｅＳＯ_４ ２８μＬ、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １（Ｏ．Ｎ．Ｅ．；Ｍｅｒｃｋ社）Ｓｏｌ．１ ２ｍＬ、Ｏ．Ｎ．Ｅ．Ｓｏｌ．２ ５ｍＬ、Ｏ．Ｎ．Ｅ．Ｓｏｌ．３ １００μＬ、抗生物質（終濃度５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン）。

＜実施例２＞Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼの評価
（１）β−フルクトフラノシダーゼの酵素反応
実施例１（４）の組換え大腸菌の培養液０．５ｍＬの集菌体、および、市販の酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来インベルターゼ各４５０Ｕ（日本バイオコン社；１．６２ｍｇ、三菱フードケミカル社；７２ｍｇ）のそれぞれに、６０（ｗ／ｗ）％のスクロース水溶液およびケストース水溶液各３５０μＬならびにフラクトオリゴ糖水溶液５００μＬを加えて懸濁した。これらを３０℃（組換え大腸菌の場合）または６０℃（市販の酵母由来インベルターゼの場合）にて、２００ｒｐｍで３〜２４時間振盪することにより、スクロース、ケストースおよびフラクトオリゴ糖のそれぞれを基質としたβ−フルクトフラノシダーゼの酵素反応を行い、反応液を得た。すなわち、ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液においては、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼにより、ｔｈａｉ（Ｎ１０５Ｄ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液においては、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼにより、酵素反応を行った。

（２）酵素反応生成物の確認
本実施例２（１）の反応液５０μＬに水９５０μＬを加えることにより希釈し、１００℃で１０分間加熱した。これを４℃、１５０００×ｇで１０分間遠心分離に供して上清を回収した後、０．４５μｍ孔フィルターで濾過して、得られた濾液をＨＰＬＣサンプルとした。ＨＰＬＣサンプルを下記の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供して、反応液に含まれる単糖（フルクトース、グルコース）、スクロース（２糖）およびフラクトオリゴ糖（３糖；ケストース、４糖；ニストース、５糖：フラクトシルニストース）の割合を確認した。各糖の割合は、検出された全ピークの面積の総和に対する各ピークの面積の割合として、面積百分率で算出した。スクロースを基質とした反応液の結果を表１に、ケストースを基質とした反応液の結果を表２に、フラクトオリゴ糖を基質とした反応液の結果を表３に、それぞれ示す。

《ＨＰＬＣの条件》
カラム；ＳＨＯＤＥＸ ＫＳ ８０２(８.０φ×３００ｍｍ) ２本
移動相；水
流速 ；１．０ｍＬ／分
注入量；２０μＬ
温度 ；５０℃
検出 ；示差屈折率検出器（ＲＩＤ；昭和電工社）（ピーク面積を用いた面積百分率）

表１に示すように、スクロースを基質とした場合、反応時間が２４時間において、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が２４．０％、スクロースが５９．３％、単糖が１５．９％であった。これに対して、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が９．４％、スクロースが１３．４％、単糖が７３．６％であった。また、市販の酵母由来インベルターゼ（日本バイオコン社）では、フラクトオリゴ糖が０．１％、スクロースが０．７％、単糖が９８．９％であった。市販の酵母由来インベルターゼ（三菱フードケミカル社）では、フラクトオリゴ糖が０．８％、スクロースが１．２％、単糖が９７．６％であった。

すなわち、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼと比較して、フラクトオリゴ糖およびスクロースの割合が小さく、単糖の割合が顕著に大きかった。この結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）を、アスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、フラクトオリゴ糖の生成を抑制して、スクロースの分解を促進できることが明らかになった。また、市販の酵母由来インベルターゼでは、フラクトオリゴ糖のおよびスクロースの割合が顕著に小さく、単糖の割合が顕著に大きかった。この結果から、市販の酵母由来インベルターゼは、フラクトオリゴ糖をほとんど生成せず、専らスクロースを分解することが明らかになった。

また、表２に示すように、ケストースを基質とした場合、反応時間が２４時間において、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼでは、４糖以上のフラクトオリゴ糖が１０．５％、ケストースが６６．９％、スクロースが１１．２％、単糖が１１．４％であった。これに対して、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、４糖以上のフラクトオリゴ糖が２．４％、ケストースが８４．５％、スクロースが１．１％、単糖が１１．８％であった。また、市販の酵母由来インベルターゼ（日本バイオコン社）では、４糖以上のフラクトオリゴ糖が０．０％、ケストースが０．０％、スクロースが０．８％、単糖が９８．６％であった。市販の酵母由来インベルターゼ（三菱フードケミカル社）では、４糖以上のフラクトオリゴ糖が３．１％、ケストースが７．３％、スクロースが４．２％、単糖が８４．３％であった。

すなわち、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼと比較して、ケストースの割合が顕著に大きく、４糖以上のフラクトオリゴ糖、スクロースおよび単糖の割合が小さかった。この結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）を、アスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、フラクトオリゴ糖の生成およびケストースの分解を抑制できることが明らかになった。また、市販の酵母由来インベルターゼでは、４糖以上のフラクトオリゴ糖、ケストースおよびスクロースの割合が顕著に小さく、単糖の割合が顕著に大きかった。この結果から、市販の酵母由来インベルターゼは、ケストースを分解する活性が大きいことが明らかになった。

また、表３に示すように、フラクトオリゴ糖を基質とした場合、反応時間が２４時間において、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が４９．５％、スクロースが９．９％、単糖が４０．６％であった。これに対して、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が５８．７％、スクロースが２．５％、単糖が３９．０％であった。また、市販の酵母由来インベルターゼ（日本バイオコン社）では、フラクトオリゴ糖が１８．９％、スクロースが４．２％、単糖が７６．９％であった。市販の酵母由来インベルターゼ（三菱フードケミカル社）では、フラクトオリゴ糖が０．０％、スクロースが０．４％、単糖が９９．５％であった。なお、反応時間０時間のフラクトオリゴ糖水溶液に、スクロースが１１．９％、単糖が３１．１％含まれるのは、基質として用いた「フラクトオリゴ糖」に混入していたことによると考えられた。

すなわち、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼと比較して、フラクトオリゴ糖の割合が大きく、スクロースおよび単糖の割合が小さかった。この結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）を、アスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、フラクトオリゴ糖の分解を抑制できることが明らかになった。また、市販の酵母由来インベルターゼでは、フラクトオリゴ糖の割合が顕著に小さく、スクロースの割合が小さく、単糖の割合が顕著に大きかった。この結果から、市販の酵母由来インベルターゼは、フラクトオリゴ糖を分解する活性が大きいことが明らかになった。

以上の表１〜３の結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）を、アスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、フラクトオリゴ糖の生成および分解を抑制して、スクロースを特異的に分解できることが明らかになった。また、市販の酵母由来インベルターゼはフラクトオリゴ糖をほとんど生成しないが、スクロースのみならずフラクトオリゴ糖も分解する点で、加水分解の基質特異性が小さいことが明らかになった。

＜実施例３＞ 二重変異体の改良型β−フルクトフラノシダーゼの評価
Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）を、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）またはヒスチジン（Ｈ）に置換するアミノ酸変異（以下、「Ｎ１０５Ｄ」、「Ｎ１０５Ｓ」、「Ｎ１０５Ｈ」と略記する。）と、Ｎ末から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）を、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異（以下、「Ｈ３２１Ｒ」、「Ｈ３２１Ｋ」と略記する。）とを導入したアミノ酸配列からなる二重変異体のβ−フルクトフラノシダーゼを作成し、その酵素活性を評価した。具体的な手順を以下に示す。

（１）二重変異体の改良型β−フルクトフラノシダーゼの作成
まず、実施例１（２）のｔｈａｉ組換えベクターを鋳型として、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、「Ｈ３２１Ｒ」および「Ｈ３２１Ｋ」をそれぞれ導入したアミノ酸配列からなる変異体のβ−フルクトフラノシダーゼ（Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼおよびＧ．ｔｈａｉ由来（Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼ）をコードするＤＮＡを増幅した。

《ＰＣＲの条件》
「Ｈ３２１Ｒ」
フォワードプライマー；５’−ＣＧＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣ−３’（配列番号１３）
リバースプライマー；５’−ＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＡＧＧＴＣＡＧＡＣ−３’（配列番号１４）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＮＥＯ
「Ｈ３２１Ｋ」
フォワードプライマー；５’−ＡＡＡＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣ−３’（配列番号１５）
リバースプライマー；５’−ＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＡＧＧＴＣＡＧＡＣ−３’（配列番号１４）
ＰＣＲ用酵素；ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ

得られたＰＣＲ産物に制限酵素ＤｐｎＩを加えて３７℃で１時間消化した後、アガロースゲル電気泳動に供してゲルを切り出して、ＤＮＡ断片を精製した。これに、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈｖｅｒ．２（東洋紡社）およびＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡社）を加えて１６℃で１時間静置することによりＤＮＡ断片のセルフ ライゲーションを行って組換えベクターを作成し、それぞれｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクターとした。

続いて、下記の鋳型およびフォワードプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、二重変異体のβ−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを含んだプラスミドベクターを増幅した。このＰＣＲにおいて、リバースプライマーは、５’−ＧＣＧＧＧＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＡＴＣＡＴＡＡＡＴＣＴＴＧＧＣＡ−３’（配列番号１６）を、ＰＣＲ用酵素はＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＮＥＯを用いた。以下、「Ｎ１０５Ｄ」および「Ｈ３２１Ｒ」、「Ｎ１０５Ｓ」および「Ｈ３２１Ｒ」、「Ｎ１０５Ｈ」および「Ｈ３２１Ｋ」ならびに「Ｎ１０５Ｓ」および「Ｈ３２１Ｋ」のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる二重変異体のβ−フルクトフラノシダーゼを、それぞれ、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼ、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼＧ．ｔｈａｉ由来（（Ｎ１０５Ｈ／Ｈ３２１Ｋ））改良型β−フルクトフラノシダーゼおよびＧ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼと表記する。

《ＰＣＲの条件》
「Ｎ１０５Ｄ／Ｈ３２１Ｒ」
鋳型；ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＧＡＴＧＡＣＣＧＣＧＣＣＴＡＴＡＴＣＧＧＣＴＡＴＴＧＧＴＡＣＡ−３’（配列番号１１）
「Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｒ」
鋳型；ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＴＣＴＧＡＣＣＧＣＧＣＣＴＡＴＡＴＣＧＧＣＴＡＴＴＧＧＴＡＣＡ−３’（配列番号１７）
「Ｎ１０５Ｈ／Ｈ３２１Ｋ」
鋳型；ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＣＡＴＧＡＣＣＧＣＧＣＣＴＡＴＡＴＣＧＧＣＴＡＴＴＧＧＴＡＣＡ−３’（配列番号１８）
「Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｋ」
鋳型；ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＴＣＴＧＡＣＣＧＣＧＣＣＴＡＴＡＴＣＧＧＣＴＡＴＴＧＧＴＡＣＡ−３’（配列番号１７）

得られたＰＣＲ産物に制限酵素ＤｐｎＩを加えて３７℃で１時間消化した後、アガロースゲル電気泳動に供してゲルを切り出して、ＤＮＡ断片を精製した。これに、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡社）およびＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡社）を加えて１６℃で１時間静置することによりＤＮＡ断片のセルフライゲーションを行い、二重変異体のβ−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを作成した。これらの組換えベクターを実施例１（４）に記載の方法により大腸菌に導入し、組換え大腸菌の培養と回収を行った。

（２）評価
本実施例３（１）の組換え大腸菌の集菌体について、実施例２に記載の方法により酵素反応を行った後、反応液に含まれる各糖の割合を確認した。スクロースを基質とした反応液の結果を表４に、ケストースを基質とした反応液の結果を表５に、フラクトオリゴ糖を基質とした反応液の結果を表６に、それぞれ示す。

表４に示すように、スクロースを基質とした場合、反応時間が２４時間において、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が２４．０％、スクロースが５９．３％、単糖が１５．９％であった。これに対して、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が２．６％、スクロースが１０．２％、単糖が８０．３％であった。Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が１７．１％、スクロースが１１．９％、単糖が６９．４％であった。Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｈ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が３０．６％、スクロースが１１．５％、単糖が５６．７％であった。Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が２１．３％、スクロースが２５．４％、単糖が５３．３％であった。

すなわち、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼ、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼおよびＧ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼと比較して、フラクトオリゴ糖およびスクロースの割合が小さく、単糖の割合が大きかった。この結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）に置換するアミノ酸変異およびＮ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、フラクトオリゴ糖の生成を抑制して、スクロースの分解を促進できることが明らかになった。

また、表５に示すように、ケストースを基質とした場合、反応時間が２４時間において、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼでは、４糖以上のフラクトオリゴ糖が１０．５％、ケストースが６６．９％、スクロースが１１．２％、単糖が１１．４％であった。これに対して、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、４糖以上のフラクトオリゴ糖が１．１％、ケストースが９５．９％、スクロースが１．０％、単糖が２．０％であった。Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、４糖以上のフラクトオリゴ糖が２．７％、ケストースが９０．２％、スクロースが１．１％、単糖が６．０％であった。Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｈ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、４糖以上のフラクトオリゴ糖が４．８％、ケストースが７５．８％、スクロースが２．９％、単糖が１６．１％であった。Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、４糖以上のフラクトオリゴ糖が２．４％、ケストースが８９．３％、スクロースが１．７％、単糖が６．７％であった。

すなわち、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼ、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼおよびＧ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼと比較して、４糖以上のフラクトオリゴ糖の割合が顕著に小さく、ケストースの割合が顕著に大きく、スクロースおよび単糖の割合が小さかった。この結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）に置換するアミノ酸変異とＮ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異とを導入することにより、ケストースの分解を抑制できることが明らかになった。

また、表６に示すように、フラクトオリゴ糖を基質とした場合、反応時間が２４時間において、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が４９．５％、スクロースが９．９％、単糖が４０．６％であった。これに対して、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が６１．２％、スクロースが１．５％、単糖が３６．９％であった。Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が５７．４％、スクロースが２．２％、単糖が４０．５％であった。Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｈ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が５３．０％、スクロースが３．９％、単糖が４３．１％であった。Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が５５．３％、スクロースが２．４％、単糖が４２．３％であった。

すなわち、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｄ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼ、Ｇ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｒ）改良型β−フルクトフラノシダーゼおよびＧ．ｔｈａｉ由来（Ｎ１０５Ｓ／Ｈ３２１Ｋ）改良型β−フルクトフラノシダーゼでは、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼと比較して、フラクトオリゴ糖の割合が顕著に大きく、スクロースの割合が小さかった。この結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）に置換するアミノ酸変異およびＮ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、フラクトオリゴ糖の分解を抑制できることが明らかになった。

以上の表４〜６の結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）に置換するアミノ酸変異およびＮ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、フラクトオリゴ糖の生成および分解を抑制して、スクロースを特異的に分解できることが明らかになった。

Claims (8)

1. 下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる改良型β−フルクトフラノシダーゼ；
   （ａ）配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列、
   （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスクロース分解活性を有するアミノ酸配列。
2. 下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列からなる改良型β−フルクトフラノシダーゼ；
   （ｃ）配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、以下のｉ）およびｉｉ）のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列；
   ｉ）Ｎ末端から１０５番目のアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）に置換するアミノ酸変異、
   ｉｉ）Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異、
   （ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつスクロース分解活性を有するアミノ酸配列。
3. 請求項１または請求項２に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
4. 請求項１または請求項２に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ。
5. 請求項４に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
6. 請求項４に記載のＤＮＡまたは請求項５に記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる、形質転換体。
7. 請求項１もしくは請求項２に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼ、請求項６に記載の形質転換体または請求項６に記載の形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させて、前記スクロースを単糖に分解する工程を有する糖アルコールの製造方法。
8. 請求項１もしくは請求項２に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼ、請求項６に記載の形質転換体または請求項６に記載の形質転換体を培養して得られる培養物とフラクトオリゴ糖溶液に含有されるスクロースとを接触させて、前記スクロースを単糖に分解する工程を有するフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法。