WO2016017774A1 - 改良型β－フルクトフラノシダーゼ - Google Patents

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WO2016017774A1
WO2016017774A1 PCT/JP2015/071701 JP2015071701W WO2016017774A1 WO 2016017774 A1 WO2016017774 A1 WO 2016017774A1 JP 2015071701 W JP2015071701 W JP 2015071701W WO 2016017774 A1 WO2016017774 A1 WO 2016017774A1
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WO
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amino acid
fructofuranosidase
acid sequence
improved
recombinant vector
Prior art date
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PCT/JP2015/071701
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English (en)
French (fr)
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巧 栃尾
有未 伊藤
藤井　匡
圭輔 田村
Original Assignee
物産フードサイエンス株式会社
日本マイクロバイオファーマ株式会社
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to an improved ⁇ -fructofuranosidase, and more particularly, an improved ⁇ -fructofuranosidase capable of generating kestose while suppressing the production of nystose and decomposing sucrose while suppressing the decomposition of oligosaccharides.
  • the present invention relates to a method for producing type ⁇ -fructofuranosidase.
  • ⁇ -fructofuranosidase is an enzyme that recognizes and hydrolyzes sugar fructose containing fructose residues at its ends. Some ⁇ -fructofuranosidases have fructose transfer activity for transferring fructose generated by hydrolysis to a substrate in addition to the hydrolysis activity. According to such ⁇ -fructofuranosidase, kestose, which is a trisaccharide in which one molecule of glucose and two molecules of fructose are bound, can be generated using sucrose as a substrate.
  • 1-kestose has a sweetness similar to sucrose (sugar) and produces about one third of the sweetness of sugar, while it is about half the calorie of sugar, It is known that it is a useful oligosaccharide because it is difficult to increase the value and has an allergy suppressing function (Patent Document 1).
  • ⁇ -fructofuranosidase producing 1-kestose include, for example, ⁇ -fructofuranosidase derived from Aspergillus niger and ⁇ -fructofuranoside of a mutant in which an amino acid mutation is introduced into its amino acid sequence. Sidase is disclosed (Patent Document 2). *
  • nystose When producing kestose using sucrose as a substrate and ⁇ -fructofuranosidase, tetrasaccharide nystose is usually produced as a by-product. Nistose is difficult to separate from kestose in chromatography, and it is likely to remain in the reaction solution even after a separation and purification step by chromatography. Further, a certain amount or more of nystose present in the liquid inhibits crystallization of kestose in the crystallization process. From these facts, it is necessary to reduce the production of nystose in order to produce a high purity kestose solution and to produce kestose crystals efficiently.
  • the substrate sucrose remaining in the reaction solution is also a factor that decreases the recovery rate of kestose in the chromatographic separation and purification process of kestose, and the sucrose can be recovered by specifically decomposing it into a monosaccharide. You can raise the rate. Therefore, in order to produce a high-pure kestose solution by improving the efficiency of chromatographic separation and purification, and to produce kestose crystals efficiently, sucrose must be specifically decomposed while inhibiting the degradation of kestose. is required.
  • the present invention has been made to solve such problems, and is an improved type capable of generating kestose while suppressing the production of nystose and decomposing sucrose while suppressing the decomposition of oligosaccharides such as kestose.
  • ⁇ -fructofuranosidase polypeptide containing the amino acid sequence
  • DNA encoding improved ⁇ -fructofuranosidase recombinant vector containing the DNA, the DNA or the recombinant vector
  • One embodiment of the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention is a ⁇ comprising an amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2.
  • the histidine (H) corresponding to the 321st position from the N-terminal of the amino acid sequence of the wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2 in the alignment with the amino acid sequence of fructofuranosidase, It consists of an amino acid sequence into which an amino acid mutation to be substituted for a protein constituent amino acid other than H) is introduced.
  • Another embodiment of the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention comprises the following amino acid sequence (a) or (b): (a) the wild-type ⁇ -fructo shown in SEQ ID NO: 2 In the amino acid sequence of furanosidase, an amino acid sequence in which 321st histidine (H) from the N-terminus is substituted with a protein-constituting amino acid other than histidine (H), (b) in amino acid sequence (a), An amino acid sequence consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids except amino acids into which amino acid mutations have been introduced are deleted, substituted, inserted or added, and having ⁇ -fructofuranosidase activity.
  • the polypeptide according to the present invention includes the amino acid sequence of the improved ⁇ -fructofuranosidase described in (1) or (2).
  • the DNA according to the present invention encodes the improved ⁇ -fructofuranosidase described in (1) or (2).
  • a recombinant vector according to the present invention comprises the DNA described in (4).
  • the transformant according to the present invention is a transformant obtained by introducing the DNA described in (4) or the recombinant vector described in (5) into a host.
  • the host into which the DNA described in (4) or the recombinant vector described in (5) is introduced may be E. coli.
  • the method for producing an improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention comprises an improved ⁇ -fructofuranosidase from a culture obtained by culturing the transformant according to (6) or (7). The process of acquiring.
  • kestose is produced while inhibiting the production of nystose, and sucrose is degraded while inhibiting the degradation of kestose.
  • the separation and purification process by chromatography can be made efficient to produce a high-purity kestose solution, and kestose crystals can be produced efficiently.
  • the DNA according to the present invention the recombinant vector according to the present invention, the transformant according to the present invention, and the method for producing the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention
  • An improved ⁇ -fructofuranosidase capable of producing kestose while inhibiting the production of nystose and degrading sucrose while inhibiting the degradation of oligosaccharides such as kestose can be obtained.
  • ⁇ -fructofuranosidase can be replaced with “fructosyltransferase”, “saccharase”, “ ⁇ -D-fructofuranosidase”, “invertase”, “invertase” or “invertin”. May be used.
  • the “wild-type ⁇ -fructofuranosidase” in the present invention refers to ⁇ -fructofuranosidase having an amino acid sequence into which no amino acid mutation has been introduced using a genetic engineering technique.
  • “Fructofuranosidase” refers to ⁇ -fructofuranosidase consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acid mutations are introduced into the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase.
  • One aspect of the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention is ⁇ -fructo comprising an amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2.
  • histidine (H) corresponding to the 321st position from the N-terminal of the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2 in the alignment is other than histidine (H). It consists of an amino acid sequence into which an amino acid mutation is substituted for a protein-constituting amino acid.
  • protein-constituting amino acids refers to those listed in Table 1 below (Biochemical Dictionary 4th edition; published by Tokyo Chemical Dojinsha, page 57, December 2007).
  • the “protein-constituting amino acid other than histidine (H)” is preferably a basic amino acid other than histidine (H), an acidic amino acid, an aliphatic amino acid and a hydroxy amino acid, more preferably arginine (R ), Lysine (K), glutamic acid (E), glycine (G) and serine (S).
  • the identity between the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2 and the other amino acid sequence can be confirmed according to a conventional method.
  • FASTA http://www.genome.JP / Tool / fasta /
  • Basic local alignment search tool BLAST; http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
  • Position-Specific IteratedBLAST PSI-Blast / pw.lp. .Nih.gov.
  • identity indicates coincidence and is used interchangeably with “identity”.
  • the amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase consisting of an amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, It can be obtained by deleting, substituting, inserting or adding one or more amino acids within a range where the identity with the amino acid sequence of 2 does not become less than 50%. Further, according to a conventional method, from an amino acid sequence database such as ProteinProInformation Resource (PIR), SWISS-PROT, TrEMBL, Protein Research Foundation (PRF), GenPept (NCBI Protein database), FASTA (http: // www.
  • PIR ProteinProInformation Resource
  • SWISS-PROT SWISS-PROT
  • TrEMBL Protein Research Foundation
  • PRF Protein Research Foundation
  • GenPept NCBI Protein database
  • FASTA http: // www.
  • the amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase consisting of an amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2 can be any of bacteria, yeast, molds, plants, etc. It may be the amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase derived from the organism.
  • amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase consisting of an amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2, specifically, for example, SEQ ID NO: 2
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 one or more amino acids are deleted or substituted within a range in which the identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (hereinafter sometimes referred to as “predetermined identity”) does not become less than 50%.
  • amino acid sequence inserted or added the amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase derived from Gluconobacter oxydans (NCBI WP — 01503058.1; predetermined identity 99%), the amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase derived from Gluconobacter frateuni (NCBI WP — 0234120. 1; predetermined Identity 97%), Gluconobacter frateuni from ⁇ - fructofuranosidase amino acid sequence (NCBI WP_010503395.1; predetermined identity 96%), Gluconobacter sp.
  • Amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase derived from TMW 2.767 (CCG47844.1; predetermined identity 96%), amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase derived from Gluconobacter cerinus (CCG47845.1; predetermined identity 91%)
  • Amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase derived from Gluconobacter aceti NCBI WP — 026199939.1; predetermined identity 68%), amino acid sequence of Gluconobacter aceti derived ⁇ -fructofuranosidase (NCBIBWP — 0106666435.1; predetermined identity 68) %), Amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase derived from Gluconoacetobacter xylinus (BAA93720.1; predetermined identity 67%), G Amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase derived from
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 an amino acid obtained by deleting, substituting, inserting or adding one or a plurality of amino acids as long as the identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 does not become less than 50%.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted or added in the case of “sequence” is, for example, 1 to 200, 1 to 180, 1 to 160, 1 to 140, 1 to 120, 1 to 100. 1 to 80, preferably 1 to 60, more preferably 1 to 50, still more preferably 1 to 40, and still more preferably 1 to 30.
  • the identity value can be 50% or more, for example, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 68% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more.
  • Alignment is sometimes called “sequence alignment” or “alignment”, but is synonymous.
  • alignment can be carried out according to a conventional method, for example, FASTA (http://www.genome.JP/tools/fasta/), Basic alignment search tool (BLAST; http: //www.ncbi. nlm.nih.gov.), Position-Specific Iterated BLAST (PSI-BLAST; http://www.ncbi.nlm.nih.gov.), CLUSTALW (http: //www.genome.p It can be performed using a program such as MATFT (http://www.genome.jp/ja/).
  • Another embodiment of the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention consists of the following amino acid sequence (a) or (b):
  • (A) An amino acid mutation that replaces the 321st histidine (H) from the N-terminus with a protein-constituting amino acid other than histidine (H) is introduced into the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2.
  • Amino acid sequence, (B) The amino acid sequence (a) comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids excluding amino acids into which amino acid mutations have been introduced are deleted, substituted, inserted or added, and has ⁇ -fructofuranosidase activity. Amino acid sequence having.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added is, for example, 1 to 30, 1 to 20, preferably 1 to 15, It means an amino acid sequence in which any number of amino acids, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, is deleted, substituted, inserted or added.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention has the following characteristics (i) and (ii) compared to wild-type ⁇ -fructofuranosidase; (i) can produce kestose, and The amount or ratio of nystose produced is small. (Ii) When the enzyme reaction time is long, the degradation amount of oligosaccharides such as kestose and nystose is small, and sucrose can be degraded. That is, the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention can be used as a kestose producing enzyme according to the feature (i), and can be used as a sucrose degrading enzyme according to the feature (ii). it can.
  • oligosaccharide refers to a saccharide formed by binding about 3 to a dozen monosaccharides, and is used interchangeably with “oligosaccharide” or “sucrose”.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention can be obtained according to a conventional method, and examples of such a method include a chemical synthesis method and a method using a gene recombination technique.
  • a chemical synthesis method for example, based on the amino acid sequence information of the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention, Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method)
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention can be synthesized according to chemical synthesis methods such as the above, and various commercially available peptide synthesizers can also be used for synthesis.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention can be obtained by expressing the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention in a suitable expression system. it can. That is, a transformant is obtained by introducing DNA encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention into a suitable host. Alternatively, as shown in Example 1 described later, a DNA encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention is inserted into an appropriate vector to obtain a recombinant vector, and then the recombinant vector is A transformant is obtained by introducing it into an appropriate host. Then, the improved transformant according to the present invention can be obtained by culturing the obtained transformant to express the improved ⁇ -fructofuranosidase.
  • the DNA encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention can be synthesized using various commercially available DNA synthesizers based on the basic acid sequence information. It can be obtained by performing a polymerase chain reaction (PCR) using a DNA encoding type ⁇ -fructofuranosidase or a DNA encoding improved ⁇ -fructofuranosidase as a template.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a DNA primer encoding the amino acid mutation to be introduced is used.
  • a DNA encoding an improved ⁇ -fructofuranosidase having an amino acid sequence into which an amino acid mutation has been introduced can be obtained.
  • an improved ⁇ -full amino acid sequence comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids except the amino acid into which an amino acid mutation has been introduced is deleted, substituted, inserted or added.
  • DNA encoding cetofuranosidase can also be obtained by PCR. That is, first, in the amino acid sequence (a), a DNA primer encoding an amino acid sequence corresponding to a position where an amino acid is deleted, substituted, inserted or added is designed, and using the DNA primer, the amino acid sequence (a) By performing PCR using a DNA encoding as a template, a DNA encoding an amino acid sequence in which the amino acid has been deleted, substituted, inserted or added can be obtained.
  • a certain protein has ⁇ -fructofuranosidase activity can be confirmed according to a conventional method.
  • the protein is treated with sucrose. After incubating in the reaction solution containing or culturing the transformant expressing the protein in the reaction solution containing sucrose, the content of the reaction solution is confirmed by high performance liquid chromatography (HPLC) or the like.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the protein can be determined to have ⁇ -fructofuranosidase activity.
  • the present invention also provides a polypeptide comprising the amino acid sequence of improved ⁇ -fructofuranosidase.
  • the description of the same or equivalent configuration as the above-described improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention is omitted.
  • the sequence length is not particularly limited, and the amino acid of the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention is not limited.
  • the amino acid sequence of the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention may be an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are added to the amino terminus and / or carboxyl terminus. But you can.
  • the polypeptide according to the present invention can be obtained by the same method as the method for obtaining the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention described above.
  • the present invention provides a DNA encoding an improved ⁇ -fructofuranosidase.
  • the description of the same or equivalent configuration as the above-described improved ⁇ -fructofuranosidase and polypeptide according to the present invention is omitted. .
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising DNA encoding an improved ⁇ -fructofuranosidase.
  • a recombinant vector comprising DNA encoding an improved ⁇ -fructofuranosidase.
  • the description of the same or corresponding configuration as the above-described improved ⁇ -fructofuranosidase, polypeptide and DNA according to the present invention is omitted.
  • the recombinant vector according to the present invention can be obtained, for example, by inserting a DNA encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention into the vector. Insertion of DNA into a vector can be performed according to a conventional method, for example, by ligating DNA with a DNA fragment of a linearized vector.
  • examples of the vector include a phage vector, a plasmid vector, a cosmid, and a phagemid, and can be appropriately selected depending on the host, operability, and the like.
  • the recombinant vector according to the present invention includes a selection marker gene for a transformant such as a drug resistance marker gene and an auxotrophic marker gene, It may contain a transcription regulatory signal such as a promoter necessary for expression of the improved ⁇ -fructofuranosidase, a transcription initiation signal, a ribosome binding site, a translation termination signal, a transcription termination signal, a translation regulation signal, and the like.
  • a selection marker gene for a transformant such as a drug resistance marker gene and an auxotrophic marker gene
  • a transcription regulatory signal such as a promoter necessary for expression of the improved ⁇ -fructofuranosidase, a transcription initiation signal, a ribosome binding site, a translation termination signal, a transcription termination signal, a translation regulation signal, and the like.
  • the present invention also provides a transformant.
  • the description of the same or corresponding configuration as the above-described improved ⁇ -fructofuranosidase, polypeptide, DNA and recombinant vector according to the present invention is omitted.
  • the transformant according to the present invention is obtained by introducing into a host a DNA encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase or a recombinant vector containing the DNA encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention. It is done.
  • the host include bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, yeasts, filamentous fungi, and the like, which can be appropriately selected according to the type and operability of the recombinant vector.
  • Introduction (transformation) of DNA or a recombinant vector into a host can be performed according to a conventional method. For example, when a recombinant vector using a plasmid is introduced into E.
  • the present invention provides a method for producing an improved ⁇ -fructofuranosidase.
  • the method for producing an improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention includes a step of obtaining an improved ⁇ -fructofuranosidase from a culture obtained by culturing the transformant according to the present invention.
  • the same or equivalent to the above-described improved ⁇ -fructofuranosidase, polypeptide, DNA, recombinant vector and transformant according to the present invention The description of the configuration to be repeated is omitted.
  • the method for obtaining the improved ⁇ -fructofuranosidase includes a mode of the transformant, etc. It can be selected as appropriate according to the conditions.
  • the culture obtained by culturing the transformant may be obtained as an improved ⁇ -fructofuranosidase as it is, or obtained by purifying the improved ⁇ -fructofuranosidase from the culture. May be.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase is expressed on the cell surface or inside the cell of the transformant. If the DNA or recombinant vector is designed as described above, the culture is subjected to centrifugation, and the transformant is recovered and directly obtained as an improved ⁇ -fructofuranosidase. A method of crushing the body and obtaining it as an improved ⁇ -fructofuranosidase can be mentioned.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase As a method for purifying the improved ⁇ -fructofuranosidase from the culture, for example, when a DNA or a recombinant vector is designed so that the improved ⁇ -fructofuranosidase is secreted outside the transformant.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase can be purified by subjecting the culture to centrifugation and collecting the culture supernatant.
  • the culture is subjected to centrifugation to recover the precipitated transformant, which is suspended in a buffer solution.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase can be purified by crushing the transformant by freeze-thawing, sonication or grinding, etc., and collecting the supernatant by centrifugation.
  • Other purification methods include heat treatment, salt precipitation, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, reverse Examples of the method include phase chromatography and isoelectric focusing.
  • the present invention provides a method for producing kestose.
  • the method for producing kestose according to the present invention comprises the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention, the transformant according to the present invention or a culture obtained by culturing the transformant according to the present invention and sucrose. A step of contacting.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase, polypeptide, DNA, recombinant vector, transformant and improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention described above are produced. A description of the same or corresponding configuration as the method is omitted.
  • kestose is usually produced by binding fructose to sucrose, and three types of 1-kestose, 6-kestose and neokestose can be generated depending on the position where fructose is bound. That is, 1-kestose is produced by fructose binding ⁇ (2 ⁇ 1) to fructose units in sucrose, and 6-kestose is produced by fructose binding ⁇ (2 ⁇ 6) to fructose units in sucrose.
  • Neokestose is produced by fructose binding ⁇ (2 ⁇ 6) to glucose units in sucrose.
  • Nistose is a tetrasaccharide produced by fructose binding ⁇ (2 ⁇ 1) to a fructose unit in 1-kestose.
  • kestose means a trisaccharide in which one molecule of glucose and two molecules of fructose are bound, and includes 1-kestose, 6-kestose and neokestose.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase is added to a solution containing sucrose and then heated at 30 ° C. to 50 ° C. for about 20 hours. The method of leaving still can be mentioned.
  • the transformant according to the present invention is added to a solution containing sucrose and shaken at 50 ° C. for several days. A method for culturing can be mentioned.
  • the culture obtained by culturing the transformant according to the present invention is put into a solution containing sucrose.
  • the method include adding and allowing to stand at 30 ° C. to 50 ° C. for about 20 hours or shaking.
  • the culture is crushed, ground, suspended in buffer, freeze-thawed, sonication, centrifugation, heat treatment, salt precipitation, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, SDS-polyacrylamide It may be subjected to some treatment such as gel electrophoresis, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, isoelectric focusing, etc., or may not be subjected to treatment.
  • some treatment such as gel electrophoresis, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, isoelectric focusing, etc.
  • the method for producing kestose according to the present invention may have other steps as long as the characteristics of the method for producing kestose according to the present invention are not impaired, for example, a kestose separation step by chromatography or sucrose A crystallization process, a drying process, a washing process, a filtration process, a sterilization process, a process of adding food additives, and the like may be included.
  • Example 1 Preparation of Improved ⁇ -Fructofuranosidase Amino acid sequence (NCBI WP — 007281774) of wild-type ⁇ -fructofuranosidase of Gluconobacter thalicandis NBRC3255 (hereinafter abbreviated as “G.thai”); ) Histidine (H) from the N-terminus is substituted with arginine (R), lysine (K), glutamic acid (E), glycine (G) or serine (S) (hereinafter referred to as respective amino acid mutations).
  • H321R Amino acid mutations are abbreviated as “H321R”, “H321K”, “H321E”, “H321G”, and “H321S”). It was referred to as cetofuranosidase. The specific procedure is shown below.
  • G Obtaining DNA encoding wild type ⁇ -fructofuranosidase derived from thai
  • the genomic DNA of thai was extracted according to a conventional method. Subsequently, G.M.
  • the following primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 were designed, and the following conditions
  • PCR polymerase chain reaction
  • the pCDFDuet-1 plasmid (Merck) was digested with the restriction enzymes NdeI and BamHI, followed by DNA ligation Kit Kit Ver. 2.1 (Takara Bio Inc.) was used to insert DNA fragment 2 according to the attached instruction, and this was used as a pCDF-pgsA recombinant vector. Thereafter, PCR was performed under the following conditions to amplify the DNA of the pCDF-pgsA recombinant vector, and this was designated as DNA fragment 3.
  • DNA fragment 1 and DNA fragment 3 were ligated using In-Fusion HD HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.)
  • a recombinant vector into which a DNA encoding a thai-derived wild-type ⁇ -fructofuranosidase was inserted was prepared and used as a thai recombinant vector.
  • the restriction enzyme DpnI was added to the obtained PCR product and digested at 37 ° C. for 1 hour, followed by agarose gel electrophoresis to cut out the gel and purify the DNA fragment.
  • Ligation highver. 2 Toyobo Co., Ltd.
  • T4 Polynucleotide Kinase Toyobo Co., Ltd.
  • a recombinant vector was created.
  • thai (H321R) A vector, a thai (H321K) recombinant vector, a thai (H321E) recombinant vector, a thai (H321G) recombinant vector and a thai (H321S) recombinant vector were used.
  • coli BL21 (DE3) competent cell (Cosmo Bio) was used to obtain recombinant E. coli as a transformant.
  • the plate was cultured overnight at 30 ° C., and then a recombinant E. coli clone was picked up and inoculated into 0.5 mL of M9 SEED medium, followed by shaking culture at 30 ° C. and 220 rpm for 20 hours. Subsequently, 5 ⁇ L of the culture was transferred to 5 mL of M9 Main medium and cultured with shaking at 25 ° C. and 220 rpm for 24 hours. Thereafter, the recombinant E. coli was collected by centrifuging the culture at 3500 rpm for 10 minutes.
  • the compositions of M9 SEED medium and M9 Main medium are shown below.
  • M9 SEED medium total 100 mL; water 72 mL, 5 ⁇ M9 salt 20 mL, 20% casamino acid 5 mL, 20% D-glucose 2 mL, 2 mg / mL thymine 1 mL, 50 mM CaCl 2 0.2 mL, 2.5 M MgCl 2 40 ⁇ L, 100 mg / mL FeSO 4 28 ⁇ L, antibiotic (final concentration 50 ⁇ g / mL streptomycin).
  • M9 Main medium (total 100 mL); water 67 mL, 5 ⁇ M9 salt 20 mL, 20% casamino acid 5 mL, 2 mg / mL thymine 1 mL, 50 mM CaCl 2 0.2 mL, 100 mg / mL FeSO 4 28 ⁇ L, Overnight Expression Automation 1 N.E .; Merck) Sol. 12 mL, O.I. N. E. Sol. 2 5 mL, O.D. N. E. Sol. 3 100 ⁇ L, antibiotic (final concentration 50 ⁇ g / mL streptomycin).
  • Example 2 Evaluation of improved ⁇ -fructofuranosidase; examination of amino acid mutation (1)
  • Enzymatic reaction of ⁇ -fructofuranosidase 0.04M sodium phosphate containing 30 (w / w)% sucrose A buffer (pH 7.0) was prepared and used as a 30% sucrose solution.
  • 0.5 mL of the recombinant Escherichia coli collected in Example 1 (4) was prepared, and the wet weight was measured.
  • 350 ⁇ L of a 30% sucrose solution was added and suspended, and then the enzyme reaction of ⁇ -fructofuranosidase was carried out by shaking at 30 ° C. and 200 rpm for 20 hours to obtain a reaction solution.
  • reaction solution was diluted by adding 950 ⁇ L of water to 50 ⁇ L of the reaction solution, and heated at 100 ° C. for 10 minutes. This was centrifuged at 4 ° C. and 15000 ⁇ g for 10 minutes to collect the supernatant, and then filtered through a 0.45 ⁇ m pore filter, and the resulting filtrate was used as an HPLC sample.
  • the HPLC sample is subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) under the following conditions, and each sugar (monosaccharide; fructose, monosaccharide; glucose, disaccharide; sucrose, trisaccharide; kestose, tetrasaccharide; nystose) contained in the reaction solution. And other sugars).
  • the ratio of each sugar was calculated as an area percentage as the ratio of the area of each peak to the total area of all detected peaks.
  • the amount of kestose and nystose was calculated by multiplying the mass of sucrose contained in the reaction solution at the start of the enzyme reaction by the respective ratio of kestose and nystose. The results are shown in Table 2.
  • thai recombination vector As shown in Table 2, thai recombination vector, thai (H321R) recombination vector, thai (H321K) recombination vector, thai (H321E) recombination vector, thai (H321G) recombination vector and thai (H321S) recombination
  • kestose was confirmed in any of the recombinant E. coli reaction solutions into which the vector was introduced. *
  • the amount of nystose was 8.8 mg in the reaction solution of the recombinant Escherichia coli introduced with the thai recombinant vector, whereas the amount of thai (H321R) recombinant vector, thai (H321K) recombinant vector, thai ( In the reaction solution of recombinant Escherichia coli introduced with H321E) recombinant vector, thai (H321G) recombinant vector, and thai (H321S) recombinant vector, 2.8 mg, 1.7 mg, 0.2 mg, 0.1 mg and 0.9 mg.
  • the ratio of nystose was 7.4% in the reaction solution of recombinant Escherichia coli into which the thai recombinant vector was introduced, whereas the thai (H321R) recombinant vector, the thai (H321K) recombinant vector, the thai In the reaction solution of recombinant Escherichia coli introduced with the (H321E) recombinant vector, the thai (H321G) recombinant vector and the thai (H321S) recombinant vector, 2.3%, 1.4%, 0.2%, 0.1% and 0.7%.
  • Example 3 Evaluation of improved ⁇ -fructofuranosidase; examination during long-time reaction Among the recombinant E. coli of Example 1 (4), recombinant E. coli and thai (H321R) into which the thai recombinant vector was introduced Using recombinant Escherichia coli introduced with the recombinant vector, the enzyme reaction of ⁇ -fructofuranosidase is performed by the method described in Example 2 (1), and the enzyme reaction is generated by the method described in Example 2 (2). The thing was confirmed. However, the enzyme reaction time was 96 hours instead of 20 hours, and the enzyme reaction product was confirmed at 16, 20, 24, 48, 72 and 96 hours. The results are shown in Table 3.
  • the amount of nystose increased from 1.8 mg to 1.4 mg as the enzymatic reaction time increased from 16 hours to 96 hours. The amount was slightly reduced from 11.1 mg to 8.8 mg.
  • the amount of nystose increased from 0.1 mg to 1.1 mg, as the enzymatic reaction time increased from 16 hours to 96 hours. The amount increased from 6.4 mg to 9.7 mg.
  • the amount of nystose increased from 0.1 mg to 0.2 mg as the enzymatic reaction time increased from 16 hours to 96 hours. The amount increased from 3.2 mg to 4.3 mg.
  • the amount of nystose was increased from 0.8 mg to 1.5 mg as the enzymatic reaction time increased from 16 hours to 96 hours. The amount increased from 8.5 mg to 9.6 mg.
  • the reaction solution of the recombinant Escherichia coli introduced with the thai recombinant vector, the thai (H321R) recombinant vector, the thai (H321K) recombinant vector, and the thai (H321E) recombinant vector The ratio of sucrose was almost unchanged between the reaction solution of recombinant Escherichia coli introduced with the thai (H321S) recombinant vector.
  • a reaction solution of recombinant Escherichia coli introduced with the thai recombinant vector and the thai (H321R) recombinant vector, the thai (H321K) recombinant vector, the thai (H321E) recombinant vector, and the thai (H321S) recombinant vector were introduced. It was revealed that the degradation activity against sucrose was almost the same in the reaction solution of recombinant E. coli.
  • ⁇ Example 4> G Preparation and evaluation of improved ⁇ -fructofuranosidase in ⁇ -fructofuranosidase homologous to thati-derived wild-type ⁇ -fructofuranosidase Extracting ⁇ -fructofuranosidase (NCBI WP — 026199939.1) of Acetobacter acetici (NBRC14818) as ⁇ -fructofuranosidase having an amino acid sequence having 68% identity with that of wild type ⁇ -fructofuranosidase derived from thai This was used as an evaluation target enzyme.
  • a recombinant vector into which wild-type ⁇ -fructofuranosidase was inserted and an improved ⁇ -fructofuranosidase were inserted according to the method described in Example 1 (1) to (4).
  • Recombinant Escherichia coli into which the recombinant vector was introduced was obtained.
  • G The location corresponding to the 321st histidine (H) from the N-terminus in the amino acid sequence of thai-derived wild-type ⁇ -fructofuranosidase uses the ClustalW method (http://www.genome.jp/tools/clustalw/). And identified by performing alignment.
  • nystose and kestose decreased significantly in the reaction solution of recombinant Escherichia coli introduced with a recombinant vector inserted with wild-type ⁇ -fructofuranosidase, Nistose and kestose were hardly reduced in the reaction solution of the recombinant Escherichia coli introduced with the recombinant vector into which the improved ⁇ -fructofuranosidase was inserted.
  • the amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase consisting of an amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of wild-type ⁇ -fructofuranosidase derived from thai is G.

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Abstract

【課題】　ニストースの生成を抑制しつつケストースを生成し、また、オリゴ糖の分解を抑制しつつスクロースを分解できる改良型β－フルクトフラノシダーゼを提供する。 【解決手段】　下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる改良型β－フルクトフラノシダーゼ；（ａ）配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ－フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。

Description

改良型β－フルクトフラノシダーゼ
　本発明は、改良型β－フルクトフラノシダーゼに関し、特に、ニストースの生成を抑制しつつケストースを生成し、また、オリゴ糖の分解を抑制しつつスクロースを分解できる改良型β－フルクトフラノシダーゼ、そのアミノ酸配列を含むポリペプチド、改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組換えベクター、当該ＤＮＡまたは当該組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体および改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法に関する。
　β－フルクトフラノシダーゼは、末端にフルクトース残基を含む糖質のフルクトースを認識して、加水分解する酵素である。β－フルクトフラノシダーゼの中には、加水分解活性に加えて、加水分解によって生じたフルクトースを基質に転移させるフルクトース転移活性を有するものも存在する。そのようなβ－フルクトフラノシダーゼによれば、スクロースを基質として、１分子のグルコースと２分子のフルクトースとが結合した３糖であるケストースを生成することができる。
　ケストースの中でも１－ケストースは、スクロース（砂糖）と似た甘味質であり、砂糖の三分の一程度の甘さを生じる一方で、砂糖の約半分のカロリーであること、摂取しても血糖値を上昇させにくいこと、アレルギー抑制機能を奏すること（特許文献１）などから、有用なオリゴ糖であることが知られている。１－ケストースを生成するβ－フルクトフラノシダーゼとしては、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のβ－フルクトフラノシダーゼおよびそのアミノ酸配列にアミノ酸変異を導入した変異体のβ－フルクトフラノシダーゼが開示されている（特許文献２）。　
特許第４１６２１４７号公報 特許第３６２８３３６号公報
　スクロースを基質とし、β－フルクトフラノシダーゼを用いてケストースを製造する際には、通常、副生成物として４糖のニストースが生成する。ニストースはクロマトグラフィーにおいてケストースとの分離が困難であり、クロマトグラフィーによる分離精製工程を経ても反応液中に残存し易い。また、液中に存在する一定量以上のニストースは、晶析工程でのケストースの結晶化を阻害する。これらのことから、高純度のケストース溶液を製造し、ケストース結晶を効率的に製造するためには、ニストースの生成を低減させることが必要である。
　また、反応液中に残存した基質のスクロースも、クロマトグラフィーによるケストースの分離精製工程においてケストースの回収率を低下させる要因であり、スクロースを特異的に分解して単糖にすることにより、当該回収率を上げることができる。このことから、クロマトグラフィーによる分離精製工程を効率化して高純度のケストース溶液を製造し、ケストース結晶を効率的に製造するためには、ケストースの分解を抑制しつつスクロースを特異的に分解することが必要である。
　以上のことから、ニストースの生成を抑制しつつケストースを生成できるβ－フルクトフラノシダーゼや、ケストースの分解を抑制しつつスクロースを分解できるβ－フルクトフラノシダーゼが求められている。
　本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、ニストースの生成を抑制しつつケストースを生成し、ケストースなどのオリゴ糖の分解を抑制しつつスクロースを分解できる改良型β－フルクトフラノシダーゼ、そのアミノ酸配列を含むポリペプチド、改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組換えベクター、当該ＤＮＡまたは当該組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体および改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ ＮＢＲＣ３２５５（以下、「Ｇ．ｔｈａｉ」と略記する。）由来野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）を、ヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入することにより、ニストースの生成を抑制しつつケストースを生成できること、および、ケストースなどのオリゴ糖の分解を抑制しつつスクロースを分解できることを見出し、これらの知見に基づいて、下記の各発明を完成した。
（１）本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼの一態様は、配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、アラインメントで前記配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のＮ末端から３２１番目の位置に相当するヒスチジン（Ｈ）を、ヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる。
（２）本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼのもう一つの態様は、下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる；（ａ）配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ－フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。
（３）本発明に係るポリペプチドは、（１）または（２）に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含む。
（４）本発明に係るＤＮＡは、（１）または（２）に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードする。
（５）本発明に係る組換えベクターは、（４）に記載のＤＮＡを含む。
（６）本発明に係る形質転換体は、（４）に記載のＤＮＡまたは（５）に記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる、形質転換体である。
（７）本発明に係る形質転換体において、（４）に記載のＤＮＡまたは（５）に記載の組換えベクターを導入する宿主は大腸菌であってもよい。
（８）本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法は、（６）または（７）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から改良型β－フルクトフラノシダーゼを取得する工程を有する。
　本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼや本発明に係る形質転換体によれば、ニストースの生成を抑制しつつケストースを生成し、また、ケストースの分解を抑制しつつスクロースを分解することができ、その結果、クロマトグラフィーによる分離精製工程を効率化して高純度のケストース溶液を製造し、ケストース結晶を効率的に製造することができる。また、本発明に係るポリペプチドや本発明に係るＤＮＡ、本発明に係る組換えベクター、本発明に係る形質転換体、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法によれば、ニストースの生成を抑制しつつケストースを生成し、また、ケストースなどのオリゴ糖の分解を抑制しつつスクロースを分解できる改良型β－フルクトフラノシダーゼを得ることができる。
　以下、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体および改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法について詳細に説明する。
　本発明において、「β－フルクトフラノシダーゼ」は、「フルクトシルトランスフェラーゼ」、「サッカラーゼ」、「β－Ｄ－フルクトフラノシダーゼ」、「インベルターゼ」、「インバーターゼ」または「インベルチン」と交換可能に用いられる場合がある。また、本発明における「野生型β－フルクトフラノシダーゼ」とは、遺伝子工学の手法を用いてアミノ酸変異を導入していないアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼをいい、「改良型β－フルクトフラノシダーゼ」とは、野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、１または２以上のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼをいう。
　本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼの一態様は、配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、アラインメントで配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のＮ末端から３２１番目の位置に相当するヒスチジン（Ｈ）を、ヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる。
　ここで、「タンパク質構成アミノ酸」とは、下記の表１に掲げるものをいう（生化学事典第４版；東京化学同人社発行、第５７頁、２００７年１２月）。これらのうち、本発明に係る「ヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸」として、好ましくはヒスチジン（Ｈ）以外の塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸、脂肪族アミノ酸およびヒドロキシアミノ酸を、より好ましくはアルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列とそれ以外のアミノ酸配列との同一性は、常法に従って確認することができ、例えば、ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ＪＰ／ｔｏｏｌｓ／ｆａｓｔａ／）、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.)、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｔｅｒａｔｅｄ　ＢＬＡＳＴ（ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.）などのプログラムを用いて確認することができる。なお、「同一性」とは一致性を指し、「ｉｄｅｎｔｉｔｙ」と交換可能に用いられる。
　配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列との同一性が５０％未満とならない範囲で１または複数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または付加することにより得ることができる。また、常法に従い、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＰＩＲ）、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ、ＴｒＥＭＢＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＰＲＦ）、ＧｅｎＰｅｐｔ（ＮＣＢＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ）などのアミノ酸配列データベースから、ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ＪＰ／ｔｏｏｌｓ／ｆａｓｔａ／）、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.)、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｔｅｒａｔｅｄ　ＢＬＡＳＴ（ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.）などのプログラムを用いて配列番号２のアミノ酸配列とのホモロジー検索をすることにより得ることができる。
　配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列は、細菌や酵母、カビ、植物などのいずれの生物に由来するβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列でもよい。配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列として、具体的には、例えば、配列番号２のアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列との同一性(以下、「所定の同一性」という場合がある。)が５０％未満とならない範囲で１または複数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または付加したアミノ酸配列や、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０１５０７３０５８．１；所定の同一性９９％）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｎｉ由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０２３９４４１２０．１；所定の同一性９７％）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｎｉ由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０１０５０３３９５．１；所定の同一性９６％）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＴＭＷ２．７６７由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＣＣＧ４７８４４．１；所定の同一性９６％）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＣＣＧ４７８４５．１；所定の同一性９１％）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０２６１９９９３９．１；所定の同一性６８％）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０１０６６６４３５．１；所定の同一性６８％）、Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＢＡＡ９３７２０．１；所定の同一性６７％）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍｏｒｂｉｆｅｒ由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿００８８５１８９８．１；所定の同一性６６％）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＴＭＷ２．１１９１由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＣＣＧ４７８４６．１；所定の同一性６５％）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０１１２５２４４２．１；所定の同一性６３％）などを挙げることができる。
　ここで、本発明において「配列番号２のアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列との同一性が５０％未満とならない範囲で１または複数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または付加したアミノ酸配列」という場合の、欠失、置換、挿入または付加するアミノ酸の個数は、例えば、１～２００個、１～１８０個、１～１６０個、１～１４０個、１～１２０個、１～１００個、１～８０個、好ましくは１～６０個、より好ましくは１～５０個、さらに好ましくは１～４０個、よりさらに好ましくは１～３０個を挙げることができる。
　また、本発明に係る「配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列」において、同一性の値は、５０％以上を挙げることができるほか、例えば、５５％以上、６０％以上、６５％以上、６８％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上などを挙げることができる。
　アラインメントは、「シーケンスアラインメント」や「アライメント」と呼ばれる場合があるが、同義である。本発明において、アラインメントは常法に従って行うことができ、例えば、ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ＪＰ／ｔｏｏｌｓ／ｆａｓｔａ／）、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.)、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｔｅｒａｔｅｄ　ＢＬＡＳＴ（ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｊａ／）、ＭＡＦＦＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｊａ／）などのプログラムを用いて行うことができる。
　次に、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼのもう一つの態様は、下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる；
　（ａ）配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列、
　（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ－フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。
　上記（ｂ）の「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、１～３０個、１～２０個、好ましくは１～１５個、より好ましくは１～１０個、よりさらに好ましくは１～５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を意味する。
　本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼは、野生型β－フルクトフラノシダーゼに比べ、以下（ｉ）や（ｉｉ）の特徴を有する；（ｉ）ケストースを生成することができ、かつ、ニストースが生成する量あるいは割合が小さい、（ｉｉ）酵素反応時間が長時間の場合において、ケストースやニストースなどのオリゴ糖の分解量が小さく、かつ、スクロースを分解することができる。すなわち、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼは、（ｉ）の特徴によれば、ケストース生成酵素として用いることができ、（ｉｉ）の特徴によれば、スクロース分解酵素として用いることができる。
　なお、本発明において、オリゴ糖は、３～十数個程度の単糖が結合してなる糖をいい、「少糖」、「寡糖」と交換可能に用いられる。
　本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼは、常法に従って得ることができ、そのような方法としては、例えば、化学合成する方法や、遺伝子組換え技術による方法を挙げることができる。化学合成する方法では、例えば、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列情報に基づいて、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法に従って本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼを合成することができる他、各種の市販のペプチド合成機を利用して合成することもできる。
　また、遺伝子組換え技術による方法では、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼを好適な発現系にて発現させることにより、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼを得ることができる。すなわち、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを適当な宿主に導入して形質転換体を得る。あるいは、後述する実施例１に示すように、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを、適当なベクターに挿入して組換えベクターを得た後、その組換えベクターを適当な宿主に導入して形質転換体を得る。そして、得られた形質転換体を培養して改良型β－フルクトフラノシダーゼを発現させることにより、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼを得ることができる。
　ここで、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡは、その塩基酸配列情報に基づいて、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて合成することができるほか、野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡや改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより得ることができる。
　例えば、アミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを得る場合は、後述する実施例１に示すように、まず、導入するアミノ酸変異をコードするＤＮＡプライマーを設計し、そのＤＮＡプライマーを用いて、野生型β－フルクトフラノシダーゼまたは当該アミノ酸変異を導入していない改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことにより、当該アミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを得ることができる。
　また、上記（ｂ）の、アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなる改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡもまた、ＰＣＲにより得ることができる。すなわち、まず、アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加された箇所に相当するアミノ酸配列をコードするＤＮＡプライマーを設計し、そのＤＮＡプライマーを用いて、アミノ酸配列（ａ）をコードするＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことにより、当該アミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加がされたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを得ることができる。
　本発明において、あるタンパク質がβ－フルクトフラノシダーゼ活性を有するか否かは、常法に従い確認することができ、例えば、後述する実施例２（１）に示すように、当該タンパク質をスクロースを含む反応液中でインキュベートし、または当該タンパク質を発現させた形質転換体をスクロースを含む反応液中で培養した後、その反応液の含有物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などにより確認する。その結果、グルコースやフルクトースなどのβ－フルクトフラノシダーゼの加水分解活性により生じた物質や、ケストースやニストースなどのβ－フルクトフラノシダーゼのフルクトース転移活性により生じた物質の存在が確認されれば、当該タンパク質はβ－フルクトフラノシダーゼ活性を有すると判断することができる。
　また、本発明は、改良型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。なお、本発明に係るポリペプチドにおいて、上述した本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
　本発明に係るポリペプチドは、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含む限り、その配列長は特に限定されず、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のみからなるものでもよく、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のアミノ末端および／またはカルボキシル末端に、１もしくは複数個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるものでもよい。また、本発明に係るポリペプチドは、上述した本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼを得る方法と同様の方法により得ることができる。
　次に、本発明は、改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを提供する。本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡにおいて、上述した本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼおよびポリペプチドと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
　また、本発明は、改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。なお、本発明に係る組換えベクターにおいて、上述した本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチドおよびＤＮＡと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
　本発明に係る組換えベクターは、例えば、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡをベクターに挿入することにより得ることができる。ＤＮＡのベクターへの挿入は、常法に従って行うことができ、例えば、ＤＮＡと線状化したベクターのＤＮＡ断片とをライゲーションすることにより行うことができる。ここで、ベクターとしては、例えば、ファージベクターやプラスミドベクター、コスミド、ファージミドなどを挙げることができ、宿主や操作性などに応じて適宜選択することができる。また、本発明に係る組換えベクターは、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡのほかに、薬剤耐性マーカー遺伝子や栄養要求マーカー遺伝子などの形質転換体の選択マーカー遺伝子、改良型β－フルクトフラノシダーゼの発現に必要なプロモーター、転写開始信号、リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号などの転写調節信号や翻訳調節信号などを含むものであってもよい。
　また、本発明は、形質転換体も提供する。なお、本発明に係る形質転換体において、上述した本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡおよび組換えベクターと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
　本発明に係る形質転換体は、改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡまたは本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを宿主に導入して得られる。ここで、宿主としては、例えば、大腸菌や枯草菌などの細菌、酵母、糸状菌などを挙げることができ、組換えベクターの種類や操作性などに応じて適宜選択することができる。ＤＮＡや組換えベクターの宿主への導入（形質転換）は常法に従って行うことができ、例えば、プラスミドを用いた組換えベクターを大腸菌に導入する場合であれば、大腸菌のコンピテントセルに組換えベクターを加えて氷上で３０分間静置し、続いて４２℃のウォーターバスに入れて４５秒間静置した後、氷上で２分間静置し、その後、培地を加えて、３７℃で１時間振とうすることにより行うことができる。また、宿主の染色体に直接目的のＤＮＡを導入するには、相同組換え法などを用いることができる。
　次に、本発明は、改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法を提供する。本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法は、本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物から改良型β－フルクトフラノシダーゼを取得する工程を有する。なお、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法において、上述した本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクターおよび形質転換体と同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
　本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物から改良型β－フルクトフラノシダーゼを取得する工程において、改良型β－フルクトフラノシダーゼを取得する方法は、形質転換体の態様などに応じて適宜選択することができる。具体的には、形質転換体を培養して得られる培養物をそのまま改良型β－フルクトフラノシダーゼとして取得してもよく、培養物から改良型β－フルクトフラノシダーゼを精製して取得してもよい。
　形質転換体を培養して得られる培養物をそのまま改良型β－フルクトフラノシダーゼとして取得する方法としては、例えば、改良型β－フルクトフラノシダーゼが形質転換体の細胞表面あるいは細胞内部に発現されるようにＤＮＡあるいは組換えベクターを設計した場合は、培養物を遠心分離に供して形質転換体を回収し、これをそのまま改良型βフルクトフラノシダーゼとして取得する方法や、回収した形質転換体を破砕して、これを改良型β－フルクトフラノシダーゼとして取得する方法を挙げることができる。
　培養物から改良型β－フルクトフラノシダーゼを精製する方法としては、例えば、改良型β－フルクトフラノシダーゼが形質転換体の外部に分泌されるようにＤＮＡあるいは組換えベクターを設計した場合は、培養物を遠心分離に供して培養上清を回収することにより改良型β－フルクトフラノシダーゼを精製することができる。また、改良型β－フルクトフラノシダーゼが形質転換体の内部に発現される場合は、培養物を遠心分離に供して沈殿させた形質転換体を回収し、これを、緩衝液中に懸濁、凍結融解、超音波処理または磨砕するなどして形質転換体を破砕した後、遠心分離に供して上清を回収することにより改良型β－フルクトフラノシダーゼを精製することができる。その他、精製する方法としては、培養物を熱処理、塩沈澱、溶媒沈澱、透析、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動などに供する方法を挙げることができる。
　最後に、本発明は、ケストースの製造方法を提供する。本発明に係るケストースの製造方法は、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼ、本発明に係る形質転換体または本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させる工程を有する。なお、本発明に係るケストースの製造方法において、上述した本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体および改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法と同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
　なお、ケストースは、通常、スクロースにフルクトースが結合して生成し、フルクトースが結合する位置により、１－ケストース、６－ケストースおよびネオケストースの３種類が生じうる。すなわち、１－ケストースはフルクトースがスクロース中のフルクトース単位にβ（２→１）結合して生成し、６－ケストースはフルクトースがスクロース中のフルクトース単位にβ（２→６）結合して生成し、ネオケストースはフルクトースがスクロース中のグルコース単位にβ（２→６）結合して生成する。また、ニストースは、フルクトースが１－ケストース中のフルクトース単位にβ（２→１）結合して生成する４糖である。
　本発明における「ケストース」とは、１分子のグルコースと２分子のフルクトースとが結合した３糖を意味し、１－ケストース、６－ケストースおよびネオケストースを包含する。
　本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼとスクロースとを接触させる方法としては、例えば、改良型β－フルクトフラノシダーゼをスクロースを含む溶液に添加し、３０℃～５０℃で２０時間程度静置する方法を挙げることができる。また、本発明に係る形質転換体とスクロースとを接触させる方法としては、例えば、宿主が大腸菌の場合は、本発明に係る形質転換体をスクロースを含む溶液に添加し、５０℃で数日間振盪培養する方法を挙げることができる。
　また、本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させる方法としては、例えば、本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物をスクロースを含む溶液に添加し、３０℃～５０℃で２０時間程度静置あるいは振盪する方法を挙げることができる。ここで、培養物は、破砕、磨砕、緩衝液への懸濁、凍結融解、超音波処理、遠心分離、熱処理、塩沈澱、溶媒沈澱、透析、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの何らかの処理に供したものでもよく、処理に供していないものでもよい。
　本発明に係るケストースの製造方法には、本発明に係るケストースの製造方法の特徴を損なわない限り、他の工程を有してもよく、例えば、クロマトグラフィーによるケストースの分離工程や煎糖などの結晶化工程、乾燥工程、洗浄工程、濾過工程、殺菌工程、食品添加物を添加する工程などを有してもよい。
　以下、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法およびケストースの製造方法について、各実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
＜実施例１＞ 改良型β－フルクトフラノシダーゼの作成
　Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ ＮＢＲＣ３２５５（以下、「Ｇ．ｔｈａｉ」と略記する。）の野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿００７２８１７７４；配列番号２）のうち、Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）を、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）またはセリン（Ｓ）に置換するアミノ酸変異（以下、それぞれのアミノ酸変異を「Ｈ３２１Ｒ」「Ｈ３２１Ｋ」「Ｈ３２１Ｅ」「Ｈ３２１Ｇ」「Ｈ３２１Ｓ」と略記する。）を導入したアミノ酸配列からなる変異体のβ－フルクトフラノシダーゼを作成し、これらを改良型β－フルクトフラノシダーゼとした。具体的な手順を以下に示す。
（１）Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの取得
　まず、Ｇ．ｔｈａｉのゲノムＤＮＡを常法に従って抽出した。続いて、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの全長の塩基配列（ＮＣＢＩ_ＧＩ：４５９０１８８７７；配列番号１）を基に、下記の配列番号３および配列番号４のプライマーを設計し、下記の条件でポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行うことにより、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片１とした。
《Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；Ｇ．ｔｈａｉのゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー；５’－ＡＡＡＴＣＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＣＧ－３’（配列番号３）
リバースプライマー；５’－ＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＡＣＧＴＣＡＴＡＧ－３’（配列番号４）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（東洋紡社）
反応条件；９８℃で１０秒、６８℃で１分３０秒を１サイクルとして４５サイクル。
（２）Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターの作成
　下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＩＡＭ１０２６、ＡＴＣＣ９４６６）のＰｇｓＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０１６２４５．１）をコードするＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ産物を常法に従って制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、これをＤＮＡ断片２とした。また、ＤＮＡ断片２について、常法に従ってシークエンスを行い、ＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を確認した。確認したＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号５に、それにコードされるＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６にそれぞれ示す。
《ＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＩＡＭ１０２６、ＡＴＣＣ９４６６）のゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー（下線はＮｄｅＩサイトを示す）５’－ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧ－３’（配列番号７）
リバースプライマー（下線はＢｇｌＩＩサイトを示す）；５’－ＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧ－３’（配列番号８）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡社）
反応条件；９５℃で１０秒、６０℃で２０秒および６８℃で２分を１サイクルとして３０サイクル。
　続いて、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いてｐＣＤＦＤｕｅｔ－１プラスミド（Ｍｅｒｃｋ社）を消化した後、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）を用いて、添付の使用書に従いＤＮＡ断片２を挿入し、これをｐＣＤＦ－ｐｇｓＡ組換えベクターとした。その後、下記の条件でＰＣＲを行うことによりｐＣＤＦ－ｐｇｓＡ組換えベクターのＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片３とした。
《ｐＣＤＦ－ＰｇｓＡ組換えベクターのＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；ｐＣＤＦ－ｐｇｓＡ組換えベクター
フォワードプライマー；５’－ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＡ－３’(配列番号９)
リバースプライマー；５’－ ＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧＡＴＣＡＡ－３‘(配列番号１０)
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ(東洋紡社)
反応条件；９８℃で１０秒、６８℃で２分２５秒を１サイクルとして２５サイクル。
　次に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてＤＮＡ断片１およびＤＮＡ断片３を連結することにより、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを作成し、これをｔｈａｉ組換えベクターとした。
（３）改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターの作成
　本実施例１（２）のｔｈａｉ組換えベクターを鋳型として、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、「Ｈ３２１Ｒ」、「Ｈ３２１Ｋ」、「Ｈ３２１Ｅ」、「Ｈ３２１Ｇ」および「Ｈ３２１Ｓ」を導入した改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅した。
《改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
　「Ｈ３２１Ｒ」
フォワードプライマー；５’－ＣＧＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣ－３’（配列番号１１）
リバースプライマー；５’－ＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＡＧＧＴＣＡＧＡＣ－３’（配列番号１２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ＮＥＯ
反応条件；９８℃で１０秒、５８℃で３０秒および６８℃で３分を１サイクルとして２５サイクル。
　「Ｈ３２１Ｋ」
フォワードプライマー；５’－ＡＡＡＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣ－３’（配列番号１３）
リバースプライマー；５’－ＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＡＧＧＴＣＡＧＡＣ－３’（配列番号１２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ
反応条件；９８℃で１０秒、６５℃で１５秒および７２℃で３分を１サイクルとして２５サイクル。
　「Ｈ３２１Ｅ」
フォワードプライマー；５’－ＧＡＡＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣ－３’（配列番号１４）
リバースプライマー；５’－ＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＡＧＧＴＣＡＧＡＣ－３’（配列番号１２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ
反応条件；９８℃で１０秒、６５℃で１５秒および７２℃で３分を１サイクルとして２５サイクル。
　「Ｈ３２１Ｇ」
フォワードプライマー；５’－ＧＧＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣ－３’（配列番号１５）
リバースプライマー；５’－ＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＡＧＧＴＣＡＧＡＣ－３’（配列番号１２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ
反応条件；９８℃で１０秒、６５℃で１５秒および７２℃で３分を１サイクルとして２５サイクル。
　「Ｈ３２１Ｓ」
フォワードプライマー；５’－ＴＣＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣ－３’（配列番号１６）
リバースプライマー；５’－ＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＡＧＧＴＣＡＧＡＣ－３’（配列番号１２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ
反応条件；９８℃で１０秒、６５℃で１５秒および７２℃で３分を１サイクルとして２５サイクル。
　得られたＰＣＲ産物に制限酵素ＤｐｎＩを加えて３７℃で１時間消化した後、アガロースゲル電気泳動に供してゲルを切り出して、ＤＮＡ断片を精製した。これに、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈｖｅｒ．２（東洋紡社）およびＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡社）を加えて１６℃で１時間静置することによりＤＮＡ断片のセルフライゲーションを行い、改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを作成した。「Ｈ３２１Ｒ」、「Ｈ３２１Ｋ」、「Ｈ３２１Ｅ」、「Ｈ３２１Ｇ」および「Ｈ３２１Ｓ」を導入した改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを、それぞれｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターとした。
（４）形質転換および形質転換体の培養と回収
　本実施例１（２）のｔｈａｉ組換えベクターならびに本実施例１（３）のｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセルに導入して、組換え大腸菌を回収した。続いて、組換え大腸菌から組換えベクターを回収し、これを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（コスモバイオ社）に導入して、形質転換体として組換え大腸菌を得た。これを３０℃で一晩プレート培養した後、組換え大腸菌のクローンをピックアップしてＭ９ ＳＥＥＤ培地０．５ｍＬに植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで２０時間振盪培養した。続いて、培養物のうち５μＬをＭ９ Ｍａｉｎ培地５ｍＬに植え継ぎ、２５℃、２２０ｒｐｍで２４時間振盪培養した。その後、培養物を３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより組換え大腸菌を集菌した。Ｍ９ ＳＥＥＤ培地およびＭ９ Ｍａｉｎ培地の組成を以下に示す。
　Ｍ９ ＳＥＥＤ培地（計１００ｍＬ）；水　７２ｍＬ、５×Ｍ９塩　２０ｍＬ、２０％　カザミノ酸　５ｍＬ、２０％ Ｄ－グルコース　２ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ チミン　１ｍＬ、５０ｍＭ　ＣａＣｌ２　０．２ｍＬ、２．５Ｍ　ＭｇＣｌ２　４０μＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ＦｅＳＯ４　２８μＬ、抗生物質（終濃度５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン）。
　Ｍ９ Ｍａｉｎ培地（計１００ｍＬ）；水　６７ｍＬ、５×Ｍ９塩　２０ｍＬ、２０％　カザミノ酸　５ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ チミン　１ｍＬ、５０ｍＭ　ＣａＣｌ２　０．２ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ＦｅＳＯ４　２８μＬ、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １（Ｏ．Ｎ．Ｅ．；Ｍｅｒｃｋ社）Ｓｏｌ．１　２ｍＬ、Ｏ．Ｎ．Ｅ．Ｓｏｌ．２　５ｍＬ、Ｏ．Ｎ．Ｅ．Ｓｏｌ．３　１００μＬ、抗生物質（終濃度５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン）。
＜実施例２＞ 改良型β－フルクトフラノシダーゼの評価；アミノ酸変異の検討
（１）β－フルクトフラノシダーゼの酵素反応
　３０（ｗ／ｗ）％のスクロースを含む０．０４Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を調製し、これを３０％スクロース溶液とした。実施例１（４）の組換え大腸菌の集菌体０．５ｍＬを用意し、湿重量を測定した。ここに、３０％スクロース溶液３５０μＬを加えて懸濁した後、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪することによりβ－フルクトフラノシダーゼの酵素反応を行い、これを反応液とした。
（２）酵素反応生成物の確認
　続いて、反応液５０μＬに水９５０μＬを加えることにより希釈し、１００℃で１０分間加熱した。これを４℃、１５０００×ｇで１０分間遠心分離に供して上清を回収した後、０．４５μｍ孔フィルターで濾過して、得られた濾液をＨＰＬＣサンプルとした。ＨＰＬＣサンプルを下記の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供して、反応液に含まれる各糖（単糖；フルクトース、単糖；グルコース、２糖；スクロース、３糖；ケストース、４糖；ニストースおよびその他の糖）の割合を確認した。各糖の割合は、検出された全ピークの面積の総和に対する各ピークの面積の割合として、面積百分率で算出した。また、ケストースおよびニストースの量は、酵素反応開始時の反応液に含まれていたスクロースの質量にケストースおよびニストースのそれぞれの割合を乗じて算出した。その結果を表２に示す。
　《ＨＰＬＣの条件》
カラム；ＳＨＯＤＥＸ ＫＳ ８０２(８.０φ×３００ｍｍ)　２本
移動相；水
流速　；１．０ｍＬ／ｍｉｎ
注入量；２０μＬ
温度　；５０℃
検出　；示差屈折率検出器（ＲＩＤ；昭和電工社）（ピーク面積を用いた面積百分率）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、ｔｈａｉ組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液のいずれにおいても、ケストースの存在が確認された。　　
　そして、ニストースの量は、ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では８．８ｍｇであったのに対して、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、それぞれ、２．８ｍｇ、１．７ｍｇ、０．２ｍｇ、０．１ｍｇおよび０．９ｍｇであった。また、ニストースの割合は、ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では７．４％であったのに対して、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、それぞれ、２．３％、１．４％、０．２％、０．１％および０．７％であった。
　すなわち、ｔｈａｉ組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液のいずれにおいてもケストースが生成する一方で、ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液と比較して、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、ニストースの量および割合が顕著に低下した。
　これらの結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）を、ヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入することにより、ニストースの生成を抑制しつつ、ケストースなどの有用なオリゴ糖を生成できることが明らかになった。
＜実施例３＞ 改良型β－フルクトフラノシダーゼの評価；長時間反応時の検討
　実施例１（４）の組換え大腸菌のうち、ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌およびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌を用いて、実施例２（１）に記載の方法によりβ－フルクトフラノシダーゼの酵素反応を行い、実施例２（２）に記載の方法により酵素反応生成物の確認を行った。ただし、酵素反応の時間は２０時間に代えて９６時間とし、酵素反応生成物の確認は１６、２０、２４、４８、７２および９６時間において行った。その結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、酵素反応の時間が１６時間から９６時間へと長くなるにつれて、ニストースの量が８．７ｍｇから５．６ｍｇ、ケストースの量が１７．５ｍｇから１０．３ｍｇと顕著に小さくなった。
　これに対して、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、酵素反応の時間が１６時間から９６時間へと長くなるにつれて、ニストースの量が２．８ｍｇから１．７ｍｇ、ケストースの量が８．６ｍｇから７．２ｍｇと僅かに小さくなった。
　また、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、酵素反応の時間が１６時間から９６時間へと長くなるにつれて、ニストースの量が１．８ｍｇから１．４ｍｇ、ケストースの量が１１．１ｍｇから８．８ｍｇと僅かに小さくなった。
　また、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、酵素反応の時間が１６時間から９６時間へと長くなるにつれて、ニストースの量が０．１ｍｇから１．１ｍｇ、ケストースの量が６．４ｍｇから９．７ｍｇと大きくなった。
　また、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、酵素反応の時間が１６時間から９６時間へと長くなるにつれて、ニストースの量が０．１ｍｇから０．２ｍｇ、ケストースの量が３．２ｍｇから４．３ｍｇと大きくなった。
　また、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、酵素反応の時間が１６時間から９６時間へと長くなるにつれて、ニストースの量が０．８ｍｇから１．５ｍｇ、ケストースの量が８．５ｍｇから９．６ｍｇと大きくなった。
　すなわち、酵素反応の時間が長くなるに伴い、ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液ではニストースやケストースが顕著に減少したのに対してｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液ではニストースやケストースがほとんど減少しなかった。このことから、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、酵素反応により生成したケストースやニストースの分解が顕著に抑制されたことが明らかになった。
　その一方で、酵素反応の時間が９６時間において、ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液とｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液とで、スクロースの割合はほとんど変わらなかった。すなわち、ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液とｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液とで、スクロースに対する分解活性はほぼ同等であることが明らかになった。
　これらの結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）を、ヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入することにより、ケストースやニストースなどのオリゴ糖の分解を抑制しつつ、スクロースを分解できることが明らかになった。
＜実施例４＞Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼと相同なβ－フルクトフラノシダーゼにおける改良型β－フルクトフラノシダーゼの作成と評価
　Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼと６８％の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼとして、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ（ＮＢＲＣ１４８１８）のβ－フルクトフラノシダーゼ（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０２６１９９９３９．１）を抽出し、これを評価対象酵素とした。評価対象酵素について、実施例１（１）～（４）に記載の方法に準じて、野生型β－フルクトフラノシダーゼが挿入された組換えベクターおよび改良型β－フルクトフラノシダーゼが挿入された組換えベクターを導入した組換え大腸菌を得た。なお、評価対象酵素のアミノ酸配列において、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列におけるＮ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）に相当する箇所は、ＣｌｕｓｔａｌＷ法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）を用いてアラインメントを行うことにより特定した。
　続いて、実施例３に記載の方法によりβ－フルクトフラノシダーゼの酵素反応および酵素反応生成物の確認を行った。その結果、改良型β－フルクトフラノシダーゼが挿入された組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液において、野生型β－フルクトフラノシダーゼが挿入された組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液と比較して、ニストースの量および割合が低かった。また、酵素反応の時間が長くなるに伴い、野生型β－フルクトフラノシダーゼが挿入された組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液ではニストースやケストースが顕著に減少したのに対して、改良型β－フルクトフラノシダーゼが挿入された組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液ではニストースやケストースがほとんど減少しなかった。
　これらの結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、アラインメントでＧ．ｔｈａｉ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）におけるＮ末端から３２１番目の位置に相当するヒスチジン（Ｈ）を、ヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入することにより、ニストースの生成を抑制しつつケストースなどの有用なオリゴ糖を生成し、また、オリゴ糖の分解を抑制しつつスクロースを分解できる改良型β－フルクトフラノシダーゼを得ることができることが明らかになった。

Claims (8)

  1. 　配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、アラインメントで前記配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のＮ末端から３２１番目の位置に相当するヒスチジン（Ｈ）を、ヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる改良型β－フルクトフラノシダーゼ。
  2. 　下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる改良型β－フルクトフラノシダーゼ；
    （ａ）配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）を、ヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列、
    （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ－フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。
  3. 　請求項１または請求項２に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  4. 　請求項１または請求項２に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ。
  5. 　請求項４に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
  6. 　請求項４に記載のＤＮＡまたは請求項５に記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる、形質転換体。
  7. 　宿主が大腸菌である、請求項６に記載の形質転換体。
  8. 　請求項６または請求項７に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から改良型β－フルクトフラノシダーゼを取得する工程を有する改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法。
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