KR102402632B1 - 케스토스-함유 프락토올리고당 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 케스토스-함유 프락토올리고당의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 케스토스 함유량이 높고 저장안정성이 우수한 케스토스-함유 프락토올리고당의 제조방법에 관한 것이다.

Description

케스토스-함유 프락토올리고당 제조방법{A method of preparing fructooligosaccharides comprising kestose}
본 발명은 저장 안정성이 향상된 고순도 케스토스-함유 프락토올리고당의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고순도 케스토스-함유 프락토올리고당 제조 후 정제공정을 수행하여, 케스토스의 저장 안정성을 향상시키는 것을 특징으로 하는 제조방법에 관한 것이다.
프락토올리고당은 설탕에 1개 이상의 과당이 연쇄적으로 부가된 올리고당류이며, 그 결합양식은 설탕의 과당 잔기 부분에 있어서의 1번 탄소에 부가되는 과당의 2번 탄소가 결합해서 반복되는 것이다. 프락토올리고당의 종류로는 설탕 (수크로스)에 과당 1 내지 3분자가 β-(2>1)결합하여, 1-케스토스(Kestose, GF2), 니스토스(Nystose, GF3) 및 1-F-프락토퓨라노실니스토스(1-F-Fructosyl nystose, GF4) 등이 있다.
프락토올리고당은 바나나, 양파, 아스파라거스, 우엉, 마늘, 벌꿀, 치커리 뿌리 등과 같은 야채나 버섯, 과일류에 함유되어 있는 천연 물질로서 이미 섭취 역사가 오랜 물질이다. 프락토올리고당은 설탕으로부터 생성된 성분으로서 그 구조도 설탕과 유사하여 두 물질의 물리화학적 특성이 유사하게 나타난다. 하지만, 프락토올리고당은 설탕과 달리 난소화성이므로 그 생리적인 특성은 매우 다르다. 특히, 프락토올리고당은 장내 유익균에 의해 대사되어 다양한 건강 기능성을 나타낸다는 것이 입증되어, 일본에서는 프락토올리고당 함유 제품을 장의 상태를 조절하는 식품과 미네랄의 흡수를 촉진시키는 식품으로 인정하여 특정 보건용 식품으로 분류한 바 있다.
프락토올리고당 중, 특히 1-케스토스의 면역 글로불린 A(IgA) 항체의 증강 작용 및 면역 글로불린 E(IgE) 항체의 산생 억제 작용, 장 내 비피더스균의 증식 활성 작용 및 유아의 아토피성 피부염의 개선성에 대해서 사람 시험에 의해 확인되었으며, 1-케스토스를 이용한 알레르기 억제 조성물, 알레르기 억제 식품 및 알레르기 억제제로서 사용하기 위하여 1-케스토스를 효율적으로 생산하는 것이 산업적으로 요구되고 있다.
그러나, 1-케스토스를 다량 함유하는 프락토올리고당을 생산하는 경우, 1-케스토스와 함께 전환되는 니스토스 (GF3) 또는 1-F-프락토퓨라노실니스토스 (GF4)는 1-케스토스와 물리적 특성이 유사하여, 이들을 분리 및 정제하기 매우 까다로우며, 이에 산업적으로 효율적인 대량을 하기 위해서는 부산물인 니스토스 또는 1-F-프락토퓨라노실니스토스 보다 1-케스토스를 선택적으로 과량 전환하는 효소 또는 이러한 효소를 갖는 균주를 개량하여 효율적인 1-케스토스를 생산하는 방법이 요구된다.
설탕으로부터 프락토올리고당을 생산하는 효소인 곰팡이 유래의 프락토푸라노시다제는 전이 활성이 높고 이성체의 생성이 적은 특징을 갖지만, 1-케스토스 밖에 생성하지 않는 식물 유래의 설탕(수크로스):수크로스 프락토실 트랜스퍼라제(SST) 만큼 올리고당의 생성 선택성은 높지 않고, 중합도 2~6의 올리고당류의 혼합물 밖에 제조할 수 없다. 따라서, 프락토올리고당은 액체 혹은 분말로서 이용되고 있으며, 이들은 비결정성의 혼합물이기 때문에 설탕 등의 결정성의 식품 재료와 비교하면 습기 흡수성이 높고, 가공 적성이 떨어지는 등의 문제점이 있다.
고순도 당분리 및 정제를 통해서 단일 올리고당 성분을 주성분으로 하는 결정성 프락토올리고당, 예를 들면 1-케스토스(3당류, GF2), 니스토스(4당류, GF3)등을 얻을 수 있는 기술이 있으나, 프락토올리고당의 제조에 이용되고 있는 효소의 1-케스토스의 최대 전환율은 약 30%이며, 반응 생성물 안에는 부생성물인 니스토스가 약 25%, 기질인 설탕(수크로스)이 약 15% 포함되어 있기 때문에, 보다 고함량의 1-케스토스를 산업적으로 생산하기 위해 효율적으로 얻을 수 있는 프락토푸라노시다제가 여전히 요구되고 있다. 다시 말해서, 1-케스토스의 생성 선택성이 높고, 전이 반응 생성물인 올리고당의 조성이 개선된 프락토올리고당의 제조에 필요한 프락토푸라노시다제 또는 변이주를 사용해야 한다. 또한, 이러한 1-케스토스 고생산 능력을 갖는 돌연변이를 통해 얻을 수 있는 최대 전환율은 약 58%의 케스토스이다.
1-케스토스를 섭취하여 얻을 수 있는 기능성 중 하나인 유아의 아토피성 피부염 개선 효과를 위해서는 케스토스 100% 기준으로 2.5g을 1개월 이상 섭취해야 한다. 반면, 본 효소를 통해 제조한 케스토스 54% 시럽(75 중량%)을 이용할 경우에는 약 6.14g을 섭취해야 한다. 유아가 6.14g의 용량을 섭취하기에는 섭취량이 많을뿐더러, 성인의 프락토올리고당 일일 섭취 권장 기준인 2.5~15g에서 절반에 가까운 양을 유아에게 섭취 시켜야 하는 단점이 있다. 따라서 프락토올리고당 섭취량을 최소화 하면서 케스토스의 기능성을 줄 수 있는 방법으로 케스토스를 고순도로 분리하는 방법이 중요하다. 고순도 케스토스 분리 시 고함량 케스토스 시럽의 과당, 니스토스의 함유량에 따라서 고순도 케스토스에 영향을 준다. 따라서 효소 반응에서 고순도 케스토스를 분리하기에 최적인 당조성 범위를 조절할 필요가 있다.
또한 프락토올리고당은 저장 기간 중 제품의 pH가 산성화 진행되는데 프락토올리고당은 산성조건과 가열조건에서 쉽게 분해되는 특징이 있어 이를 방지하기 위해 제품에 유기염 등의 산도조절제를 첨가하고 있는 실정이다. 산도조절제와 같은 식품첨가물을 혼합하게 되면 식품의 유형은 기타올리고당으로 표시해야 한다. 이를 개선하기 위해 제품의 제조 공정을 일부 개선하여 제품의 저장 안정성을 향상 시킬 필요가 있다.
본 발명의 목적은 상기에서 언급한 종래의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 고함량 1-케스토스 85 중량% 이상의 고순도 케스토스 함유 프락토올리고당 제조를 위한 것이고, 또한 제품의 저장 안정성을 개선하여 효율적이고 경제적인 고순도 케스토스 함유 프락토올리고당 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 고함량 1-케스토스 함유 프락토올리고당의 제조 공정 중, 전환 반응을 통해 생성되는 1-케스토스와 니스토스의 함량과, 기질의 설탕(수크로스) 함량을 조절하여 고순도 케스토스 함유 당류를 분리하기 위한 최적의 당조성 범위를 고찰하는 것이고, 분리된 고순도 케스토스 함유 프락토올리고당의 이온정제 공정을 통해 저장 안정성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 고순도 케스토스는 N/GMO aspergillus niger 유래의 β- fructofuranosidase를 이용하여 제조될 수 있다. 구체적으로, 55 중량% 농도의 설탕 수용액을 기질로 하여 55℃ 온도로 가온 후, pH를 6.5 ~ 7.0 으로 1.0~4.0N 수산화나트륨 용액을 이용하여 적정 후 β- fructofuranosidase를 첨가하여 효소반응을 수행한다. 이후 케스토스 함량 45 중량% 이상으로 생성 시 pH를 7.6 이상, 일 예로 pH 8.0으로 적정한 후 80℃ 온도에서 2시간 가온하여 효소를 불활성화 한다. 이후 활성탄을 고형분 대비 0.5 % ~ 1.0% 처리하여 색가를 제거하는 여과공정을 수행한다. 여과공정을 거친 후 이온정제를 진행하는데, 일반적인 이온정제 공정은 K(양이온)-A(음이온)-MB(Mixed Bed: K:A=1:2)를 통과시키는데 반해, 본 발명의 케스토스 제조방법의 경우 K-A탑 또는 MB-A, MB-K-A, K-MB-A와 같이 A탑을 마지막에 설치하여 반응액의 pH를 높인다. 이는 제조과정 중에 케스토스, 니스토스와 같은 프락토올리고당 물질들이 분해가 되는 것을 막기 위함이다. 이후 농축을 통해 50 중량% 에서 60 중량%로 Brix를 맞춘 후 크로마토그래피 고순도 분리 공정인 SMB (simulated moving bed)를 이용하여 케스토스를 고순도로 분리한다. 이때 사용되는 수지는 Na+타입과 Ca2+타입 수지를 사용할 수 있다. 분리된 케스토스 함량은 85 중량%에서 95 중량% 까지 포함될 수 있다. 고순도 분리된 케스토스는 다시 이온정제공정을 거치며, SMB를 거쳐서 나온 고순도 케스토스의 이온탑은 A, MB-A, K-MB-A, K-A, MB-K-A 등의 정제탑을 통과하여 pH 5.0~8.0 의 pH를 가지게 된다. 이는 제품 생산 후 저장 안정성을 향상시키기 위함이다. 이후 농축 공정을 통해 75 중량%로 농축되어 제품으로 배출된다. 상황에 따라서 분말로 필요시에는 Spray Dry 또는 Conveyor Vacuume Dry를 이용하여 제조한다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 설탕을 포함하는 기질과 케스토스 전환 활성을 가지는 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 케스토스 전환 반응을 수행하는 단계를 포함하는, 케스토스-함유 프락토올리고당의 제조방법에 관한 것이다.
상기 케스토스 전환 반응을 수행하는 단계는, 케스토스를 생산하기 위해 설탕을 포함하는 기질과, 케스토스 전환 활성을 가지는 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여, 케스토스 전환 반응을 수행하는 단계이다. 이 때, 반응 기질은 설탕을 포함할 수 있으며, 설탕을 반응 기질로 하여 케스토스와 더불어 과당, 포도당, 설탕, 니스토스 (GF3), 및 프락토퓨라노실니스토스 (GF4)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이 추가적으로 생성될 수 있다.
종래 기술에 의하면, 프락토올리고당 중 니스토스 (GF3) 및/또는 1-F-프락토퓨라노실니스토스 (GF4)는 1-케스토스 (GF2)와 물리적 특징이 유사하여, 1-케스토스와 니스토스 및/또는 1-F-프락토퓨라노실니스토스를 분리 및/또는 정제하는 것이 매우 어려우나, 본 발명의 케스토스 전환 반응 단계는 선택적으로 높은 함량의 1-케스토스를 포함하는 프락토올리고당을 제조할 수 있어, 라피네이트를 분리하여 프락토올리고당 분획 수득 시 불순물인 니스토스 및/또는 프락토퓨라노실니스토스의 함량이 적고, 케스토스의 함량이 높은 프락토올리고당 분획을 분리할 수 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 케스토스-함유 프락토올리고당은 높은 1-케스토스 함량 및 낮은 니스토스 및 1-F-프락토퓨라노실니스토스 함량으로 인해 흡수성이 낮고 결정성을 갖는 특성이 있어, 보관 및 유통이 용이하다. 뿐만 아니라 장내 유익균 증식, 면역 증강, 아토피 예방 및 당뇨 예방에 효과가 우수하여 아토피 예방/면역 강화 식품의 보조제 또는 기능성 로션 등에 첨가제로, 특히 영유아 유제품 식품 등에 적용할 경우 기능성 첨가제로서 유용하게 적용될 수 있다.
상기 케스토스 전환 반응을 수행하는 단계는, 반응 기질의 당류 고형분 함량을 기준으로 설탕을 80 내지 100중량%, 80 내지 99.99중량%, 80 내지 99.9중량%, 80 내지 99중량%, 80 내지 95중량%, 80 내지 90중량%, 85 내지 100중량%, 85 내지 99.99중량%, 85 내지 99.9중량%, 85 내지 99중량%, 85 내지 95중량%, 85 내지 90중량%, 90 내지 100중량%, 90 내지 99.99중량%, 90 내지 99.9중량%, 90 내지 99중량%, 90 내지 95중량%, 95 내지 100중량%, 95 내지 99.99중량%, 95 내지 99.9중량%, 또는 95 내지 99중량% 포함하는 반응 기질을 이용하여 전환 반응하는 것일 수 있다.
상기 케스토스 전환 활성을 가지는 효소는, 설탕을 포함하는 기질로부터 케스토스를 함유하는 프락토올리고당을 전환하는 활성을 가지는 효소로, 예를 들어 아스페르길루스 니제르 (Aspergillus niger) 균주, 피키아 파리노사 (Pichia farinose) 균주, 야로이야 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 밀레로지마 파리노사 (Millerozyma farinose), 및 아스페르길루스 오리제 (Aspergillus oryzae) 균주로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 효소일 수 있다. 일예로, 기탁번호 KCTC13139BP를 가지는 아스페르길루스 니제르 SYG-K1 균주, 또는 기탁번호 KCTC13140BP를 가지는 아스페르길루스 니제르 SYG-Neo1 균주일 수 있다.
상기 케스토스 전환 활성을 가지는 효소를 생산하는 미생물은, 아스페르길루스 니제르 (Aspergillus niger) 균주, 피키아 파리노사 (Pichia farinose) 균주, 야로이야 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 밀레로지마 파리노사 (Millerozyma farinose), 및 아스페르길루스 오리제 (Aspergillus oryzae) 균주로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일예로, 기탁번호 KCTC13139BP를 가지는 아스페르길루스 니제르 SYG-K1 균주, 또는 기탁번호 KCTC13140BP를 가지는 아스페르길루스 니제르 SYG-Neo1 균주일 수 있다.
상기 케스토스 전환 반응을 수행하는 단계는 pH 6 내지 8의 pH 조건, 및/또는 40 내지 70℃의 온도 조건에서 반응하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 케스토스-함유 프락토올리고당의 제조방법은, 케스토스 전환 반응을 종결하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 종결하는 단계에 의해 케스토스 전환 반응은 종결되며, 케스토스-함유 프락토올리고당 반응물을 얻을 수 있다.
상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 단계는, pH 7.6 이상, pH 7.7 이상, pH 7.8 이상, pH 7.9 이상, 또는 pH 8 이상으로 적정하는 단계를 포함하여 상기 케스토스 전환 활성을 가지는 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 실활하는 것일 수 있다.
상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 단계는, 온도 75℃ 이상, 76℃ 이상, 77℃ 이상, 78℃ 이상, 79℃ 이상, 또는 80℃ 이상으로 가열하는 단계를 포함하여 상기 케스토스 전환 활성을 가지는 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 실활하는 것일 수 있다.
상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 단계는, 반응생성물의 당류 고형분 100중량%를 기준으로 반응생성물의 설탕 함량이 15 내지 35중량%, 15 내지 34중량%, 15 내지 33중량%, 15 내지 32중량%, 15 내지 31중량%, 15 내지 30중량%, 15 내지 29중량%, 15 내지 28중량%, 15 내지 27중량%, 15 내지 26중량%, 15 내지 25중량%, 15 내지 24중량%, 15 내지 23중량%, 15 내지 22중량%, 15 내지 21중량%, 16 내지 35중량%, 16 내지 34중량%, 16 내지 33중량%, 16 내지 32중량%, 16 내지 31중량%, 16 내지 30중량%, 16 내지 29중량%, 16 내지 28중량%, 16 내지 27중량%, 16 내지 26중량%, 16 내지 25중량%, 16 내지 24중량%, 16 내지 23중량%, 16 내지 22중량%, 16 내지 21중량%, 17 내지 35중량%, 17 내지 34중량%, 17 내지 33중량%, 17 내지 32중량%, 17 내지 31중량%, 17 내지 30중량%, 17 내지 29중량%, 17 내지 28중량%, 17 내지 27중량%, 17 내지 26중량%, 17 내지 25중량%, 17 내지 24중량%, 17 내지 23중량%, 17 내지 22중량%, 17 내지 21중량%, 18 내지 35중량%, 18 내지 34중량%, 18 내지 33중량%, 18 내지 32중량%, 18 내지 31중량%, 18 내지 30중량%, 18 내지 29중량%, 18 내지 28중량%, 18 내지 27중량%, 18 내지 26중량%, 18 내지 25중량%, 18 내지 24중량%, 18 내지 23중량%, 18 내지 22중량%, 18 내지 21중량%, 19 내지 35중량%, 19 내지 34중량%, 19 내지 33중량%, 19 내지 32중량%, 19 내지 31중량%, 19 내지 30중량%, 19 내지 29중량%, 19 내지 28중량%, 19 내지 27중량%, 19 내지 26중량%, 19 내지 25중량%, 19 내지 24중량%, 19 내지 23중량%, 19 내지 22중량%, 19 내지 21중량%, 20 내지 35중량%, 20 내지 34중량%, 20 내지 33중량%, 20 내지 32중량%, 20 내지 31중량%, 20 내지 30중량%, 20 내지 29중량%, 20 내지 28중량%, 20 내지 27중량%, 20 내지 26중량%, 20 내지 25중량%, 20 내지 24중량%, 20 내지 23중량%, 20 내지 22중량%, 또는 20 내지 21중량% 일 때 상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 것일 수 있다.
상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 단계는, 반응생성물의 당류 고형분 함량 100중량%를 기준으로 반응생성물의 니스토스 (GF3) 함량이 5중량% 이하, 5중량% 미만, 4.5중량% 이하, 4중량% 이하, 3.5중량% 이하, 3중량% 이하, 3중량% 미만, 또는 2중량% 이하일 때 상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 것일 수 있다. 이 때, 상기 니스토스 함량의 하한값이 특정되지 않더라도 상기 케스토스 전환 반응을 종결하기 위한 시점을 통상의 기술자가 적절하게 선택할 수 있을 것이며, 예를 들어 상기 반응생성물의 니스토스 함량의 하한값은 0중량% 이상, 0중량% 초과, 0.01중량% 이상, 0.05중량% 이상, 0.1중량% 이상, 0.5중량% 이상, 또는 1중량% 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 단계는, 반응생성물의 당류 고형분 함량 100중량%를 기준으로 반응생성물의 케스토스 (GF2) 함량이 47중량% 이상, 48중량% 이상, 49중량% 이상, 50중량% 이상, 51중량% 이상, 52중량% 이상, 53중량% 이상, 54중량% 이상, 55중량% 이상, 56중량% 이상, 57중량% 이상, 또는 58중량% 이상일 때 상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 것일 수 있다. 이 때, 상기 케스토스 함량의 상한값이 특정되지 않더라도 상기 케스토스 전환 반응을 종결하기 위한 시점을 통상의 기술자가 적절하게 선택할 수 있을 것이며, 예를 들어 상기 반응생성물의 케스토스 함량의 상한값은 80중량% 이하, 70중량% 이하, 65중량% 이하, 또는 60중량% 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 단계는, 반응생성물의 당류 고형분 함량 100중량%를 기준으로 반응생성물의 포도당 함량이 25중량% 이하, 25중량% 미만, 24중량% 이하, 23중량% 이하, 22중량% 이하, 21중량% 이하, 20중량% 이하, 19중량% 이하, 18중량% 이하, 17중량% 이하, 또는 16중량% 이하일 때 상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 것일 수 있다. 이 때, 상기 포도당 함량의 하한값이 특정되지 않더라도 상기 케스토스 전환 반응을 종결하기 위한 시점을 통상의 기술자가 적절하게 선택할 수 있을 것이며, 예를 들어 상기 반응생성물의 포도당 함량의 하한값은 5중량% 이상, 10중량% 이상, 15중량% 이상, 또는 16중량% 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 단계는, 반응생성물의 당류 고형분 함량 100중량%를 기준으로 상기 반응생성물이 설탕 15 내지 35중량% 및 니스토스 5중량% 이하를 포함할 때, 상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 것일 수 있다. 또는, 상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 단계는, 반응생성물의 당류 고형분 함량 100중량%를 기준으로 상기 반응생성물이 설탕 20 내지 25중량% 및 니스토스 4중량% 이하를 포함할 때, 상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 것일 수 있다.
상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 단계는, 반응생성물의 당류 고형분 함량 100중량%를 기준으로, 상기 반응생성물의 케스토스 (GF2) 및 니스토스 (GF3) 합계 함량 대비 니스토스 (GF3) 함량의 퍼센트 비율(%)이 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6.5% 이하, 5% 이하, 4%이하, 또는 3.5% 이하일 때 상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 것일 수 있다.
상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 단계는, 케스토스 전환 반응생성물로부터 분리되어 얻어진 케스토스-함유 프락토올리고당 분획의 당류 고형분 함량 100중량%를 기준으로, 상기 케스토스-함유 프락토올리고당 분획의 케스토스 (GF2) 및 니스토스 (GF3) 합계 함량 대비 니스토스 (GF3) 함량의 퍼센트 비율(%)이 15% 이하, 14% 이하, 13% 이하, 12% 이하, 11% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 또는 6% 이하가 되도록 상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 것일 수 있다.
상기 케스토스 (GF2) 및 니스토스 (GF3) 합계 함량 대비 니스토스 (GF3) 함량의 퍼센트 비율(%)은 수학식 1로 계산되는 것일 수 있다.
[수학식 1]
(니스토스 함량) / {(케스토스 함량) + (니스토스 함량)} X 100(%)
상기 케스토스 전환 반응 종결로 생성되는 반응생성물은, 반응생성물의 분리단계를 수행하기 전에, 전환 반응물을 탈색하는 탈색공정, 전환 반응물을 여과하는 여과공정, 전환 반응물을 정제하는 정제공정, 및 전환 반응물을 농축하는 농축공정으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 단계를 거친 뒤, 모사 이동층(SMB) 크로마토그래피를 이용하여 케스토스-함유 프락토올리고당 분획을 얻는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 케스토스-함유 프락토올리고당의 제조방법은, 모사 이동층(SMB) 크로마토그래피를 이용하여 케스토스 전환 반응의 반응생성물로부터 케스토스-함유 프락토올리고당 분획을 얻는 분리단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 분리단계는 하나의 공정으로 수행되는 것일 수 있다. 또는, 상기 분리단계는 농축 공정을 포함하지 않고 수행되는 것일 수 있다.
상기 SMB 크로마토그래피 분리 공정은 분리과정에서 상 변화가 없어 물질의 안정성 확보에 용이한 분리방법이다. 이러한 흡착 분리방법 중에서 액상 흡착 분리방법으로는 크로마토그래피 분리방법이 많이 사용되고 있다. 이 중, 모사 이동층 흡착 분리 방법(simulated moving bed, SMB)은 다수의 컬럼을 이용하여 연속적으로 분리함으로써 기존의 회분식 크로마토그라피에 비해 순도 및 생산성이 우수하고, 적은 용매의 사용이 가능하다는 장점을 지닌다. 상기 모사 이동층(SMB) 흡착 분리 공정은 분리대상 혼합물의 주입과 라피네이트 및 추출물의 생산이 연속적으로 이루어지는 공정이다.
SMB의 기본 원리는 칼럼 사이의 위치를 일정 시간 간격으로 움직임으로써 고정상과 이동상의 향류의 흐름을 모사하고 연속적인 분리를 가능하게 하는 것이다. 흡착제와 친화력이 약해서 빨리 움직이는 물질은 액상의 흐름 방향으로 움직여서 extract로 모이고 흡착제와 친화력이 강해서 느리게 움직이는 물질은 고정상의 흐름 방향으로 움직여서 라피네이트(raffinate)로 모인다. 칼럼은 연속적으로 연결되어 있으며 입구는 혼합물과 이동상, 출구는 목적 추출물(extract)과 라피네이트로 구성된다.
상기 라피네이트(raffinate)는 추잔액이라고도 하며, 분리공정에 투입된 원료가 분리공정을 통과하여 얻어지는 산물에는 분리공정으로 함량을 높이고자 하는 목적 물질을 포함하는 목적 분획과, 분리공정에서 제거 또는 함량을 감소하고자 하는 물질등을 포함하는 잔류액을 포함하며, 상기 잔류액을 라피네이트라고 한다. 본 발명의 일 예에서 케스토스 전환 반응 공정에서 얻어지는 산물은 원료 기질인 설탕과 생산물인 케스토스를 포함하는 혼합물이며, 고순도 분리공정을 거치면서 목적 물질인 케스토스의 함량이 증가된 프락토올리고당 분획과 잔류액 (라피네이트)를 얻으며, 상기 잔류액에는 반응기질과 부산물 등이 포함될 수 있으며, 예를 들어 설탕, 과당, 포도당, 니스토스 등이 포함될 수 있다.
상기 SMB에서 분리수지로서 단당 분리 공정에도 널리 사용되고 있는 염이 첨가된 강산의 양이온 교환수지를 사용하므로 분리공정을 수행 후 얻어지는 산물에는 금속이온이 포함된다. 상기 강산의 양이온 교환수지의 예는 나트륨 또는 칼슘, 칼륨 활성기가 부착된 양이온교환수지일 수 있다.
상기 케스토스-함유 프락토올리고당 분획을 얻는 분리단계는, 높은 고형분 함량을 가지는 케스토스 전환 반응의 반응생성물을 분리하는 것일 수 있으며, 예를 들어 70 내지 80 Brix, 또는 75 내지 80 Brix의 고형분 함량을 가지는 반응생성물을 분리하여 케스토스-함유 프락토올리고당 분획을 얻는 것일 수 있다.
상기 분리단계는, 프락토올리고당 분획의 당류 고형분 100중량%를 기준으로 케스토스를 80중량% 이상, 81중량% 이상, 82중량% 이상, 83중량% 이상, 84중량% 이상, 85중량% 이상, 86중량% 이상, 87중량% 이상, 88중량% 이상, 89중량% 이상, 90중량% 이상, 또는 91중량% 이상 포함하는 프락토올리고당 분획을 얻는 것일 수 있다. 이 때, 상기 프락토올리고당 분획의 케스토스 함량의 상한값이 특정되지 않더라도 고순도 케스토스 함유 프락토올리고당 분획을 얻고자 하는 목적 하에 통상의 기술자가 명확하게 이해할 수 있을 것이며, 예를 들어 상기 프락토올리고당 분획의 케스토스 함량의 상한값은 100중량% 이하, 100중량% 미만, 99.99중량% 이하, 99.9중량% 이하, 99중량% 이하, 98중량% 이하, 97중량% 이하, 96중량% 이하, 또는 95중량% 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 분리단계는, 프락토올리고당 분획의 당류 고형분 100중량%를 기준으로 니스토스를 10중량% 이하, 9중량% 이하, 8중량% 이하, 7중량% 이하, 6중량% 이하, 5중량% 이하, 4중량% 이하 포함하는 프락토올리고당 분획을 얻는 것일 수 있다. 이 때, 상기 프락토올리고당 분획의 니스토스 함량의 하한값이 특정되지 않더라도 프락토올리고당 분획의 니스토스 함량을 최소화하기 위한 목적 하에 통상의 기술자가 명확하게 이해할 수 있을 것이며, 예를 들어 상기 프락토올리고당 분획의 니스토스 함량의 하한값은 0중량% 이상, 0중량% 초과, 0.1중량% 이상, 0.2중량% 이상, 0.3중량% 이상, 0.4중량% 이상, 0.5중량% 이상, 0.6중량% 이상, 0.7중량% 이상, 0.8중량% 이상, 0.9중량% 이상, 1중량% 이상, 1.1중량% 이상, 1.2중량% 이상, 1.3중량% 이상, 1.4중량% 이상, 1.5중량% 이상, 1.6중량% 이상, 1.7중량% 이상, 1.8중량% 이상, 1.9중량% 이상, 2중량% 이상, 2.5중량% 이상, 또는 3중량% 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 케스토스-함유 프락토올리고당의 제조방법은, 케스토스-함유 프락토올리고당 분획을 이온정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 이온정제하는 단계는, 상기 SMB 크로마토그리패를 이용한 고순도 분리공정에서 얻어진 프락토올리고당 분획을 이온정제하는 단계이다. 상기 이온정제하는 단계는 하나의 공정으로 수행되는 것일 수 있다.
상기 이온정제하는 단계는 상기 프락토올리고당 분획이 이온정제탑을 통과하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 이온정제탑은 음이온탑을 포함하는 것일 수 있다. 일 예로서, 상기 이온정제탑은 양이온탑 및 혼합상(mixed bed)탑으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하며, 상기 프락토올리고당 분획은 상기 음이온탑을 마지막으로 통과하는 것일 수 있다. 본원 실시예 6에서 이온정제가 케스토스 고함유 시럽의 물성에 미치는 영향을 고찰하였으며, 이온정제 MB-A와 같이 후탑을 음이온수지탑으로 설정할 경우 케스토스 고함유 시럽의 저장안정성이 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 이온정제하는 단계 후 상기 프락토올리고당 분획의 pH는 pH 5 내지 8, pH 5 내지 7, pH 6 내지 8, 또는 pH 6 내지 7 일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 케스토스 함유 프락토올리고당의 제조방법에 의해 제조된 프락토올리고당은 바람직하게는 보관 안정성이 향상된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 케스토스 함유 프락토올리고당의 프락토올리고당 함량은, 상기 프락토올리고당 분획의 제조 직후 측정된 프락토올리고당 함량의 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 또는 95% 이상일 수 있다. 상기 케스토스 함유 프락토올리고당의 프락토올리고당 함량은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 또는 7주 보관 후의 프락토올리고당 함량일 수 있다. 또는, 상기 케스토스 함유 프락토올리고당의 7주 동안 보관 후 pH가 pH 3.5 내지 8, pH 3.5 내지 7, pH 3.5 내지 6, pH 3.5 내지 5.5, pH 3.5 내지 5, pH 4 내지 8, pH 4 내지 7, pH 4 내지 6, pH 4 내지 5.5, pH 4 내지 5, pH 4.5 내지 8, pH 4.5 내지 7, pH 4.5 내지 6, pH 4.5 내지 5.5, 또는 pH 4.5 내지 5 일 수 있다. 이 때, 상기 케스토스 함유 프락토올리고당은 30 내지 50℃, 30 내지 45℃, 35 내지 50℃, 35 내지 45℃, 40 내지 50℃, 또는 40 내지 45℃, 일예로 45℃ 온도에서 보관되는 것일 수 있다.
본 발명에 의하면, 고순도 케스토스의 제조 방법의 제조 공정 중 케스토스 전환 반응공정 중 고순도 케스토스 분리를 위한 설탕, 케스토스, 니스토스 ?t량 범위를 확립하고, 이온정제를 개선하여 제품의 저장 안정성을 향상 시킴으로서 생산성과 효율성이 향상된 제조 방법을 제공하는 것이 가능하게 된다.
도 1은 일반적인 SMB 공정의 일예를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따른 케스토스 제조 공정을 도식화한 것이다.
도 3은 SMB 크로마토그래피를 통해 고순도 분리 후 고순도 케스토스 분획의 HPLC 분석 결과이다.
본 발명을 하기 실시예에 의해 더 상세하게 설명된다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 실시예일뿐, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
비교예 1: 프락토올리고당 시럽의 제조
당화조에 55℃ 가온된 물을 45 ton 투입 후, 설탕 55 Ton을 첨가하여 1시간 내지 2시간 교반을 통해 설탕 결정을 완전히 녹였다. 이후 pH를 6.5 내지 7.0으로 적정 후 종래의 프락토올리고당 제조 효소인 β-프럭토퓨라노시다제 (β-fructofuranosidase)를 첨가하여 50 내지 60℃의 온도에서 24시간 내지 48시간 반응시켰다.
이후 반응이 완료된 시점에서 4N NaOH를 이용하여 pH 7.6 이상으로 적정과 동시에 80℃ 온도로 2시간 가온하여 효소 실활을 유도했다. 효소 실활이 완료된 시점에서 효소 반응물을 탈색/여과, 정제, 농축을 통해 고형분 함량 75 중량%로 맞추어 제조했다. 제조가 완료된 시럽의 당조성을 표 1에 나타내었다.
이후 Na+ type 분리수지가 충진되어 있는 SMB를 이용하여 고순도 분리를 진행하였다. 고순도 분리 후의 당조성을 아래 분석 조건의 액체크로마토그라피(HPLC)로 분석하여 표 1에 나타내었다. 고순도 분리 후의 케스토스 함량은 약 34 중량% 이었다. 따라서, 범용적으로 사용하고 있는 종래의 프락토올리고당 제조 효소로는 고순도 케스토스 생산이 어렵다는 것을 확인할 수 있었다.
<분석조건>
컬럼: Shodex Asahipak BH2P-50 4E
주입량: 10 ul
유속: 1ml/min
컬럼온도: 30℃
이동상: Acetonitrile 70%
당조성(중량%) 과당 포도당 설탕 GF2 GF3 GF4 FOS
효소반응 5.44 25.82 13.47 26.76 25.12 3.39 55.27
고순도분리 0.30 0.36 2.81 33.81 51.6 11.12 96.53
실시예 1: 케스토스 고함유 시럽 제조 (1)
당화조에 55℃ 가온된 물을 45kg 투입 후 설탕 55kg 첨가하여 1시간 내지 2시간 교반을 통해 설탕 결정을 완전히 녹였다. 이후 pH를 6.5 내지 7.0으로 적정 후 케스토스 고함유 시럽 제조 효소인 아스페르길루스 니제르 (Aspergillus niger) 유래의 β-프럭토퓨라노시다제 (β-fructofuranosidase)를 첨가하여 50~60℃의 온도에서 24시간 내지 48시간 반응시켰다.
이때, 설탕 함량이 34 중량% 남아있는 효소 반응 구간에서 4N NaOH를 이용하여 pH 7.6 이상으로 적정과 동시에 80℃로 2시간 가온 시켜 효소 실활을 유도하였다. 효소 실활이 완료된 시점에서 효소 반응물을 탈색/여과, 정제, 농축을 통해 75 중량%로 맞추어 제조했다. 제조가 완료된 시럽의 당조성을 표 2에 나타내었다.
이후 Na+ type 분리수지가 충진되어 있는 SMB를 이용하여 고순도 분리를 진행하였다. 효소 반응 후, 고순도 분리 후의 당조성은 비교예 1과 동일한 조건으로 액체크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 분석하였고 표 2에 나타내었다. 고순도 분리 후의 케스토스는 약 81 중량%를 나타내었다. 따라서, 케스토스 85% 이상을 분리하기 위해서는 분리 전 원액의 설탕 함량이 34중량%를 초과하여 높으면 어렵다는 것을 확인하였다.
당조성(%) 과당 포도당 설탕 GF2 GF3 GF4 FOS
효소반응 1.02 15.13 34.84 47.43 1.58 0.0 49.01
고순도분리 0.11 0.0 13.83 81.25 3.81 0 86.06
실시예 2: 케스토스 고함유 시럽 제조 (2)
당화조에 55℃ 가온된 물을 45kg 투입 후 설탕 55kg 첨가하여 1시간~2시간 교반을 통해 설탕 결정을 완전히 녹였다. 이후 pH를 6.5~7.0으로 적정 후 케스토스 고함유 시럽 제조 효소인 아스페르길루스 니제르 (Aspergillus niger) 유래의 β-프럭토퓨라노시다제 (β-fructofuranosidase)를 첨가하여 50~60℃의 온도에서 24시간~48시간 반응시켰다.
이때, 설탕 함량 30 중량%이 남아있는 효소 반응 구간에서 4N NaOH를 이용하여 pH 7.6 이상으로 적정과 동시에 80℃로 2시간 가온 시켜 효소 실활을 유도했다. 효소 실활이 완료된 시점에서 효소 반응물을 탈색/여과, 정제, 농축을 통해 75 중량%로 맞추어 제조했다. 제조가 완료된 시럽의 당조성을 표 3에 나타내었다.
이후 Na+ type 분리수지가 충진되어 있는 SMB를 이용하여 고순도 분리를 진행하였다. 효소 반응 후, 고순도 분리 후의 당조성은 비교예 1과 동일한 조건으로 액체크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 분석하였고 표 3에 나타내었다. 고순도 분리 후의 케스토스는 약 85 중량%를 나타내었다. 케스토스 85% 이상을 분리하기 위해서는 분리 전 원액의 설탕 함량이 30중량% 이하여야 함을 확인하였다.
당조성(%) 과당 포도당 설탕 GF2 GF3 GF4 FOS
효소반응 0.99 16.53 30.0 50.80 1.68 0.0 52.17
고순도분리 0.15 0.0 9.61 85.12 5.12 0 90.24
실시예 3: 케스토스 고함유 시럽 제조 (3)
당화조에 55℃ 가온된 물을 45kg 투입 후 설탕 55kg 첨가하여 1시간~2시간 교반을 통해 설탕 결정을 완전히 녹였다. 이후 pH를 6.5~7.0으로 적정 후 케스토스 고함유 시럽 제조 효소인 아스페르길루스 니제르 (Aspergillus niger) 유래의 β-프럭토퓨라노시다제 (β-fructofuranosidase)를 첨가하여 50~60℃ 의 온도에서 24시간~48시간 반응시켰다.
이때, 설탕 함량 26 중량%이 남아있는 효소 반응 구간에서 4N NaOH를 이용하여 pH 7.6 이상으로 적정과 동시에 80℃로 2시간 가온 시켜 효소 실활을 유도했다. 효소 실활이 완료된 시점에서 효소 반응물을 탈색/여과, 정제, 농축을 통해 75 중량%로 맞추어 제조했다. 제조가 완료된 시럽의 당조성을 표 4에 나타내었다.
이후 Na+ type 분리수지가 충진되어 있는 SMB를 이용하여 고순도 분리를 진행하였다. 효소 반응 후, 고순도 분리 후의 당조성은 비교예 1과 동일한 조건으로 액체크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 분석하였고 표 4에 나타내었다. 고순도 분리 후의 케스토스는 약 85 중량%를 나타내었다. 케스토스 85% 이상, 예를 들어 88중량% 이상을 분리하기 위해서는 분리 전 원액의 설탕 함량이 30 중량% 이하여야 함을 확인하였다.
당조성(%) 과당 포도당 설탕 GF2 GF3 GF4 FOS
효소반응 0.63 17.75 26.34 53.54 1.74 0.0 55.28
고순도분리 0.11 0.0 5.45 88.53 5.91 0 94.44
실시예 4: 케스토스 고함유 시럽 제조 (4)
당화조에 55℃ 가온된 물을 45kg 투입 후 설탕 55kg 첨가하여 1시간~2시간 교반을 통해 설탕 결정을 완전히 녹였다. 이후 pH를 6.5~7.0으로 적정 후 케스토스 고함유 시럽 제조 효소인 아스페르길루스 니제르 (Aspergillus niger) 유래의 β-프럭토퓨라노시다제 (β-fructofuranosidase)를 첨가하여 50~60℃의 온도에서 24시간~48시간 반응시켰다.
이때, 설탕 함량 20 중량%이 남아있는 효소 반응 구간에서 4N NaOH를 이용하여 pH 7.6 이상으로 적정과 동시에 80℃로 2시간 가온 시켜 효소 실활을 유도했다. 효소 실활이 완료된 시점에서 효소 반응물을 탈색/여과, 정제, 농축을 통해 75 중량%로 맞추어 제조했다. 제조가 완료된 시럽의 당조성을 표 5에 나타내었다.
이후 Na+ type 분리수지가 충진되어 있는 SMB를 이용하여 고순도 분리를 진행하였다. 효소 반응 후, 고순도 분리 후의 당조성은 비교예 1과 동일한 조건으로 액체크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 분석하였고 표 5에 나타내었다. 고순도 분리 후의 케스토스는 약 91 중량%를 나타내었다. 케스토스 90% 이상을 분리하기 위해서는 분리 전 원액의 설탕 함량이 25 중량% 이하여야 함을 확인할 수 있었다.
당조성(%) 과당 포도당 설탕 GF2 GF3 GF4 FOS
효소반응 1.05 18.83 20.72 56.48 2.91 0.0 59.39
고순도분리 0.0 0.0 1.88 91.25 6.87 0 98.12
실시예 5: 케스토스 고함유 시럽 제조 (5)
당화조에 55℃ 가온된 물을 45kg 투입 후 설탕 55kg 첨가하여 1시간~2시간 교반을 통해 설탕 결정을 완전히 녹였다. 이후 pH를 6.5~7.0으로 적정 후 케스토스 고함유 시럽 제조 효소인 Aspergillus niger 유래의 β-fructofuranosidase를 첨가하여 50~60℃의 온도에서 24시간~48시간 반응시켰다.
이때 설탕 함량 15 중량%이 남아있는 효소 반응 구간에서 4N NaOH를 이용하여 pH 7.6 이상으로 적정과 동시에 80℃로 2시간 가온 시켜 효소 실활을 유도했다. 효소 실활이 완료된 시점에서 효소 반응물을 탈색/여과, 정제, 농축을 통해 75 중량%로 맞추어 제조했다. 제조가 완료된 시럽의 당조성을 표 6에 나타내었다.
이후 Na+ type 분리수지가 충진되어 있는 SMB를 이용하여 고순도 분리를 진행하였다. 효소 반응 후, 고순도 분리 후의 당조성은 비교예 1과 동일한 조건으로 액체크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 분석하였고 표 6에 나타내었다. 고순도 분리 후의 케스토스는 약 88 중량%를 나타내었다. 케스토스 85% 이상을 분리하기 위해서는 분리 전 원액의 설탕 함량 약 15 중량% 범위도 문제가 없지만, 니스토스 (GF3)의 함량 증가에 의해 고순도 케스토스 분리에 영향이 있는 것을 확인하였다. 따라서 설탕 이외에도 니스토스 (GF3) 함량도 케스토스 분리에 영향을 주며, 케스토스 90% 이상을 분리하기 위해서는 효소 반응 후 GF3가 5% 이하로 관리하는 것이 더욱 바람직할 것이라고 판단되었다.
당조성(%) 과당 포도당 설탕 GF2 GF3 GF4 FOS
효소반응 1.15 20.93 15.29 58.29 4.34 0.0 62.63
고순도분리 0.0 0.0 1.25 88.63 10.12 0 96.75
실시예 6: 고순도 케스토스 이온정제
이온정제가 케스토스 고함유 시럽의 물성에 미치는 영향을 알아보기 위해, 실시예 1 내지 5 에서 고순도 분리 후 얻어진 케스토스 고함유 시럽들을 일부 취하여, 이온정제 MB-A 또는 A-MB로 나누어 정제하였다. 이후 농축 공정을 통해 75 Brix로 농축하였고, 45℃ 가혹조건에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7주차에 각각 측정하였다. 프락토올리고당의 함량을 분석하기 위해 액체크로마토그라피를 이용하여 당 조성을 분석하였고 표 7에 나타내었다. 또한 제품을 30Bx로 희석하여 pH meter를 이용하여 제품의 pH를 분석하였고 표 8에 나타내었다.
보관주차 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5
A-MB MB-A A-MB MB-A A-MB MB-A A-MB MB-A A-MB MB-A
0 86.06 86.06 90.24 90.24 94.44 94.44 98.12 98.12 96.75 96.75
1 83.12 86.03 87.65 90.21 90.56 94.40 94.51 98.06 93.66 96.71
2 80.63 86.01 83.58 90.18 86.14 94.38 90.32 98.01 89.41 96.65
3 68.22 85.00 77.32 90.06 78.05 94.06 83.65 97.56 80.62 96.34
4 57.63 84.16 65.82 89.64 69.54 93.02 72.41 96.66 69.66 95.64
5 46.82 83.51 51.27 88.74 57.56 91.86 60.32 95.53 58.96 94.53
6 34.52 82.86 38.68 87.52 43.43 90.91 45.63 94.46 43.75 93.46
7 25.40 82.45 24.80 86.12 26.50 89.66 27.30 93.54 27.94 92.21
7주차/0주차 29.5% 95.8% 27.5% 95.4% 28.1% 94.9% 27.8% 95.3% 28.9% 95.3%
보관주차 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5
A-MB MB-A A-MB MB-A A-MB MB-A A-MB MB-A A-MB MB-A
0 4.52 6.91 4.48 6.89 4.61 6.92 4.49 6.97 4.57 6.85
1 4.38 6.47 4.32 6.41 4.44 6.55 4.38 6.61 4.32 6.42
2 4.21 6.13 4.21 6.04 4.28 6.11 4.24 6.23 4.16 6.19
3 4.14 5.97 4.04 5.82 4.16 5.92 4.11 6.02 4.05 5.95
4 3.78 5.67 3.82 5.58 3.83 5.58 3.76 5.68 3.94 5.61
5 3.56 5.31 3.49 5.24 3.52 5.26 3.48 5.31 3.86 5.22
6 3.41 5.06 3.37 4.91 3.39 4.89 3.36 5.02 3.45 4.98
7 3.28 4.81 3.22 4.68 3.14 4.75 3.21 4.80 3.34 4.73
표 7 및 표 8에서 알 수 있듯이, MB-A와 같이 후탑을 음이온수지탑으로 맞출 시 제품의 저장안정성이 향상되는 것을 확인할 수 있었고, 종래의 방법으로 생산 시 프락토올리고당의 분해가 빠른 속도로 진행됨을 알 수 있었다.

Claims (22)

  1. 설탕을 포함하는 기질과, 케스토스 전환 활성을 가지는 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 케스토스 전환 반응을 수행하는 단계;
    상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 단계;
    모사 이동층(SMB) 크로마토그래피를 이용하여, 상기 케스토스 전환 반응의 반응생성물로부터 케스토스-함유 프락토올리고당 분획을 얻는 분리단계; 및
    상기 프락토올리고당 분획을 이온정제하는 단계를 포함하며,
    상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 단계는, 상기 케스토스 전환 반응의 반응생성물에 함유된 당류 고형분 함량 100중량%를 기준으로 니스토스 함량이 3.5 중량% 이하, 설탕 함량이 15 내지 35중량%, 및 케스토스 함량이 49중량% 이상에서 반응을 종결하는 것이고,
    상기 이온정제하는 단계는, 상기 프락토올리고당 분획이 양이온탑 및 혼합상(mixed bed)탑으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 통과하고, 음이온탑을 마지막으로 통과하여 수행되고,
    상기 이온정제하는 단계를 수행한 후 얻어지는 프락토올리고당 분획의 pH는 5 내지 8인,
    제조 후 45℃에서 7주 동안 보관 후 pH가 3.5 내지 8인 특성을 갖는 케스토스-함유 프락토올리고당의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 케스토스 전환 반응을 수행하는 단계는, 상기 설탕을 포함하는 기질의 당류 고형분 함량을 기준으로, 80 내지 100중량%의 설탕을 포함하는 기질을 이용하여 수행되는 것인, 제조방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 분리단계는, 상기 프락토올리고당 분획의 당류 고형분 100중량%를 기준으로 케스토스 (GF-2)를 80중량% 이상 포함하는 프락토올리고당 분획을 얻는 것인, 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 분리단계는, 상기 프락토올리고당 분획의 당류 고형분 100중량%를 기준으로 케스토스 (GF-2)를 90중량% 이상 포함하는 프락토올리고당 분획을 얻는 것인, 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 분리단계는, 상기 프락토올리고당 분획의 당류 고형분 100중량%를 기준으로 니스토스 (GF-3)를 10중량% 이하로 포함하는 프락토올리고당 분획을 얻는 것인, 제조방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 단계는, 상기 프락토올리고당 분획의 당류 고형분 100%를 기준으로 25중량% 미만의 포도당을 포함하는 효소 반응물을 생산하는 것인, 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 분리단계는 70 내지 80 Brix의 고형분 함량을 가지는 상기 케스토스 전환 반응생성물에 적용되는 것인, 제조방법
  11. 제1항에 있어서, 상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 단계는, 반응생성물의 당류 고형분 함량 100중량%를 기준으로, 하기 수학식 1로 계산되는 상기 반응생성물의 케스토스 (GF2) 및 니스토스 (GF3) 합계 함량 대비 니스토스 (GF3) 함량의 퍼센트 비율(%)이 10% 이하일 때 상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 것인, 제조방법:
    [수학식 1]
    (니스토스 함량) / {(케스토스 함량) + (니스토스 함량)} X 100(%)
  12. 제1항에 있어서, 상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 단계는, 상기 케스토스-함유 프락토올리고당 분획의 당류 고형분 함량 100중량%를 기준으로, 하기 수학식 1로 계산되는 상기 케스토스-함유 프락토올리고당 분획의 케스토스 (GF2) 및 니스토스 (GF3) 합계 함량 대비 니스토스 (GF3) 함량의 퍼센트 비율(%)이 15% 이하가 되도록 상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 것인, 제조방법:
    [수학식 1]
    (니스토스 함량) / {(케스토스 함량) + (니스토스 함량)} X 100(%)
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제1항에 있어서, 상기 케스토스 함유 프락토올리고당은, 상기 프락토올리고당 분획의 제조 직후 측정된 프락토올리고당 함량의 30% 이상인, 제조방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 케스토스 전환 반응을 수행하는 단계는 pH 6 내지 8 및 40 내지 70℃의 온도에서 에서 반응하는 것인, 제조방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 케스토스 전환 반응을 종결하는 단계는,
    반응 pH를 7.6 이상으로 적정하는 단계, 및
    반응온도를 75 ℃ 이상으로 가열하는 단계
    로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 제조방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 케스토스 전환 반응의 반응생성물의 분리단계를 수행하기 전에, 탈색공정, 이온정제공정, 및 농축공정로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 공정을 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 제조방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 케스토스 전환 활성을 가지는 효소는 아스페르길루스 니제르 (Aspergillus niger) 균주, 피키아 파리노사 (Pichia farinose) 균주, 야로이야 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 밀레로지마 파리노사 (Millerozyma farinose), 및 아스페르길루스 오리제 (Aspergillus oryzae) 균주로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 효소인, 제조방법.
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