CN111534503A

CN111534503A - Haloferula sp.β-N-乙酰氨基己糖苷酶在合成人乳寡糖中的应用

Info

Publication number: CN111534503A
Application number: CN202010386045.2A
Authority: CN
Inventors: 江正强; 刘翊昊; 闫巧娟; 马俊文; 杨绍青; 李婷
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-05-09
Filing date: 2020-05-09
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2040-05-09
Also published as: WO2021227363A1; US20230011163A1; CN111534503B

Abstract

本发明公开了Haloferula sp.β‑N‑乙酰氨基己糖苷酶在合成人乳寡糖中的应用。本发明提供了HaHex74蛋白或其相关生物材料在如下任一中的应用：(a1)合成人乳寡糖；(a2)合成乳糖‑N‑三糖Ⅱ和/或乳糖‑N‑新四糖；HaHex74蛋白来源于Haloferula sp.氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明的β‑N‑乙酰氨基己糖苷酶产酶水平高、水解特性优异以及转糖苷活性高，在酶法合成人乳寡糖中具有重要的应用价值。

Description

Haloferula sp.β-N-乙酰氨基己糖苷酶在合成人乳寡糖中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及Haloferula sp.β-N-乙酰氨基己糖苷酶在合成人乳寡糖中的应用。

背景技术

β-N-乙酰氨基己糖苷酶(EC 3.2.1.52)是一种糖苷水解酶(GH)，可催化N-乙酰氨基-β-D-己糖胺中β键的裂解，产生N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖胺(GlcNAc)或N-乙酰氨基-β-D-半乳糖胺(GalNAc)(Chen et al.Efficient and regioselective synthesis ofβ-GalNAc/GlcNAc-Lactose by a bifunctional transglycosylatingβ-N-Acetylhexosaminidase from Bifidobacterium bifidum.Appl.Environ.Microbiol.,2016,82,5642-5652)。根据氨基酸序列的同源性，现有β-N-乙酰氨基己糖苷酶分属于GH3、20、84和116家族。近年来，由于GH20家族β-N-乙酰氨基己糖苷酶具有较高的转糖苷活性而用于功能性寡糖的合成(Liu,T.,Duan,Y.W.,&Yang,Q.Revisiting glycoside hydrolasefamily 20β-N-acetyl-D-hexosaminidases:Crystal structures,physiologicalsubstrates and specific inhibitors.Biotechnol.Adv.,2018,36,1127-1138)。人乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)是天然存在于人乳中的一类主链由2-10个单糖分子组成的低聚糖，其含量仅次于乳糖和脂质(Faijes et al.Enzymatic and cellfactory approaches to the production of human milk oligosaccharides.Biotechnol.Adv.,2019,37,667-697)。乳糖-N-三糖Ⅱ(lacto-N-trioseⅡ,LNT2)和乳糖-N-新四糖(lacto-N-neotetraose,LNnT)是HMOs的骨架结构，具有许多功能活性，如抗炎和免疫调节活性(Cheng et al.Human milk oligosaccharides and its acid hydrolysate LNT2show immunomodulatory effects via TLRs in a dose and structure-dependentway.J.Funct.Foods,2019,59,174-184)。2015年美国食品药品监督管理局(Food and DrugAdministration,FDA)批准LNnT为公认安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)的新食品原料。2016年，欧盟食品安全局(EFSA)也批准LNnT为新食品原料，相关产品也随之大量上市(Bych et al.Production of HMOs using microbial hosts-from cellengineering to large scale production.Curr.Opin.Biotechnol.,2019,56,130-137)。但是，绿色高效大规模制备LNT2和LNnT仍然存在挑战。

目前合成LNT2和LNnT的主要方法有全细胞生物转化法、化学法和酶法。由于整合了微生物的代谢机制以及糖基转移酶的区域和立体选择性，全细胞生物转化法是目前大规模生产HMOs的有效手段(Faijes et al.Enzymatic and cell factory approaches tothe production of human milk oligosaccharides.Biotechnol.Adv.,2019,37,667-697)。

等(

et al.Synthesis of fucosylated lacto-N-tetraose using whole-cell biotransformation.Bioorg.Med.Chem.,2015,23,6799-6806)通过发酵改造后的大肠杆菌LJ110生产LNT2，其终浓度为1.6g L^-1。鲍姆格特纳等(F·鲍姆格特纳等,CN201580038218)通过将β1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶基因(LgtA)整合至大肠杆菌K12，在最佳半乳糖补料策略的30L生物反应器中反应44h，LNT2浓度达到15.8g/L。Drouillard等(Drouillard et al.Large-scale synthesis of H-antigenoligosaccharides by expressing Helicobacter pyloriα-1,2-fucosyltransferase inmetabolically engineered Escherichia coli cells.Angew.Chem.,Int.Ed.,2006,45,1778-1780)通过发酵改造后的大肠杆菌JM107生产LNnT，其终浓度为0.7g·L^-1。此外，许多学者研究利用芽孢杆菌等作为底盘细胞生物合成LNnT，如刘龙等(刘龙等,CN201910146431)通过在枯草芽孢杆菌168ΔamyE:P43-lacY，P43-lgtB，PxylA-comK的基因组上整合两个β-1,4-半乳糖转移酶基因，并外源表达β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因得到一个重组枯草芽孢杆菌168，该菌在最佳葡萄糖补料策略下反应48h，LNnT浓度达到1.3g/L。Dong等(Dong et al.Modular pathway engineering of key precursor supplypathways for lacto-N-neotetraose production in Bacillussubtilis.Biotechnol.Biofuels,2019,12,212)通过发酵改造后的枯草芽孢杆菌168生产LNnT，其终浓度为4.5g L^-1。虽然全细胞生物转化法是目前大规模生产LNT2和LNnT主要手段，但是其得率低，且前期需要对宿主细胞代谢通路进行改造，后期需要对发酵工艺进行优化，生产成本仍居高不下。

化学法合成LNT2和LNnT为了防止副反应的发生，需要较多步骤且合成效率较低，不适合大规模生产(Faijes et al.Enzymatic and cell factory approaches to theproduction of human milk oligosaccharides.Biotechnol.Adv.,2019,37,667-697)。相比于化学法，酶法合成具有良好的立体和区域选择性，环境友好，且能够有效地保证特定糖苷键构型和将单糖逐个加到糖基受体特定位置的优点，己经成为HMOs合成的有效手段。但目前酶法合成LNT2和LNnT主要依赖于人工合成的糖苷供体，如对硝基苯基-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)和尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)等。人工合成的供体价格昂贵且存在安全性，因此不适合食品级LNT2和LNnT的高效合成(Nyffenegger etal.Backbone structures in human milk oligosaccharides:trans-glycosylation bymetagenomicβ-N-acetylhexosaminidases.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2015,99,7997-8009)。几丁质是β-N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的线性多聚糖，广泛存在于自然界中，其含量仅次于纤维素(Lv et al.Highly efficient and selectivebiocatalytic production of glucosamine from chitin.Green Chem.,2017,19,527-535)。其降解产物，几丁寡糖结构中具有大量β-N-乙酰氨基葡萄糖苷，可作为合成LNT2的天然糖苷供体(Nyffenegger et al.Backbone structures in human milkoligosaccharides:trans-glycosylation by metagenomicβ-N-acetylhexosaminidases.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2015,99,7997-8009)。因此，利用β-N-乙酰氨基己糖苷酶协同几丁质酶将几丁质转化为LNT2，再进一步协同β-半乳糖苷酶合成高附加值的LNnT将具有广阔的市场前景。

β-N-乙酰氨基己糖苷酶主要应用于生物防治(李大琪等,CN201210356675)、饲料添加(周志刚等,CN201210065384)和几丁寡糖的制备(江正强等,CN201811105536)。目前未见利用β-N-乙酰氨基己糖苷酶协同几丁质酶将几丁质转化为LNT2，再进一步协同β-半乳糖苷酶合成LNnT的相关专利及文献报道。国际上对β-N-乙酰氨基己糖苷酶和β-半乳糖苷酶合成LNT2和LNnT的报道也相对较少。Nyffenegger等(Nyffenegger et al.Backbonestructures in human milk oligosaccharides:trans-glycosylation by metagenomicβ-N-acetylhexosaminidases.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2015,99:7997-8009)土壤的宏基因组文库中获得了两个β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶并在大肠杆菌中成功表达(HEX1和HEX2)，HEX1和HEX2利用几丁二糖和乳糖在25℃下反应2h，LNT2转化率分别为2％和8％。Zeuner等(Zeuner et al.Thermostableβ-galactosidases for the synthesis of humanmilk oligosaccharides.New Biotechnol.,2016,33,355-360)利用三个嗜热β-半乳糖苷酶，以乳糖和LNT2为糖苷供体和受体，分别合成了LNnT，但其得率均较低，分别为7.1％、5.2％和1.0％。

Haloferula sp.是Verrucomicrobia菌门的一个分支(Bibi et al.Haloferulaluteola sp nov.,an endophytic bacterium isolated from the root of ahalophyte,Rosa rugosa,and emended description of the genus Haloferula.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,2011,61,1837-1841)，目前国际上关于此属的报道较少，且尚无Haloferula sp.产β-N-乙酰氨基己糖苷酶的报道。

发明内容

本发明的目的是提供Haloferula sp.β-N-乙酰氨基己糖苷酶在合成人乳寡糖中的应用。

第一方面，本发明要求保护HaHex74蛋白或其相关生物材料在如下任一中的应用：

(a1)合成人乳寡糖；

(a2)合成乳糖-N-三糖Ⅱ和/或乳糖-N-新四糖。

所述HaHex74蛋白来源于Haloferula sp.，具体可为如下任一：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的第94-745位或SEQ ID No.2的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.2的第94-745位或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

所述相关生物材料可为能够表达所述HaHex74蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同源性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

第二方面，本发明要求保护一种合成乳糖-N-三糖Ⅱ的方法。

本发明要求保护的合成乳糖-N-三糖Ⅱ的方法，可包括如下步骤(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)以HaHex74蛋白为生物酶，催化几丁质水解物和β-乳糖合成乳糖-N-三糖Ⅱ(LNT2)；

(b2)以几丁质酶催化几丁质水解，得到几丁质水解物；然后以HaHex74蛋白催化所述几丁质水解物和β-乳糖合成乳糖-N-三糖Ⅱ(LNT2)；

(b3)以几丁质酶和HaHex74蛋白为生物酶，催化几丁质和β-乳糖合成乳糖-N-三糖Ⅱ(LNT2)。

所述HaHex74蛋白为如上(A1)-(A4)中任一所述蛋白质。

第三方面，本发明要求保护一种合成乳糖-N-新四糖的方法。

本发明所要求保护的合成乳糖-N-新四糖的方法，可包括如下步骤(c1)或(c2)：

(c1)按照前文第二方面所述方法制备得到乳糖-N-三糖Ⅱ(LNT2)；然后以β-半乳糖苷酶催化乳糖-N-三糖Ⅱ(LNT2)和β-乳糖合成乳糖-N-新四糖(LNnT)；

(c2)以几丁质酶、HaHex74蛋白和β-半乳糖苷酶为生物酶，催化几丁质和β-乳糖合成乳糖-N-三糖Ⅱ(LNT2)和乳糖-N-新四糖(LNnT)。

所述HaHex74蛋白为如上(A1)-(A4)中任一所述蛋白质。

进一步地，在所述(b1)和所述(b2)中，所述几丁质水解物为几丁二糖和N-乙酰氨基葡萄糖混合物。

进一步地，以所述HaHex74蛋白为生物酶，催化所述几丁质水解物和β-乳糖合成乳糖-N-三糖Ⅱ(LNT2)时的pH为7.5，和/或温度为40℃，和/或β-乳糖在反应体系中的含量为0.8M，和/或所述HaHex74蛋白在反应体系中的含量为3-5U/mL(如4U/mL)，和/或反应时间为10h。

进一步地，在以所述几丁质酶催化几丁质水解，得到所述几丁质水解物的过程中，pH为5.5，和/或温度为55℃，和/或所述几丁质酶在反应体系中的含量为5U/mL，和/或反应时间为24h。

进一步地，在以所述β-半乳糖苷酶催化乳糖-N-三糖Ⅱ(LNT2)和β-乳糖合成乳糖-N-新四糖(LNnT)的过程中，pH自然(pH 7.0)，和/或温度为50℃，和/或所述β-半乳糖苷酶在反应体系中的含量为0.1U/mL，和/或反应时间为10h。

在上述各方面中，所述HaHex74蛋白的最适pH为6.5、最适温度为45℃。

在上述各方面中，所述HaHex74蛋白可按照包括如下步骤的方法制备得到：将编码所述HaHex74蛋白的核酸分子导入受体酵母，得到重组酵母；按照如下步骤对所述重组酵母进行发酵培养，从发酵产物中获得所述HaHex74蛋白：

(d1)基础培养阶段：将所述重组酵母接种到添加有50g/L甘油的BSM培养基中培养，控制pH4.0，温度30℃，待甘油浓度低于10g/L时开始甘油流加培养阶段。

(d2)甘油流加培养阶段：流加500g/L甘油，维持甘油浓度为10-25g/L，控制温度28℃，pH5.0，溶氧量为10-20％，直至发酵终点。

在(d1)中，还包括向发酵体系中加入PTM1的步骤。所述PTM1的加入量为4.35mL/L起始发酵液。

在(d1)中，所述重组酵母的接种量为10％体积百分含量。

在(d1)中，培养时控制转速600rpm；在(d2)中，培养时控制转速800rpm。

在(d1)之前，还可包括种子培养阶段：将所述重组酵母接种到BMGY培养基中，30℃培养至OD₆₀₀为10.0左右。在所述种子培养阶段，控制转速200rpm。

进一步地，从所述发酵产物中获得所述HaHex74蛋白可按照包括如下步骤的方法进行：将所述发酵产物离心收集上清液；将所述上清液置于Tris-HCl缓冲液中透析，离心得到粗液；将所述粗液使用琼脂糖弱阴离子交换柱DE52纯化得到所述HaHex74蛋白。

更进一步地，用缓冲液A平衡DE52亲和柱5-10个柱体积，将收集的所述粗液以0.5mL/min流速上样，用所述缓冲液A与缓冲液B线性洗脱至至OD₂₈₀<0.05，收集具有β-N-乙酰氨基己糖苷酶活力的组分，透析得到纯化产物即为所述HaHex74蛋白。

其中，所述缓冲液A为含有20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)；所述缓冲液B为含有NaCl(500mM)的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。

进一步地，编码所述HaHex74蛋白的核酸分子可为如下任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.3的第280-2238位或SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与b1)或b2)限定的DNA分子杂交且编码所述HaHex74蛋白的DNA分子；

(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述HaHex74蛋白的DNA分子。

上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNa₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述核酸分子中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述核酸分子中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

进一步地，所述核酸分子可通过重组载体的形式导入所述受体酵母中。

其中，所述重组载体中启动所述核酸分子转录的启动子可为GAP启动子。

更进一步地，所述重组载体为将所述核酸分子克隆到pGAP9K载体(如EcoR I和NotI之间)中后得到的重组载体。其中，所述pGAP9K载体为将pPIC9K载体中的AOX1启动子替换为GAP启动子后所得质粒。

所述GAP启动子的序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地，所述酵母为毕赤酵母。

更进一步地，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。

本发明将Haloferula sp.的一个糖苷水解酶20家族的β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因在毕赤酵母中高效表达。经5L发酵罐高密度发酵后，发酵液的酶活力可达3500U·mL^-1，蛋白含量为9.7g·L^-1，为目前β-N-乙酰氨基己糖苷酶表达的最高水平。新发明的β-N-乙酰氨基己糖苷酶HaHex74具有优异的转糖苷活性，能够以天然供体几丁二糖((GlcNAc)₂)和β-乳糖高效合成人乳寡糖重要的骨架结构LNT2，转化率为10-20％，为目前β-N-乙酰氨基己糖苷酶利用天然供体合成LNT2的最高水平。利用几丁质酶和HaHex74可高效将几丁质粉末转化为LNT2，进一步协同β-半乳糖苷酶可高效合成LNnT，其浓度分别为8-12g·L^-1和1-3g·L^-1。本发明的β-N-乙酰氨基己糖苷酶产酶水平高、水解特性优异以及转糖苷活性高，在酶法合成人乳寡糖中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为高密度发酵β-N-乙酰氨基己糖苷酶HaHex74表达量和胞外蛋白SDS-PAGE分析图。A为HaHex74表达量((■)：酶活；(▲)：蛋白浓度；(●)：湿重)；B为SDS-PAGE分析图

图2为β-N-乙酰氨基己糖苷酶HaHex74的纯化电泳图。

图3为β-N-乙酰氨基己糖苷酶HaHex74的最适反应pH、pH稳定性、最适温度和温度稳定性的测定曲线图。A为最适反应pH；B为pH稳定性；C为最适温度；D为温度稳定性。其中，(■)柠檬酸缓冲液(pH 5.0-6.0)、(●)乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.0-6.0)、(▲)MES缓冲液(pH 5.5-6.5)、(▼)MOPS缓冲液(pH 6.5-7.5)、(◆)磷酸缓冲液(pH 6.0-8.0)、

Tris-HCl缓冲液(pH 7.0-9.0)、

甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 8.5-10.5)。

图4为β-N-乙酰氨基己糖苷酶HaHex74的合成LNT2最适pH(A)、最适温度(B)、最适反应时间(C)、最适受体浓度(D)和最适加酶量(E)的测定曲线图。A为最适pH；B为最适温度；C为最适反应时间；D为最适受体浓度；D为最适加酶量。其中(■)MES缓冲液(pH 5.5-6.5)、(▲)磷酸缓冲液(pH 6.0-8.0)、(▼)Tris-HCl缓冲液(pH 7.0-9.0)。

图5为β-N-乙酰氨基己糖苷酶HaHex74转糖苷产物的一级质谱图。

图6为β-N-乙酰氨基己糖苷酶HaHex74转糖苷产物的一级¹H谱图。

图7为β-N-乙酰氨基己糖苷酶HaHex74转糖苷产物的一级¹³C谱图。

图8为β-N-乙酰氨基己糖苷酶HaHex74转糖苷产物的二级异核单量子关系(HSQC)谱图。

图9为合成LNT2的HPLC分析((■)：转化率；(●)：LNT2浓度)。

图10为合成LNnT的HPLC分析((■)：转化率；(●)：LNnT浓度)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中β-N-乙酰氨基己糖苷酶酶活测定方法如下：

取0.1mL适当稀释的酶液，加入到0.1mL浓度为2mM的pNP-NAG底物溶液(用50mM，pH6.5的磷酸缓冲液配制)中，45℃水浴反应10min，测定其在410nm下的吸光度(OD₄₁₀)(Yanget al.Biochemical characterization of the first fungal glycoside hydrolyasefamily 3β-N-acetylglucosaminidase from Rhizomucor miehei.J.Agric.Food Chem.,2014,62,5181-5190)。

β-N-乙酰氨基己糖苷酶的活力单位定义为：在上述反应条件下，每分钟反应生成1μmol的pNP所需要的酶量为一个酶活力单位(1U)。

比酶活定义为1mg蛋白所具有的酶活力单位，表示为U·mg^-1。

1个β-N-乙酰氨基己糖苷酶酶活单位的定义：在pH 6.5、45℃条件下，每分钟分解浓度为2mM的pNP-NAG底物溶液(用50mM，pH 6.5的磷酸缓冲液配制)释放1μmol的pNP所需要的酶量，酶活计算公式为：H＝Cx×n/(T×V)，其中，H代表酶活力(U/mL)，Cx代表生成pNP物质的量(μmol)，n代表酶液的稀释倍数，T代表反应时间(min)，V代表加入稀释后的酶液体积(mL)。

实施例1、β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因的发掘及工程菌的构建

1、β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因的确定

通过CAZy数据库查找已报道的β-N-乙酰氨基己糖苷酶的蛋白序列，将序列进行同源序列比对分析，得到来源于Haloferula sp.的一个糖苷水解酶20家族的β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因(命名为HaHex74)。HaHex74基因的核苷酸序列为“ATG+SEQ ID No.3的第280-2238”，编码“Met+SEQ ID No.2的第94-745位”所示氨基酸序列。HaHex74基因与一个土壤宏基因组β-N-乙酰氨基己糖苷酶(AKC34129)的同源性最高，为61％。之后送去上海生工生物有限公司合成基因。

2、表达β-N-乙酰氨基己糖苷酶工程菌的构建

2.1、根据毕赤酵母GS115基因组中三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子基因序列设计引物：

GAP1：5’-GCAGCGAGCTCATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGG-3’；

GAP2：5’-CGCGGATCCTGTGTTTTGATAGTTGTTCAATTGA-3’。

从毕赤酵母GS115基因组中扩增GAP启动子，将GAP启动子片段和pPIC9K载体用SacI和BamHⅠ双酶切，经T4 DNA连接酶连接得到改造后的表达载体，命名为pGAP9K，即将pPIC9K载体中的AOX1启动子替换为GAP启动子。其中，GAP启动子序列如SEQ ID No.1所示。

2.2、根据β-N-乙酰氨基己糖苷酶的序列设计表达引物，上下游引物分别添加上EcoRI和NotI酶切位点上下游引物分别如下：

上游引物：5’–CCGGAATTCGAACCAACCATTATTCCATTGCC-3’；

下游引物：5’–AGAATGCGGCCGCTTACTCAACGGTGATTTCGTGGATA-3’。

用上述引物进行PCR扩增，PCR扩增条件为：95℃预变性30s；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸1min，循环34次；最后72℃后延伸5min。PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收，以EcoRI和NotI双酶切。将该双酶切后的产物与经相同双酶切过的酵母表达载体pGAP9K的载体骨架片段以T4 DNA连接酶进行连接，转化至宿主大肠杆菌DH5α。挑选菌落PCR(PCR所用的引物和扩增条件与本段前述PCR的相同)验证为阳性的转化子测序。将测序验证正确的重组酵母表达载体命名为pGAP9K-HaHex74。将得到的重组巴斯德毕赤酵母表达载体pGAP9K-HaHex74以限制性内切酶XbaI线性化后得电转化巴斯德毕赤酵母GS115，构成重组菌。

重组表达载体pGAP9K-HaHex74中GAP启动子序列为SEQ ID No.1中的DNA分子(即通过Sac I和BamHⅠ双酶切将pPIC9K载体中的AOX1启动子替换为GAP启动子，构建新的表达载体pGAP9K)，重组表达载体pGAP9K-HaHex74完整的ORF序列为SEQ ID No.3中的DNA分子，其中，第1-279位为pGAP9K载体上的序列，第280-2238位为HaHex74基因序列。

实施例2、β-N-乙酰氨基己糖苷酶的制备及其酶学性质

1、β-N-乙酰氨基己糖苷酶的高拷贝筛选

将实施例1中得到的重组菌涂布MD板(1.34％YNB，4×10^-5％生物素，2％葡萄糖)，从MD平板得到的His⁺转化子经灭菌水刮取后取100μL涂布于不同浓度的YPD-G418平板(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖，G418浓度分别为2，3，4，6mg/mL)。30℃下培养3～5d后，挑取转化子于BMGY培养基摇瓶培养16～18h，3000rpm离心5min，收集菌体，用BMGY培养基重悬菌体至OD₆₀₀为1.0左右，分批流加甘油使目标蛋白表达。以上培养条件为100mL三角瓶装量20mL培养基，温度30℃，转速200rpm。每24h加甘油至终浓度为1％以持续3天，测定发酵液酶活，并通过SDS-PAGE分析HaHex74重组蛋白表达情况。

2、毕赤酵母重组菌高密度发酵

将实施例2步骤1获得的产酶水平高的毕赤酵母菌株在5L发酵罐中进行高密度发酵。发酵过程中所用到的培养基(种子培养基BMGY、发酵基本培养基BSM和甘油分批补料培养基)参照Pichia Fermentation Process Guidelines(Version B，053002，Invitrogen)配制。整个发酵过程采用基础培养和甘油流加培养两个阶段。

(1)种子培养：选择摇瓶发酵中产酶水平较高的菌株，接种150mL BMGY培养基中，30℃，200rpm培养至OD₆₀₀为10.0左右。

(2)基础培养：将步骤(1)所得的种子液接种到5L发酵罐中(装有1.35L发酵基本培养基BSM和5％(50g/L)的甘油，发酵罐灭菌，28％浓氨水调pH 4.0，加入PTM1(本领域公知，微量元素，促进酵母表达)4.35mL/L起始发酵液，接种量10％(v/v)，转速600rpm，温度30℃。待甘油浓度低于1％(10g/L)时，开始流加50％(w/v)的甘油(500g/L)补料培养基。

(3)甘油流加培养：流加50％(w/v)的甘油(500g/L)，控制温度28℃，pH 5.0，转速800rpm，维持甘油浓度为1％～2.5％(10g/L～25g/L)，始终监视溶氧，适时调节转速和通气量维持DO10％～20％，直至发酵终点。

发酵过程中取样测定菌体湿重、蛋白含量和酶活。结果显示，发酵168h酶活达到最高，发酵上清液酶活3500U/mL，蛋白浓度9.7g/L(图1)。

3、β-N-乙酰氨基己糖苷酶的纯化

高密度发酵结束后，取发酵液在10,000×g条件下离心5min，收集上清液，取50mL上清液置于Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 8.0)中透析过夜，透析结束后于10,000×g离心5min，获得粗酶液。粗酶液使用琼脂糖弱阴离子交换柱DE52(DEAE Sepharose Fast Flow)一步纯化重组蛋白。具体步骤如下：

用缓冲液A平衡DE52亲和柱5-10个柱体积，将收集的酶液以0.5mL/min流速上样，使用蛋白纯化系统(

GE Healthcare,USA)，将缓冲液A与缓冲液B线性洗脱至OD₂₈₀<0.05(洗脱程序：0-30min，A 100％；30-120min，A 100％-0，B 0-100％；120-135min，B100％；％表示体积百分含量)，收集具有β-N-乙酰氨基己糖苷酶活力的组分，SDS-PAGE检验纯度，透析得到纯化产物。

其中，缓冲液A为含有20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)；缓冲液B为含有NaCl(500mM)的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。

重组菌的粗酶液得到的纯化产物为重组蛋白HaHex74。

重组菌的粗酶液及其得到的纯化产物(重组蛋白HaHex74)的SDS-PAGE纯化图如图2所示。图2中，泳道M为分子量标准，泳道1为重组蛋白HaHex74粗酶，泳道2为HaHex74纯酶。图2的结果表明，重组蛋白HaHex74的大小约为74kDa，与预期大小一致。分别将粗酶液和纯酶液作为待测酶液，并以对应灭活的蛋白作为对照，检测β-N-乙酰氨基己糖苷酶的酶活力。表1所示粗酶液的总酶活力为3500U，其比酶活为360.8U mg^-1；纯酶液的总酶活力为2890U，其比酶活为385.3U mg^-1；纯化倍数为1.1。

表1 β-N-乙酰氨基己糖苷酶HaHex74的纯化表

4、β-N-乙酰氨基己糖苷酶的酶学性质

(1)最适pH的测定

将上述制备得到的HaHex74纯酶液作为待测酶液，将其分别在不同缓冲液体系中，于40℃下进行酶活测定，以最高酶活力为100％计算相对酶活。各种缓冲如下：

1)柠檬酸缓冲液(pH 5.0-6.0)

2)乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.0-6.0)

3)MES缓冲液(pH 5.5-6.5)

4)MOPS缓冲液(pH 6.5-7.5)

5)磷酸缓冲液(pH 6.0-8.0)

6)Tris-HCl缓冲液(pH 7.0-9.0)

7)甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 8.5-10.5)。

结果见图3中A：HaHex74的最适pH为6.5。

(2)pH稳定性测定

将HaHex74用上述缓冲液进行稀释，置于35℃水浴锅中处理30min，将其迅速置于冰水中冷却30min，然后测定酶活力。以未经处理的β-N-乙酰氨基己糖苷酶的酶活力作为100％，计算经过不同pH处理后HaHex74的相对酶活力。

结果如图3中B所示：HaHex74具有良好的pH稳定性，在pH 5.5-9.0范围内保温30min后仍残留80％以上的酶活力。

(3)最适温度的测定

将HaHex74用50mM磷酸缓冲液(pH 6.5)适当稀释后，分别在不同温度(20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70℃)测定酶活力。以最高酶活力为100％，计算相对酶活力。

结果见图3中C：HaHex74的最适温度为45℃。

(4)温度稳定性的测定

将HaHex74用50mM磷酸缓冲液(pH 6.5)适当稀释后，分别在不同温度(20、25、30、35、40、45、50、55、60℃)保温30min，将其迅速置于冰水中冷却30min，然后测定酶活力。以未经处理的β-N-乙酰氨基己糖苷酶的酶活力作为100％，计算经过不同温度处理后HaHex74的相对酶活力。

结果见图3中D：HaHex74在45℃以下具有良好的稳定性。

(4)底物特异性

分别以胶体几丁质、乙二醇几丁质、羧甲基纤维素(CMC)、壳聚糖溶液、对硝基苯基-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)和对硝基苯基-β-N-乙酰氨基半乳糖苷(pNP-GalNAc)等作为反应底物，在标准酶活力测定条件下检测酶活，考察酶的底物特异性，结果见表2。

表2 β-N-乙酰氨基己糖苷酶HaHex74的底物特异性

底物	比酶活(U mg<sup>-1</sup>)	相对活性(％)
			pNP-NAG	385.3±3.0	100
pNP-GalNAc	51.8±1.8	13.4
			(GlcNAc)<sub>2</sub>	73.4±1.0<sup>a</sup>	19.1
(GlcNAc)<sub>3</sub>	112.8±2.2	29.3
			(GlcNAc)<sub>4</sub>	54.3±1.2	14.1
(GlcNAc)<sub>5</sub>	44.2±2.3	11.5
			胶体几丁质	0.14±0.06	0.04
乙二醇几丁质	-	-
			壳聚糖	-	-
CMC	-	-

注：^a对几丁寡糖酶活测定方法：取0.1mL适当稀释的酶液，加入到0.1mL 1％(质量体积比，10g/L)的几丁寡糖底物溶液中(用50mM，pH 6.5的磷酸缓冲液配制)，45℃水浴反应10min。采用高效液相色谱(HPLC)法测定所释放的β-N-乙酰氨基葡萄糖量，以β-N-乙酰氨基葡萄糖作为标准。HPLC测定条件为：HPLC-RID检测系统(Agilent 1260infinity II,Agilent Technologies,USA)BP-800Pb++层析柱(Benson Polymeric,Reno,NE,7.8×300mm,USA)，蒸馏水作为流动相，柱温80℃，流速为1mL·min^-1。β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活力单位定义为：在上述反应条件下，每分钟反应生成1μmol的β-N-乙酰氨基葡萄糖所需要的酶量为一个酶活力单位(1U)。

结果显示：HaHex74对pNP-NAG的酶活最高，为385.3U/mg；其次是几丁三糖、几丁二糖和几丁四糖。对胶体几丁质显示出微弱的活性(0.14U·mg^-1)，对乙二醇几丁质、壳聚糖和CMC没有显示出活性。

实施例3、合成LNT2条件的优化

合成LNT2的量利用HPLC测定。HPLC测定条件为：Waters XBridge BEH Amide5μm色谱柱(250×4.6mm)，72％乙腈，柱温45℃，流速0.5mL/min，45min，示差(RID)检测器。

转糖苷产物得率(％)＝合成产物的浓度(mM)/糖苷供体的初始浓度(mM)×100

1、最适pH的测定

将实施例2制备得到的HaHex74纯酶液作为待测酶液，将其分别在不同缓冲液体系中，测定LNT2含量。各种缓冲如下：

1)MES缓冲液(pH 5.5-6.5)

2)磷酸缓冲液(pH 6.0-8.0)

3)Tris-HCl缓冲液(pH 7.0-9.0)

结果见图4中A：HaHex74合成LNT2最适pH为7.5。

2、最适温度的测定

将实施例2制备得到的HaHex74纯酶液作为待测酶液，将反应体系置于不同温度(20-55℃)下水浴反应1.5h，测定LNT2含量。

结果见图4中B：HaHex74合成LNT2最适温度为40℃。

3、最适反应时间的测定

将实施例2制备得到的HaHex74纯酶液作为待测酶液，将反应体系置于40℃下水浴反应不同时间，测定LNT2含量。

结果见图4中C：HaHex74合成LNT2最适反应时间为2.5h。

4、最适乳糖浓度的测定

将实施例2制备得到的HaHex74纯酶液作为待测酶液，将不同浓度的β-乳糖加入反应体系中，40℃下水浴反应2.5h，测定LNT2含量。

结果见图4中D：HaHex74合成LNT2最适乳糖浓度为0.8M。

5、最适加酶量的测定

将实施例2制备得到的HaHex74纯酶液作为待测酶液，在反应体系中加入不同浓度的HaHex74，40℃下水浴反应2.5h，测定LNT2含量。

结果见图4中E：HaHex74合成LNT2最适加酶量为3-5U·mL^-1。

实施例4、合成LNT2的纯化和结构鉴定

实施例3优化条件反应后的产物通过HPLC纯化。收集的产物经TLC分析验证纯度(展层剂为正丁醇：乙醇：水＝2:1:1(v/v/v)，显色剂为甲醇：硫酸＝95:5(v/v))，冷冻干燥后的样品为白黄色粉末。

将样品溶解于纯水中，使用Thermo Scientific^TM Q Exactive^TM质谱仪，在ESI离子源positive-ion模式下，采集样品的高分辨率一级质谱图。

将样品溶解于D₂O中并转移到核磁专用试管中，加入DSS(3-(三甲基硅基)-1-丙磺酸钠)作为内标，使用500MHz Varian V NMR SYSTEM^TM设备，在298K温度条件下采集信号。使用Agilent DD2 500MHz核磁共振波谱仪分析所有样品的一维¹H和¹³C光谱，二维¹H-¹³C异核单量子相干波谱(heteronuclear single quantum coherencespectroscopy，HSQC)使用Agilent提供的标准脉冲序列和相关参数获得。

结果表明，纯化后的产物在一级高分辨率质谱图中在质荷比(m/z)[M+Na]⁺为568.3处呈现单一离子峰(图5)，表明该产物的分子量为545.3，这与LNT2的分子量(545)一致。之前HaHex74合成产物HPLC分析显示在目标产物处有一个主峰和一个次要峰，经质谱分析显示其为同分异构体。

进一步通过NMR测定该转糖苷产物的结构，由一维¹H及¹³C图谱可获得该化合物¹H质子的化学位移(图6)和¹³C的化学位移(图7)。由二维异核单量子关系(HSQC)谱图可获得化合物碳氢原子之间的关系(图8)。经数据比对，HaHex74产物与双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)来源的β-N-乙酰氨基己糖苷酶突变株转糖苷产物一致(

etal.Glycosynthase principle transformed into biocatalytic process technology:Lacto-N-triose II production with engineered exo-hexosaminidase.ACSCatal.2019,9,5503-5514)，表明该化合物为LNT2。

实施例5、LNT2的制备

1、以几丁质为起始原料

将120g球磨几丁质粉末(3％，w/v)(江正强等，CN201811105536)溶于4L 20mM的柠檬酸缓冲液中(pH 5.5)，加入5U·mL^-1的几丁质酶(Yang et al.Cloning,expression,purification and application of a novel chitinase from a thermophilic marinebacterium Paenibacillus barengoltzii.Food Chem.,2016,192,1041-1048)，至于55℃下酶解24h。

2、LNT2的制备

将步骤1水解产物(几丁二糖和N-乙酰氨基葡萄糖混合物)离心取上清，再浓缩10倍，加入NaH₂PO₄调节pH至7.5，加入0.8M的β-乳糖和4U·mL^-1HaHex74(实施例2获得的HaHex74纯酶液)，40℃下反应一定时间，间隔时间取样，利用HPLC测定LNT2含量(测定条件见实施例3)。

LNT2转化率(％)＝合成LNT2量(M)/几丁二糖的量(M)×100％；其中M表示物质的量。

结果显示，反应10h，LNT2的量达到最高，转化率为13-20％，其浓度达到8-12g·L^-1(图9)。

实施例6、LNnT的制备

上述实施例5反应产物中多余β-乳糖利用活性炭柱法(75×1.5cm)去除，使用梯度混合仪(TH-2000，上海青浦沪西仪器厂)，利用0-25％(v/v)的乙醇溶液以1mL min^-1的流速将上述实施例5反应产物进行梯度洗脱，收集洗脱液，利用TLC(条件见实施例4)和HPLC检测产物(条件见实施例3)。将经过活性炭柱的溶液浓缩10倍，pH自然(pH 7.0)，加入0.1U mL^-1的β-半乳糖苷酶(Zeuner et al.Thermostableβ-galactosidases for the synthesis ofhuman milk oligosaccharides.New Biotechnol.,2016,33,355-360)于50℃下反应一定时间，间隔取样，所有样品与沸水浴中灭活10min。将所有样品进行HPLC分析(条件见实施例3)。

LNnT转化率(％)＝合成LNnT量(M)/乳糖的量(M)×100％；其中M表示物质的量。

结果显示，经过碳柱并浓缩的LNT2溶液中含有20mMβ-乳糖和90mM LNT2，反应10h，LNnT的量达到最高，转化率为7-21％，其浓度达到1-3g·L^-1(图10)。

以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

<110> 中国农业大学

<120> Haloferula sp. β-N-乙酰氨基己糖苷酶在合成人乳寡糖中的应用

<130> GNCLN201167

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 491

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atcctttttt gtagaaatgt cttggtgtcc tcgtccaatc aggtagccat ctctgaaata 60

tctggctccg ttgcaactcc gaacgacctg ctggcaacgt aaaattctcc ggggtaaaac 120

ttaaatgtgg agtaatggaa ccagaaacgt ctcttccctt ctctctcctt ccaccgcccg 180

ttaccgtccc taggaaattt tactctgctg gagagcttct tctacggccc ccttgcagca 240

atgctcttcc cagcattacg ttgcgggtaa aacggaggtc gtgtacccga cctagcagcc 300

cagggatgga aaagtcccgg ccgtcgctgg caataatagc gggcggacgc atgtcatgag 360

attattggaa accaccagaa tcgaatataa aaggcgaaca cctttcccaa ttttggtttc 420

tcctgaccca aagactttaa atttaattta tttgtcccta tttcaatcaa ttgaacaact 480

atcaaaacac a 491

<210> 2

<211> 745

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Tyr Val Glu Phe Glu Pro Thr

85 90 95

Ile Ile Pro Leu Pro Lys Glu Met Lys Glu Gly Gln Gly Ser Phe Pro

100 105 110

Val Ser Pro Glu Thr Gly Ile Arg Tyr Asp Ala Ala Leu Asp Gly Ile

115 120 125

Thr Lys Leu Phe Ala Ala Asp Leu Lys Glu Arg Thr Gly Gln Glu Pro

130 135 140

Lys Thr Val Arg Glu Glu Leu Arg Ile Met Leu Pro Ser Glu Ile Arg

145 150 155 160

Leu Asp Leu Asp Asn Ser Leu Asp Leu Lys Pro Gly Gly Tyr Lys Leu

165 170 175

Glu Val Thr Pro Lys Gly Val Thr Val Ile Gly Lys Asp Val Ala Gly

180 185 190

Ala Trp Tyr Gly Thr Arg Ser Ile Leu Gln Met Leu Pro Ala Lys Gly

195 200 205

Thr Asp Ala Trp Thr Asp Lys Ala Gly Ala Pro Val Pro Val Val Ser

210 215 220

Ile Thr Asp Glu Pro Arg Phe Val Trp Arg Gly Met His Leu Asp Val

225 230 235 240

Gly Arg His Phe Phe Pro Ala Glu Asp Ile Lys Lys Phe Ile Asp Trp

245 250 255

Leu Ala Phe His Lys Leu Asn Thr Phe His Trp His Leu Ser Glu Asp

260 265 270

Gln Gly Trp Arg Ile Glu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Thr Glu Val

275 280 285

Gly Ala Phe Arg Asp Ser Ser Pro Pro Tyr Gly Asn Arg Asn Ser Asp

290 295 300

Asp Gly Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Tyr Thr Gln Glu Gln Ile Lys Asp

305 310 315 320

Ile Val Ala Tyr Ala Ala Ala Arg Gln Ile Thr Ile Val Pro Glu Ile

325 330 335

Asp Met Pro Gly His Met Ala Ala Ala Ile Ala Ala Tyr Pro Glu Phe

340 345 350

Gly Asn Ser Asp Ile Pro Gly Tyr Ala Pro Lys Val Ile Gly Arg Trp

355 360 365

Gly Val His Pro Tyr Thr Leu Ala Pro Thr Glu Glu Thr Phe Arg Phe

370 375 380

Val Asp Asp Val Leu Thr Glu Leu Cys Ala Leu Phe Pro Ser Gln Tyr

385 390 395 400

Ile His Ile Gly Gly Asp Glu Ala Pro Lys Asp Gln Trp Glu Lys Ser

405 410 415

Pro Arg Val Lys Glu Leu Met Lys Lys Glu Gly Leu Lys Asp Gly His

420 425 430

Asp Val Gln Ser Tyr Phe Ile Lys Arg Val Glu Lys Met Leu Glu Lys

435 440 445

Lys Gly Arg Lys Leu Val Gly Trp Asp Glu Ile Arg Glu Gly Gly Leu

450 455 460

Ser Pro Asn Ala Thr Val Met Ser Trp Arg Gly Glu Gly Gly Gly Ile

465 470 475 480

Ala Ser Ala Lys Glu Gly His Asp Val Val Met Ala Ser Asn Ser His

485 490 495

Leu Tyr Phe Asp His Tyr Gln Gly Val Ala Lys Asp Glu Leu Ala Lys

500 505 510

Gly Glu Gln Phe Glu Ala Ile Gly Gly Phe Leu Pro Ile Ser Lys Val

515 520 525

Tyr Ser Tyr Asp Pro Val Pro Lys Ala Leu Ser Pro Ala Glu Ala Lys

530 535 540

His Val Leu Gly Val Gln Ala Gln Leu Trp Thr Glu Tyr Met Lys Asp

545 550 555 560

Trp Tyr Lys Val Glu Tyr Met Ala Phe Pro Arg Val Ala Ala Leu Ser

565 570 575

Glu Val Ala Trp Thr Pro Val Glu Arg Lys Asp Tyr Ala Gly Phe Arg

580 585 590

Gly Arg Leu Asp Gly Ile Leu Lys His Tyr Asp Ala Ala Gly Val Lys

595 600 605

His Gly Asp Pro Leu Asp Pro Pro Lys Arg Glu Thr Lys Asp Gly Ser

610 615 620

Thr Ile Thr Thr Ser Leu Gly Ala Tyr Gln Asp His Trp Pro Glu Phe

625 630 635 640

Ala Tyr Asp Gly Lys Pro Gly Thr Phe Phe Trp Ala Asp Arg Ala Leu

645 650 655

Lys Ala Asp Asp His Val Thr Leu Lys Phe Arg Ala Ala Val Ser Gly

660 665 670

Lys Ala Lys Val Val Thr Gly Gly Pro Ala Ser Gln Asn Gly Asp Lys

675 680 685

Leu Ala Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Ser Asp Gly Ser Gln Trp Thr

690 695 700

Gln Val Ala Glu Phe Lys Asp Gly Ser Ala Glu Gly Ala Leu Pro Ala

705 710 715 720

Gly Thr Thr Gly Leu Arg Ile Arg Val Thr Lys Pro Gln Glu Asn Trp

725 730 735

Leu Ile Ile His Glu Ile Thr Val Glu

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<210> 3

<211> 2238

<212> DNA

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<400> 3

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttac gtagaattcg aaccaaccat tattccattg 300

ccaaaagaga tgaaggaggg tcaaggtagt ttcccagttt ccccagagac aggtattaga 360

tatgatgctg ctttggatgg tattactaaa ttgttcgctg ctgatttgaa ggaaagaact 420

ggtcaagagc caaagactgt tagagaagag ttgagaatca tgttgccttc tgaaatcaga 480

ttggatttgg ataactcttt ggatttgaag ccaggtggtt acaaattgga ggttactcct 540

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aaattgaaca cttttcattg gcacttgtct gaagatcaag gttggagaat tgagattaag 840

aaatacccta agttgactga agttggtgct ttcagagatt cttctccacc ttatggtaac 900

agaaattctg atgatggtaa aagatacggt ggtttctaca ctcaagagca aattaaggat 960

attgttgctt acgctgctgc tagacaaatc actatcgttc cagaaatcga tatgcctggt 1020

catatggctg ctgctattgc tgcttaccca gagttcggta attctgatat tccaggttat 1080

gctcctaagg ttattggtag atggggtgtt cacccataca ctttggctcc tactgaagag 1140

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agagttgaaa agatgttgga gaagaaaggt agaaagttgg ttggttggga tgaaattaga 1380

gagggtggtt tgtctccaaa cgctactgtt atgtcttgga gaggtgaagg tggtggtatt 1440

gcttctgcta aagagggtca tgatgttgtt atggcttcta attctcattt gtacttcgat 1500

cactaccaag gtgttgctaa agatgaattg gctaagggtg aacaattcga ggctattggt 1560

ggtttcttgc caatttctaa ggtttactct tatgatccag ttcctaaagc tttgtctcct 1620

gctgaagcta agcacgtttt gggtgttcaa gctcaattgt ggactgaata catgaaggat 1680

tggtacaaag ttgagtatat ggctttccca agagttgctg ctttgtctga agttgcttgg 1740

actcctgttg agagaaaaga ttacgctggt tttagaggta gattggatgg tattttgaag 1800

cattacgatg ctgctggtgt taagcacgga gatccattgg atccacctaa gagagaaact 1860

aaggatggtt ctactatcac tacttctttg ggtgcttacc aagatcattg gccagagttc 1920

gcttatgatg gtaaacctgg tactttcttt tgggctgata gagctttgaa agctgatgat 1980

cacgttactt tgaagtttag agctgctgtt tctggtaaag ctaaagttgt tactggtggt 2040

ccagcttctc aaaatggaga taaattggct ggtggtgttt tggaagcttc ttctgatggt 2100

tctcaatgga ctcaagttgc tgagtttaag gatggttctg ctgagggtgc tttgcctgct 2160

ggtactactg gtttgagaat cagagtcact aaaccacaag aaaactggct tattatccac 2220

gaaatcaccg ttgagtaa 2238

Claims

1.HaHex74蛋白或其相关生物材料在如下任一中的应用：

(a1)合成人乳寡糖；

(a2)合成乳糖-N-三糖Ⅱ和/或乳糖-N-新四糖；

所述HaHex74蛋白为如下任一：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的第94-745位或SEQ ID No.2的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述相关生物材料为能够表达所述HaHex74蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

2.一种合成乳糖-N-三糖Ⅱ的方法，包括如下步骤(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)以HaHex74蛋白为生物酶，催化几丁质水解物和β-乳糖合成乳糖-N-三糖Ⅱ；

(b2)以几丁质酶催化几丁质水解，得到几丁质水解物；然后以HaHex74蛋白催化所述几丁质水解物和β-乳糖合成乳糖-N-三糖Ⅱ；

(b3)以几丁质酶和HaHex74蛋白为生物酶，催化几丁质和β-乳糖合成乳糖-N-三糖Ⅱ；

所述HaHex74蛋白为如下任一：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的第94-745位或SEQ ID No.2的蛋白质；

3.一种合成乳糖-N-新四糖的方法，包括如下步骤(c1)或(c2)：

(c1)按照权利要求2所述方法制备得到乳糖-N-三糖Ⅱ；然后以β-半乳糖苷酶催化乳糖-N-三糖Ⅱ和β-乳糖合成乳糖-N-新四糖；

(c2)以几丁质酶、HaHex74蛋白和β-半乳糖苷酶为生物酶，催化几丁质和β-乳糖合成乳糖-N-三糖Ⅱ和乳糖-N-新四糖；

所述HaHex74蛋白为如下任一：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的第94-745位或SEQ ID No.2的蛋白质；

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述(b1)和所述(b2)中，所述几丁质水解物为几丁二糖和N-乙酰氨基葡萄糖混合物。

5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：以所述HaHex74蛋白为生物酶，催化所述几丁质水解物和β-乳糖合成乳糖-N-三糖Ⅱ时的pH为7.5，和/或温度为40℃，和/或β-乳糖在反应体系中的含量为0.8M，和/或所述HaHex74蛋白在反应体系中的含量为3-5U/mL，和/或反应时间为10h。

6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于：在以所述几丁质酶催化几丁质水解，得到所述几丁质水解物的过程中，pH为5.5，和/或温度为55℃，和/或所述几丁质酶在反应体系中的含量为5U/mL，和/或反应时间为24h。

7.根据权利要求2-6任一所述的方法，其特征在于：在以所述β-半乳糖苷酶催化乳糖-N-三糖Ⅱ和β-乳糖合成乳糖-N-新四糖的过程中，温度为50℃，和/或所述β-半乳糖苷酶在反应体系中的含量为0.1U/mL，和/或反应时间为10h。

8.根据权利要求1-7中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述HaHex74蛋白是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将编码所述HaHex74蛋白的核酸分子导入受体酵母，得到重组酵母；按照如下步骤对所述重组酵母进行发酵培养，从发酵产物中获得所述HaHex74蛋白：

9.根据权利要求8所述的应用或方法，其特征在于：从所述发酵产物中获得所述HaHex74蛋白是按照包括如下步骤的方法进行的：将所述发酵产物离心收集上清液；将所述上清液置于Tris-HCl缓冲液中透析，离心得到粗液；将所述粗液使用琼脂糖弱阴离子交换柱DE52纯化得到所述HaHex74蛋白。

10.根据权利要求8或9所述的应用或方法，其特征在于：编码所述HaHex74蛋白的核酸分子为如下任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.3的第280-2238位或SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述HaHex74蛋白的DNA分子；

(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述HaHex74蛋白的DNA分子；

和/或

所述核酸分子是通过重组载体的形式导入所述受体酵母中的；

进一步地，所述重组载体中启动所述核酸分子转录的启动子为GAP启动子；

和/或

所述酵母为毕赤酵母；

进一步地，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。