CN109593745A - 一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体 - Google Patents

一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体 Download PDF

Info

Publication number
CN109593745A
CN109593745A CN201910057350.4A CN201910057350A CN109593745A CN 109593745 A CN109593745 A CN 109593745A CN 201910057350 A CN201910057350 A CN 201910057350A CN 109593745 A CN109593745 A CN 109593745A
Authority
CN
China
Prior art keywords
muty257t
mutant
ala
leu
asp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910057350.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109593745B (zh
Inventor
张蕊
周峻沛
黄遵锡
李娜
岑潇龙
唐湘华
许波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yunnan Normal University
Original Assignee
Yunnan Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yunnan Normal University filed Critical Yunnan Normal University
Priority to CN201910057350.4A priority Critical patent/CN109593745B/zh
Publication of CN109593745A publication Critical patent/CN109593745A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109593745B publication Critical patent/CN109593745B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体，涉及基因工程及蛋白质改造技术领域。具体来说是一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体MutY257T，突变体MutY257T的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。MutY257T可降解三七皂苷R1，产物为人参皂苷Rg1；但该突变体几乎不能降解三七皂苷R2。本发明的木糖苷酶突变体MutY257T可应用于医药、保健品等行业。

Description

一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种木糖苷酶突变体MutY257T及其应用，具体为一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体。
背景技术
木聚糖广泛存在于植物和藻类中，其主链主要由木糖分别经β-1,4糖苷键和β-1,3糖苷键聚合而成。木糖苷酶属于木聚糖降解酶，其能水解内切木聚糖酶作用于木聚糖后的产物——木寡糖，形成木糖，已报导的大部分木糖苷酶是β-1,4键糖苷水解酶(PhuengmaungP et al.Enzyme and Microbial Technology,2018,112:72–78.)。
除了木聚糖外，一些天然成分也含有木糖。三七皂苷R1和R2含有木糖基团，该木糖基团与相邻的葡萄糖基团以β-1,2糖苷键进行连接(图1)，而不是与其它木糖基团经β-1,4糖苷键相连接。基于以上原因，再加上底物昂贵造成筛选不便等原因，已发现的能去除三七皂苷R1和R2中木糖基团的木糖苷酶非常稀少。
去除三七皂苷R1和R2中的木糖基团，可分别得到人参皂苷Rg1和Rh1。人参皂苷Rg1具有保护神经、保肝、抗氧化、抗衰老、防治老年痴呆等作用，在药品和保健品中具有应用价值(Gao Y et al.Journal of Ethnopharmacology,2017,206:178–183.)。由于三七皂苷R1和R2在结构上较相似，有些能水解三七皂苷R1的木糖苷酶也能水解三七皂苷R2(Shin KCet al.Biotechnology Letters,2014,36:2275–2281.)，从而在制备人参皂苷Rg1时易形成副产物人参皂苷Rh1，不利于人参皂苷Rg1的纯化。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的旨在提供一种能选择性地将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体MutY257T，可应用于医药、保健品等行业。
为了实现该技术目标，本发明具体通过以下技术方案实现：
通过蛋白与底物的分子对接等生物信息学技术，本发明设计了木糖苷酶突变体MutY257T，所述的突变体MutY257T的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，与数据库记录的木糖苷酶序列JB13GH39(序列号MG838204翻译蛋白序列；SEQ ID NO.3)相比，MutY257T在JB13GH39的第257位点发生了突变，即JB13GH39的第257位点是氨基酸“Y”，而在MutY257T序列中对应的氨基酸是第243位点“T”。
用于编码所述的木糖苷酶突变体MutY257T的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的另一方面，还提供了一种包含木糖苷酶突变体MutY257T编码基因的重组载体。
在本发明的另一方面，还提供了一种包含木糖苷酶突变体MutY257T编码基因的重组菌。
本发明所述的木糖苷酶突变体MutY257T的制备方法，具体包括以下步骤：
1)扩增或基因合成野生酶JB13GH39无信号肽的编码序列，如SEQ ID NO.4所示；
2)将1)中序列与表达载体pEasy-E2进行连接，得到重组表达质粒pEasy-E2-jB13GH39；
3)以重组质粒pEasy-E2-jB13GH39为模板，根据南京诺唯赞生物科技有限公司突变试剂盒Mut II Fast Mutagenesis Kit V2方法进行突变和重组，突变引物为5'ACAGCaccGGCGTCGATGGCGGCTTTCTCGAC 3'和5'ATCGACGCCggtGCTGTGCGTGGTGACGAAAT 3'，得到含MutY257T编码基因的重组质粒pEasy-E2-Mu tY257T；
4)用质粒pEasy-E2-MutY257T转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得包含MutY257T编码基因的重组菌株；
5)培养重组菌株，诱导木糖苷酶突变体MutY257T表达；
6)回收并纯化所表达的木糖苷酶突变体MutY257T。
在本发明的另一方面，上述所述的突变体MutY257T在制备医药和保健品中的应用也在本发明的保护范围之内。
本发明的有益效果为：
与野生酶JB13GH39相比，突变酶MutY257T保持了降解三七皂苷R1的能力，但突变酶MutY257T几乎不能降解三七皂苷R2。
附图说明
图1：利用木糖苷酶将三七皂苷R1和R2分别转化为人参皂苷Rg1和Rh1的示意图；
图2：在大肠杆菌中表达的野生酶JB13GH39及其突变体MutY257T的SDS-PAGE分析，其中，M：蛋白质Marker；W：纯化的野生酶JB13GH39；257：纯化的突变体MutY257T；
图3：纯化的野生酶JB13GH39水解三七皂苷R1的HPLC分析；a：人参皂苷Rg1，b：三七皂苷R1，c：三七皂苷R1+JB13GH39；
图4：纯化的野生酶JB13GH39水解三七皂苷R2的HPLC分析；a：人参皂苷Rh1，b：三七皂苷R2，c：三七皂苷R2+JB13GH39；
图5：纯化的突变体MutY257T水解三七皂苷R1的HPLC分析；a：人参皂苷Rg1，b：三七皂苷R1，c：三七皂苷R1+MutY257T；
图6：纯化的突变体MutY257T水解三七皂苷R2的HPLC分析；a：人参皂苷Rh1，b：三七皂苷R2，c：三七皂苷R2+MutY257T。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明以下实施例中的实验材料和试剂：
菌株及载体：鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC 1.10968，由云南师范大学提供；大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)和表达载体pEasy-E2购于北京全式金生物技术有限公司。
酶类及其它生化试剂：Nickel-NTA Agarose购自QIAGEN公司，DNA聚合酶、dNTP及II试剂盒购自南京诺维赞公司，三七皂苷R1和R2及人参皂苷Rg1和Rh1购自上海源叶生物科技有限公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1野生酶JB13GH39表达载体的构建和转化
1)提取鞘氨醇单胞菌基因组DNA
将培养2d的液体菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液，裂解液组成为：50mM Tris，20mM EDTA，NaCl 500mM，2％SDS(w/v)，pH8.0，70℃水浴裂解60min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。
2)扩增或基因合成野生酶JB13GH39无信号肽的编码序列
根据GenBank记录的木糖苷酶核苷酸序列MG838204，设计引物5'GCAACTCTCTGCACGGCTCCGG 3'和5'CTTTCGCTCCTTGGGTGCAATTGAC 3'，以鞘氨醇单胞菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min 30sec，30个循环后72℃保温10min。
PCR结果得到木糖苷酶基因jB13GH39(SEQ ID No.4)，并在该基因3’端引入突出的A碱基。将木糖苷酶基因jB13GH39和表达载体pEasy-E2通过T-A方式相连接，获得含有jB13GH39的重组表达质粒pEasy-E2-jB13GH39。将pEasy-E2-jB13GH39转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/jB13GH39。木糖苷酶基因jB13GH39(SEQ IDNo.4)也可以通过基因合成得到。
实施例2突变酶MutY257T表达载体的构建和转化
以重组质粒pEasy-E2-jB13GH39为模板，根据南京诺唯赞生物科技有限公司突变试剂盒Mut II Fast Mutagenesis Kit V2方法进行突变和重组，突变引物为5'ACAGCaccGGCGTCGATGGCGGCTTTCTCGAC 3'和5'ATCGACGCCggtGCTGTGCGTGGTGACGAAAT 3'，PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环后72℃保温10min。
结果得到含MutY257T编码基因的重组质粒pEasy-E2-MutY257T，用质粒pEasy-E2-MutY257T转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得包含MutY257T编码基因的重组菌株BL21(DE3)/MutY257T。
实施例3野生酶JB13GH39和突变酶MutY257T的制备
将重组菌株BL21(DE3)/jB13GH39和BL21(DE3)/MutY257T以0.1％的接种量分别接种于LB(含100μg mL-1 Amp)培养液中，37℃快速振荡16h。
然后将此活化的菌液分别以1％接种量接种到新鲜的LB(含100μg mL-1 Amp)培养液中，快速振荡培养约2–3h(OD600达到0.6–1.0)后，加入终浓度0.7mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h或26℃振荡培养约8h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0McIlvaine缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经12,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose和0–500mM的咪唑分别亲和和洗脱目的蛋白。SDS-PAGE结果(图2)表明，野生酶JB13GH39和突变酶MutY257T都得到了纯化，产物为单一条带。
实施例4纯化的野生酶JB13GH39和突变酶MutY257T降解三七皂苷R1和R2的测定
1)降解三七皂苷R1和R2
反应体系400μl，含终浓度为4mM的三七皂苷R1或三七皂苷R2、纯化的野生酶JB13GH39(约10ug)或突变酶MutY257T(约10μg)；缓冲液为McIlvaine buffer，pH 4.5；在30℃下反应24h。以同样条件下处理但未加酶液的样品为对照。
2)样品萃取
反应后的样品及对照用正丁醇萃取。向400μl样品中加入400μl正丁醇萃取，静置数分钟分层后吸取上层液体；再用400μl正丁醇萃取第二次，吸取上层液体；最后用200μl正丁醇萃取第三次，吸取上层液体。蒸发去除样品中的萃取剂。
3)高效液相检测
用甲醇溶解样品。仪器：安捷伦1100HPLC；色谱柱：Agilent Hypersil ODS 5um4.0×250mm；检测波长203nm。
三七皂苷R1和人参皂苷Rg1分析：流速1.0mL/min，流动相为20％乙腈：80％水，等度洗脱。
三七皂苷R2和人参皂苷Rh1分析：
流速1.5mL/min；
流动相条件：
Omin，20％乙腈：80％水，
20min，20％乙腈：80％水，
45min，46％乙腈：54％水，
55min，55％乙腈：45％水，
60min，55％乙腈：45％水。
经检测，三七皂苷R1被野生酶JB13GH39全部降解，产物为人参皂苷Rg1(图3)；约90％的三七皂苷R2被野生酶JB13GH39降解，产物为人参皂苷Rh1(图4)。57％的三七皂苷R1被突变酶MutY257T降解，产物为人参皂苷Rg1(图5)；但三七皂苷R2几乎未被突变酶MutY257T降解(图6)。以上结果表明，野生酶JB13GH39和突变酶MutY257T在降解三七皂苷R2上具有较大差异。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 云南师范大学
<120> 一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 536
<212> PRT
<213> 突变酶(MutY257T)
<400> 1
Met Glu Leu Ala Leu Ala Thr Leu Cys Thr Ala Pro Ala Arg Ala Ile
1 5 10 15
Ala Pro Ala Asp Arg Glu Ile Thr Val Asp Leu Ala Arg Ala Gly Arg
20 25 30
Pro Leu Asp Arg Phe Tyr Asn Phe Ser Val Gly Ser Asp Tyr Pro Gly
35 40 45
Thr Leu Ile Arg Thr Asp Ser Gln Ala Gln Leu Lys Thr Ala Val Asp
50 55 60
Glu Leu Gly Phe Arg Tyr Leu Arg Phe His Gly Ile Phe His Asp Val
65 70 75 80
Leu Gln Thr Val Arg Leu Val Asp Gly Lys Thr Val Tyr Asp Trp Arg
85 90 95
Gly Ile Asp Arg Leu Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Arg Arg Ile Arg Pro
100 105 110
Phe Val Glu Leu Ser Phe Thr Pro Asp Ala Leu Ala Thr Ser Pro Gln
115 120 125
Thr Ile Phe Tyr Trp Lys Gly Asn Thr Ser His Pro Lys Pro Asp Gly
130 135 140
Trp Arg Asn Leu Ile Asp Ala Phe Val Arg His Leu Glu Ala Arg Tyr
145 150 155 160
Gly Pro Ala Glu Val Arg Arg Trp Tyr Phe Glu Val Trp Asn Glu Pro
165 170 175
Asn Leu Ser Gly Phe Trp Glu Gly Ala Asp Gln Lys Ala Tyr Phe Glu
180 185 190
Leu Tyr Asp Ser Thr Ala Arg Thr Ile Lys Ala Ile Asp Pro Asp Leu
195 200 205
Gln Val Gly Gly Pro Ala Thr Ala Gly Ala Ala Trp Val Pro Glu Phe
210 215 220
Leu Asp Tyr Ala Ala Ala His His Thr Pro Val Asp Phe Val Thr Thr
225 230 235 240
His Ser Thr Gly Val Asp Gly Gly Phe Leu Asp Glu Asn Gly Lys Ser
245 250 255
Asp Thr Lys Leu Ser Ala Asp Pro Asn Ala Ile Ile Gly Asp Val Lys
260 265 270
Lys Val Arg Ala Gln Ile Ser Ala Ser Pro Phe Pro Asn Leu Pro Leu
275 280 285
Tyr Phe Thr Glu Trp Ser Thr Ser Tyr Thr Pro Arg Asp Ala Val His
290 295 300
Asp Ser Tyr Ile Ser Ala Pro Tyr Ile Leu Ser Arg Ile Lys Ala Val
305 310 315 320
Ala Gly Glu Val Gln Gly Met Ser Tyr Trp Thr Tyr Ser Asp Leu Phe
325 330 335
Glu Glu Pro Gly Pro Pro Thr Ala Pro Phe Gln Gly Gly Phe Gly Leu
340 345 350
Leu Asn Pro Glu Gly Ile Arg Lys Pro Ala Phe Phe Ala Tyr Lys Tyr
355 360 365
Leu Asn Ala Leu Asp Gly Arg Val Ile Pro Thr Ala Asp Ala Gln Val
370 375 380
Met Ala Thr Thr Asp Gly Ser Ser Thr Glu Val Leu Leu Trp Asp Trp
385 390 395 400
Gln Gln Pro Lys Gln Pro Val Ser Asn Arg Pro Phe Tyr Thr Lys Leu
405 410 415
Val Pro Ser Thr Gln Ala Ser Pro Ala Arg Val Ala Phe Glu His Leu
420 425 430
Trp Pro Gly Arg Tyr Arg Val Arg Ala Tyr Arg Thr Gly Tyr Arg His
435 440 445
Asn Asp Ala Tyr Ser Ala Tyr Ile Asp Met Gly Leu Pro Lys Thr Leu
450 455 460
Asp Ala Ala Gln Leu Thr Arg Leu Gln Gln Leu Thr Arg Asp Leu Pro
465 470 475 480
Val Val Asp Arg Met Ala Thr Ile Asp Gly Thr Gly Gln Phe Asp Ile
485 490 495
Glu Met Pro Met Arg Ser Asn Asp Ile Val Leu Val Thr Leu Ser Pro
500 505 510
Met Ser Ser Ala Ser Ile Ala Pro Lys Glu Arg Lys Lys Gly Gln Phe
515 520 525
Leu Glu His His His His His His
530 535
<210> 2
<211> 1611
<212> DNA
<213> 突变酶基因(mutY257T)
<400> 2
atggaattgg cccttgcaac tctctgcacg gctccggcga gggcgattgc gcccgctgac 60
cgcgaaatta cggtcgatct agcgcgggcg ggcagaccgc tcgaccgctt ctataatttc 120
tccgtcggct ccgattatcc gggcacgctg atccgcaccg attcgcaggc gcagctcaaa 180
accgcagtcg acgaactggg tttccgttat ctccgcttcc acgggatctt ccacgacgtg 240
ctgcagacgg tgcgcctggt tgatggcaag acggtatatg actggcgagg catcgaccgg 300
ctctatgacg atctgctggc gcgccgcatc cgtccctttg tcgagctcag cttcacgcct 360
gatgcgctcg cgacctcgcc ccagacgatc ttttactgga agggcaatac ctctcatccg 420
aagcccgatg gctggcgcaa cctgatcgac gcgttcgttc gacatctcga ggcgcgctac 480
ggccccgccg aggtgcgacg ctggtatttc gaggtttgga acgagcccaa tctcagcggc 540
ttttgggagg gcgcggatca aaaggcctat ttcgaactat acgattccac cgcgcgaacc 600
atcaaggcga tcgacccgga tctacaggtc ggcggtccgg cgacggcggg agcagcttgg 660
gtgcccgagt ttctcgacta tgccgcggcc catcatacgc cggtcgattt cgtcaccacg 720
cacagcaccg gcgtcgatgg cggctttctc gacgagaacg gcaaaagtga caccaagctg 780
tcggccgatc ccaacgcgat catcggcgat gtgaagaagg taagggcgca gatcagcgcc 840
tcgccatttc cgaacctgcc actctatttc accgaatgga gcaccagcta cacgccgcgc 900
gatgccgtgc acgattccta tatcagcgca ccttacatcc tgtcgcggat caaggcggtg 960
gcaggcgagg tccaaggcat gagctattgg acctattcgg atctgttcga ggagccgggg 1020
ccgcccacag cgcctttcca gggcggcttc gggctgctca atcccgaagg tatcagaaag 1080
ccggccttct tcgcctacaa atatctgaac gcgctcgacg ggcgcgttat cccgaccgca 1140
gatgcacagg tgatggcgac caccgatggt tcctccacgg aggtgttgct gtgggactgg 1200
cagcaaccga aacagcccgt cagtaaccgg ccgttctaca ccaagctggt gccatccacc 1260
caagcatcgc cggcgagagt cgcgttcgag catctgtggc ccggccgtta ccgggtgcgt 1320
gcctatcgca ccggctatcg ccataacgac gcttattcgg cctatatcga tatgggcctg 1380
ccgaagacgc tcgatgcggc gcaattgacc aggttgcagc aacttactcg cgacctgccg 1440
gtcgtcgatc gcatggcgac gatcgacggc accggccaat tcgatatcga gatgccgatg 1500
cgaagcaatg atatcgtgct cgtcacgctg tcgcccatgt catcggcgtc aattgcaccc 1560
aaggagcgaa agaagggcca attcctcgag caccaccacc accaccactg a 1611
<210> 3
<211> 538
<212> PRT
<213> 野生酶(JB13GH39)
<400> 3
Met Ala Met Gly Arg Ser Ile Met Ile Arg Arg Met Ala Met Cys Val
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Thr Leu Cys Thr Ala Pro Ala Arg Ala Ile Ala Pro
20 25 30
Ala Asp Arg Glu Ile Thr Val Asp Leu Ala Arg Ala Gly Arg Pro Leu
35 40 45
Asp Arg Phe Tyr Asn Phe Ser Val Gly Ser Asp Tyr Pro Gly Thr Leu
50 55 60
Ile Arg Thr Asp Ser Gln Ala Gln Leu Lys Thr Ala Val Asp Glu Leu
65 70 75 80
Gly Phe Arg Tyr Leu Arg Phe His Gly Ile Phe His Asp Val Leu Gln
85 90 95
Thr Val Arg Leu Val Asp Gly Lys Thr Val Tyr Asp Trp Arg Gly Ile
100 105 110
Asp Arg Leu Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Arg Arg Ile Arg Pro Phe Val
115 120 125
Glu Leu Ser Phe Thr Pro Asp Ala Leu Ala Thr Ser Pro Gln Thr Ile
130 135 140
Phe Tyr Trp Lys Gly Asn Thr Ser His Pro Lys Pro Asp Gly Trp Arg
145 150 155 160
Asn Leu Ile Asp Ala Phe Val Arg His Leu Glu Ala Arg Tyr Gly Pro
165 170 175
Ala Glu Val Arg Arg Trp Tyr Phe Glu Val Trp Asn Glu Pro Asn Leu
180 185 190
Ser Gly Phe Trp Glu Gly Ala Asp Gln Lys Ala Tyr Phe Glu Leu Tyr
195 200 205
Asp Ser Thr Ala Arg Thr Ile Lys Ala Ile Asp Pro Asp Leu Gln Val
210 215 220
Gly Gly Pro Ala Thr Ala Gly Ala Ala Trp Val Pro Glu Phe Leu Asp
225 230 235 240
Tyr Ala Ala Ala His His Thr Pro Val Asp Phe Val Thr Thr His Ser
245 250 255
Tyr Gly Val Asp Gly Gly Phe Leu Asp Glu Asn Gly Lys Ser Asp Thr
260 265 270
Lys Leu Ser Ala Asp Pro Asn Ala Ile Ile Gly Asp Val Lys Lys Val
275 280 285
Arg Ala Gln Ile Ser Ala Ser Pro Phe Pro Asn Leu Pro Leu Tyr Phe
290 295 300
Thr Glu Trp Ser Thr Ser Tyr Thr Pro Arg Asp Ala Val His Asp Ser
305 310 315 320
Tyr Ile Ser Ala Pro Tyr Ile Leu Ser Arg Ile Lys Ala Val Ala Gly
325 330 335
Glu Val Gln Gly Met Ser Tyr Trp Thr Tyr Ser Asp Leu Phe Glu Glu
340 345 350
Pro Gly Pro Pro Thr Ala Pro Phe Gln Gly Gly Phe Gly Leu Leu Asn
355 360 365
Pro Glu Gly Ile Arg Lys Pro Ala Phe Phe Ala Tyr Lys Tyr Leu Asn
370 375 380
Ala Leu Asp Gly Arg Val Ile Pro Thr Ala Asp Ala Gln Val Met Ala
385 390 395 400
Thr Thr Asp Gly Ser Ser Thr Glu Val Leu Leu Trp Asp Trp Gln Gln
405 410 415
Pro Lys Gln Pro Val Ser Asn Arg Pro Phe Tyr Thr Lys Leu Val Pro
420 425 430
Ser Thr Gln Ala Ser Pro Ala Arg Val Ala Phe Glu His Leu Trp Pro
435 440 445
Gly Arg Tyr Arg Val Arg Ala Tyr Arg Thr Gly Tyr Arg His Asn Asp
450 455 460
Ala Tyr Ser Ala Tyr Ile Asp Met Gly Leu Pro Lys Thr Leu Asp Ala
465 470 475 480
Ala Gln Leu Thr Arg Leu Gln Gln Leu Thr Arg Asp Leu Pro Val Val
485 490 495
Asp Arg Met Ala Thr Ile Asp Gly Thr Gly Gln Phe Asp Ile Glu Met
500 505 510
Pro Met Arg Ser Asn Asp Ile Val Leu Val Thr Leu Ser Pro Met Ser
515 520 525
Ser Ala Ser Ile Ala Pro Lys Glu Arg Lys
530 535
<210> 4
<211> 1557
<212> DNA
<213> 无信号肽编码序列(jB13GH39)
<400> 4
gcaactctct gcacggctcc ggcgagggcg attgcgcccg ctgaccgcga aattacggtc 60
gatctagcgc gggcgggcag accgctcgac cgcttctata atttctccgt cggctccgat 120
tatccgggca cgctgatccg caccgattcg caggcgcagc tcaaaaccgc agtcgacgaa 180
ctgggtttcc gttatctccg cttccacggg atcttccacg acgtgctgca gacggtgcgc 240
ctggttgatg gcaagacggt atatgactgg cgaggcatcg accggctcta tgacgatctg 300
ctggcgcgcc gcatccgtcc ctttgtcgag ctcagcttca cgcctgatgc gctcgcgacc 360
tcgccccaga cgatctttta ctggaagggc aatacctctc atccgaagcc cgatggctgg 420
cgcaacctga tcgacgcgtt cgttcgacat ctcgaggcgc gctacggccc cgccgaggtg 480
cgacgctggt atttcgaggt ttggaacgag cccaatctca gcggcttttg ggagggcgcg 540
gatcaaaagg cctatttcga actatacgat tccaccgcgc gaaccatcaa ggcgatcgac 600
ccggatctac aggtcggcgg tccggcgacg gcgggagcag cttgggtgcc cgagtttctc 660
gactatgccg cggcccatca tacgccggtc gatttcgtca ccacgcacag ctacggcgtc 720
gatggcggct ttctcgacga gaacggcaaa agtgacacca agctgtcggc cgatcccaac 780
gcgatcatcg gcgatgtgaa gaaggtaagg gcgcagatca gcgcctcgcc atttccgaac 840
ctgccactct atttcaccga atggagcacc agctacacgc cgcgcgatgc cgtgcacgat 900
tcctatatca gcgcacctta catcctgtcg cggatcaagg cggtggcagg cgaggtccaa 960
ggcatgagct attggaccta ttcggatctg ttcgaggagc cggggccgcc cacagcgcct 1020
ttccagggcg gcttcgggct gctcaatccc gaaggtatca gaaagccggc cttcttcgcc 1080
tacaaatatc tgaacgcgct cgacgggcgc gttatcccga ccgcagatgc acaggtgatg 1140
gcgaccaccg atggttcctc cacggaggtg ttgctgtggg actggcagca accgaaacag 1200
cccgtcagta accggccgtt ctacaccaag ctggtgccat ccacccaagc atcgccggcg 1260
agagtcgcgt tcgagcatct gtggcccggc cgttaccggg tgcgtgccta tcgcaccggc 1320
tatcgccata acgacgctta ttcggcctat atcgatatgg gcctgccgaa gacgctcgat 1380
gcggcgcaat tgaccaggtt gcagcaactt actcgcgacc tgccggtcgt cgatcgcatg 1440
gcgacgatcg acggcaccgg ccaattcgat atcgagatgc cgatgcgaag caatgatatc 1500
gtgctcgtca cgctgtcgcc catgtcatcg gcgtcaattg cacccaagga gcgaaag 1557
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcaactctct gcacggctcc gg 22
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctttcgctcc ttgggtgcaa ttgac 25
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acagcaccgg cgtcgatggc ggctttctcg ac 32
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcgacgccg gtgctgtgcg tggtgacgaa at 32

Claims (8)

1.一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体，其特征在于，所述的突变体为MutY257T，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体，其特征在于，突变体MutY257T在JB13GH39的第257位点发生了突变，即JB13GH39的第257位点是氨基酸“Y”，而在MutY257T序列中对应的氨基酸是第243位点“T”。
3.权利要求1所述的木糖苷酶突变体的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种重组载体，其特征在于，包含木糖苷酶突变体MutY257T编码基因。
5.一种重组菌，其特征在于，包含木糖苷酶突变体MutY257T编码基因。
6.权利要求1所述的木糖苷酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)扩增或基因合成野生酶JB13GH39无信号肽的编码序列，如SEQ ID NO.4所示；
2)将1)中序列与表达载体pEasy-E2进行连接，得到重组表达质粒pEasy-E2-jB13GH39；
3)以重组质粒pEasy-E2-jB13GH39为模板，利用突变引物进行突变和重组，得到含MutY257T编码基因的重组质粒pEasy-E2-MutY257T；
4)用质粒pEasy-E2-MutY257T转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得包含MutY257T编码基因的重组菌株；
5)培养重组菌株，诱导木糖苷酶突变体MutY257T表达；
6)回收并纯化所表达的木糖苷酶突变体MutY257T。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的突变引物为SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8。
8.权利要求1所述的木糖苷酶突变体在制备医药和保健品中的应用。
CN201910057350.4A 2019-01-22 2019-01-22 一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体 Active CN109593745B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910057350.4A CN109593745B (zh) 2019-01-22 2019-01-22 一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910057350.4A CN109593745B (zh) 2019-01-22 2019-01-22 一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109593745A true CN109593745A (zh) 2019-04-09
CN109593745B CN109593745B (zh) 2022-06-24

Family

ID=65964700

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910057350.4A Active CN109593745B (zh) 2019-01-22 2019-01-22 一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109593745B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111117988A (zh) * 2020-01-18 2020-05-08 南京林业大学 嗜热木糖苷酶的氨基酸突变体及其应用
CN111358799A (zh) * 2020-03-27 2020-07-03 东北师范大学 人参皂苷ck在作为降脂减肥药物中的应用
CN116355881A (zh) * 2023-03-10 2023-06-30 云南师范大学 酸耐受性提高的β-木糖苷酶突变体D395G及其应用
CN116410960A (zh) * 2023-03-10 2023-07-11 云南师范大学 嗜盐适冷及pH适应性改良的β-木糖苷酶突变体D41G及其应用
CN116497005A (zh) * 2023-03-10 2023-07-28 云南师范大学 热耐受性降低的β-木糖苷酶突变体K130GK137G及其应用
CN116555233A (zh) * 2023-03-10 2023-08-08 云南师范大学 热不稳定的β-木糖苷酶突变体E179GD182G及其应用
CN116555233B (zh) * 2023-03-10 2024-06-04 云南师范大学 热不稳定的β-木糖苷酶突变体E179GD182G及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1825860A1 (en) * 2004-11-09 2007-08-29 The Pharmaceutical Factory of Chengdu Hoist Inc., Ltd. A panaxatriol saponins composition and its preparing method and the use
CN105950586A (zh) * 2016-07-15 2016-09-21 云南师范大学 一种低温木糖苷酶hj14gh43及其耐盐突变体
CN105950592A (zh) * 2016-07-15 2016-09-21 云南师范大学 耐盐耐乙醇耐胰蛋白酶的木糖苷酶jb13gh39及其制备方法
CN107189994A (zh) * 2017-07-05 2017-09-22 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 β‑木糖苷酶及其应用
WO2017191026A1 (de) * 2016-05-04 2017-11-09 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- und reinigungsmittel enthaltend antimikrobiell wirksame enzyme
CN108588054A (zh) * 2018-05-11 2018-09-28 上海中医药大学 一种三七皂苷糖苷水解酶及其突变体在生产越南人参皂苷r7中的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1825860A1 (en) * 2004-11-09 2007-08-29 The Pharmaceutical Factory of Chengdu Hoist Inc., Ltd. A panaxatriol saponins composition and its preparing method and the use
WO2017191026A1 (de) * 2016-05-04 2017-11-09 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- und reinigungsmittel enthaltend antimikrobiell wirksame enzyme
CN105950586A (zh) * 2016-07-15 2016-09-21 云南师范大学 一种低温木糖苷酶hj14gh43及其耐盐突变体
CN105950592A (zh) * 2016-07-15 2016-09-21 云南师范大学 耐盐耐乙醇耐胰蛋白酶的木糖苷酶jb13gh39及其制备方法
CN107189994A (zh) * 2017-07-05 2017-09-22 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 β‑木糖苷酶及其应用
CN108588054A (zh) * 2018-05-11 2018-09-28 上海中医药大学 一种三七皂苷糖苷水解酶及其突变体在生产越南人参皂苷r7中的应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QI LI等: "Characterization of a novel thermostable and xylose-tolerant GH 39 β-xylosidase from Dictyoglomus thermophilum", 《BMC BIOTECHNOLOGY》 *
SHIN KC等: "Characterization of β-xylosidase from Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum and its application to the production of ginsenosides Rg1 and Rh 1 from notoginsenosides R 1 and R 2", 《BIOTECHNOLOGY LETTER》 *
无: "Accession number: AZC12019.1，glycoside hydrolase family 39 beta-xylosidase [Sphingomonas sp.]", 《GENEBANK》 *
无: "Accession number: MG838204.1，Sphingomonas sp. isolate JB13 glycoside hydrolase family 39 beta-xylosidase gene, complete cds", 《GENEBANK》 *
高娟: "糖苷酶转化人参皂苷的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 农业科技辑》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111117988A (zh) * 2020-01-18 2020-05-08 南京林业大学 嗜热木糖苷酶的氨基酸突变体及其应用
CN111117988B (zh) * 2020-01-18 2022-10-14 南京林业大学 嗜热木糖苷酶的氨基酸突变体及其应用
CN111358799A (zh) * 2020-03-27 2020-07-03 东北师范大学 人参皂苷ck在作为降脂减肥药物中的应用
CN116355881A (zh) * 2023-03-10 2023-06-30 云南师范大学 酸耐受性提高的β-木糖苷酶突变体D395G及其应用
CN116410960A (zh) * 2023-03-10 2023-07-11 云南师范大学 嗜盐适冷及pH适应性改良的β-木糖苷酶突变体D41G及其应用
CN116497005A (zh) * 2023-03-10 2023-07-28 云南师范大学 热耐受性降低的β-木糖苷酶突变体K130GK137G及其应用
CN116555233A (zh) * 2023-03-10 2023-08-08 云南师范大学 热不稳定的β-木糖苷酶突变体E179GD182G及其应用
CN116410960B (zh) * 2023-03-10 2024-02-23 云南师范大学 嗜盐适冷及pH适应性改良的β-木糖苷酶突变体D41G及其应用
CN116355881B (zh) * 2023-03-10 2024-02-23 云南师范大学 酸耐受性提高的β-木糖苷酶突变体D395G及其应用
CN116555233B (zh) * 2023-03-10 2024-06-04 云南师范大学 热不稳定的β-木糖苷酶突变体E179GD182G及其应用
CN116497005B (zh) * 2023-03-10 2024-06-04 云南师范大学 热耐受性降低的β-木糖苷酶突变体K130GK137G及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109593745B (zh) 2022-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109593745A (zh) 一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体
CN112980813B (zh) 低温改良的外切菊粉酶突变体MutS117G
CN112813051B (zh) 热适应性改良的低温外切菊粉酶突变体MutP124G及应用
Jung et al. Metabolism of ginsenoside Rb1 by human intestinal microflora and cloning of its metabolizing β-D-glucosidase from Bifidobacterium longum H-1
CN112725307B (zh) 一种耐热性降低的低温外切菊粉酶突变体MutG169Δ4及应用
Lee et al. Cloning and characterization of α‐L‐arabinofuranosidase and bifunctional α‐L‐arabinopyranosidase/β‐D‐galactopyranosidase from Bifidobacterium longum H‐1
CN109628432B (zh) 一种能将三七皂苷R1和R2分别转化为人参皂苷Rg1和Rh1的热适应性改良木糖苷酶
CN112980814B (zh) 低温适应性提高的外切菊粉酶突变体MutV268Δ13
CN109957555A (zh) 一种糖基转移酶突变体及其在催化天麻素生物合成中的应用
CN109182439B (zh) 人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法
CN104404064A (zh) 一种来源于Streptomyces kathirae SC-1的酪氨酸酶编码基因melC及其蛋白
CN106754989B (zh) 布渣叶黄烷酮-2-羟基化酶及其编码基因与应用
CN110885846A (zh) 合成黄芩素和野黄芩素的微生物、其制备方法及其应用
CN101603039B (zh) 具有粘孢子虫孢子壁降解能力的几丁质酶及其编码基因
Neculai et al. Partial purification and characterization of three ginsenoside-metabolizing β-glucosidases from Pythium irregulare
CN109402080B (zh) 蛋白质ugt142及其编码基因与应用
CN108823178B (zh) 大黄素糖基转移酶蛋白FtUGT73BE5及其编码基因与应用
CN114561369B (zh) 用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶及其编码基因和应用
Jiang et al. Molecular cloning and functional characterization of a novel decarboxylase from uncultured microorganisms
CN113186209B (zh) 一种茅苍术鲨烯合酶基因AlSQS2及其编码的产物和应用
CN106811450B (zh) 一种双功能转糖基α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶及其表达基因与应用
CN113736762A (zh) 一种α-L-鼠李糖苷酶突变体及其在制备普鲁宁中的应用
CN109251913B (zh) 一种甘露聚糖酶突变体DeP41P42及其应用
CN101914476A (zh) 一种深海弹性蛋白酶基因及其制备方法与应用
US20190048353A1 (en) Marine bacterial gene lfliz and use

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant