CN107189994A

CN107189994A - β‑木糖苷酶及其应用

Info

Publication number: CN107189994A
Application number: CN201710540963.4A
Authority: CN
Inventors: 吕明; 李福利; 韩文杰; 阿布萨利赫
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2017-07-05
Filing date: 2017-07-05
Publication date: 2017-09-22
Anticipated expiration: 2037-07-05
Also published as: CN107189994B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及来自热解纤维素菌Caldicellulosiruptor saccharolyticus中的两种β‑木糖苷酶及其在对含木糖基修饰的天然化合物进行生物转化中的应用。β‑1,4‑木糖苷酶为源自热解纤维素菌的同一个基因簇中β‑木糖苷酶CsXyl39A、β‑木糖苷酶CsXyl39B；本发明通过实验证明，CsXyl39A能够耐受有机溶剂，可在含较高浓度的有机溶剂水溶液中对含木糖基的天然化合物进行水解。同时，CsXyl39A适用于酶的固定化技术。CsXyl39B对作为水解产物的木糖和葡萄糖具有良好的耐受能力，同时具有较好的热稳定性。此外，上述两个β‑木糖苷酶均能对含木糖基修饰的天然药物进行高效生物催化。

Description

β-木糖苷酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及来自热解纤维素菌Caldicellulosiruptorsaccharolyticus中的两种β-木糖苷酶及其在对含木糖基修饰的天然化合物进行生物转化中的应用。

背景技术

在有机化合物的体外生物转化过程中，大部分生物转化反应需要在有机溶剂中进行(很多有机化合物相较于水，更易溶于有机溶剂)，因此，有机溶剂耐受能力是酶制剂能否工业化应用的重要参数和限定条件。β-木糖苷酶是能够从非还原端水解木寡糖等低聚木糖或者是催化水解含木糖苷有机化合物的酶，水解产物主要为木糖。目前，大多数β-木糖苷酶对有机溶剂的耐受能力不佳，在很大程度上限制了其在工业过程中的应用。

热稳定性是酶制剂在工业利用过程中的重要参数之一。当前报道的大多数木糖苷酶的最适反应温度多在45～60℃之间，并且热稳定性参差不齐，严重限制了其在造纸和食品等工业环境中对木寡糖的降解。因此，热稳定性对β-木糖苷酶的工业化应用尤为重要。

木糖是β-木糖苷酶水解反应的终产物。当β-木糖苷酶水解低聚木寡糖为木糖时，随着水解时间的增加，增加的终产物木糖会降低酶促反应速率，从而抑制反应的持续进行。现有的β-木糖苷酶对木糖的耐受能力均较差，因此，具有木糖耐受能力的β-木糖苷酶在降解半纤维素过程中作用巨大。

发明内容

本发明的目的在于是提供一种源自热解纤维素菌Caldicellulosiruptorsaccharolyticus的β-木糖苷酶及其在对含木糖基修饰的天然化合物进行生物转化中的应用。

为实现上述目的,本发明采用技术方案为:

一种β-1,4-木糖苷酶，β-1,4-木糖苷酶为源自热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor saccharolyticus)的同一个基因簇中β-木糖苷酶CsXyl39A、β-木糖苷酶CsXyl39B；其中，β-木糖苷酶CsXyl39A，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)与序列表中序列1所示的氨基酸序列具有至少95％同源性，且具有β-木糖苷酶活性的蛋白质；

β-木糖苷酶CsXyl39B，是如下(c)或(d)：

(c)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d)与序列表中序列2所示的氨基酸序列具有至少95％同源性，且具有β-木糖苷酶活性的蛋白质。

上述序列表中的序列1由482个氨基酸残基组成，所述的一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失/或添加为不超过25个氨基酸残基的取代和/或缺失/或添加。

上述序列表中的序列2由506个氨基酸残基组成，所述的一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失/或添加为不超过25个氨基酸残基的取代和/或缺失/或添加。

将上述序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失/或添加且具有β-木糖苷酶活性的、由序列1衍生的蛋白质突变体，可编码此蛋白质突变体的基因序列也在本发明保护的范围。

可编码上述序列2中氨基酸序列的、且具有β-木糖苷酶活性的基因序列也在本发明保护的范围。

将序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失/或添加且具有β-木糖苷酶活性的、由序列2衍生的蛋白质突变体，可编码此蛋白质突变体的基因序列也在本发明保护的范围。

一种构建β-1,4-木糖苷酶的引物，所述构建β-1,4-木糖苷酶CsXyl39A引物为

正向引物1(CsXyl39A)5’-ATGAAAATAACTATTAATTATGGAAAGAGACTTG-3’；

反向引物1(CsXyl39A)5’-CTAACCATTCTTAATTGTAACAGCCACAAC-3’；

所述构建β-1,4-木糖苷酶CsXyl39A引物为

正向引物2(CsXyl39B)5’-ATGACGAATATAAAGATTGAGAAAGGCAAG-3’

反向引物2(CsXyl39B)5’-CTAATAACCTGGTATTTTACTATCGTCAAG-3’。

一种β-1,4-木糖苷酶的应用，所述β-1,4-木糖苷酶在催化含木糖基修饰的天然药物中的应用；

所述β-1,4-木糖苷酶具有热稳定性；

或，所述β-1,4-木糖苷酶在溶剂内具有耐受性。

4.权利要求3所述β-1,4-木糖苷酶的应用，其特征在于：所述β-1,4-木糖苷酶CsXyl39A在有机溶剂水溶液存在下作为催化含木糖基修饰的天然药物的催化酶中的应用；

β-1,4-木糖苷酶CsXyl39A在有机溶剂水溶液存在下作为热稳定性酶中的应用；

或，所述β-木糖苷酶CsXyl39A作为固定化酶中的应用。

进一步的说，所述β-1,4-木糖苷酶CsXyl39A在终浓度为10-40％的有机溶剂水中催化水解含木糖基的天然化合物中的应用；

所述β-1,4-木糖苷酶CsXyl39B在高浓度(300毫摩尔/升)的木糖和葡萄糖溶液中具有耐受性。

所述β-1,4-木糖苷酶CsXyl39B与内切型木聚糖酶混合在木聚糖水解中作为水解酶的应用。

更进一步的说，

序列1所示的β-木糖苷酶CsXyl39A，具有下述应用方向：

(1)β-木糖苷酶CsXyl39A在含有甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙二醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃、二甲醚、DMSO、DMF、DMA、乙酸乙酯等各种有机溶剂的水溶液中，能够维持很高的木糖苷酶水解活性(例如，在20％上述有机溶剂：80％水的体系中，CsXyl39A对底物对硝基苯酚木糖苷、三七皂苷R1、R2、人参皂苷Ra1、Ra2、紫衫醇前体物7-xylosyl-10-deacetylpaclitaxel等的水解活性都可维持在90％以上)；

(2)体系内适当终浓度(10-40％)的上述各种有机溶剂水溶液可以提高CsXyl39A的酶催化效率；

(3)体系内适当终浓度(10-40％)的上述各种有机溶剂可以提高CsXyl39A的酶热稳定性；

(4)β-木糖苷酶CsXyl39A能适用于多种酶固定化技术(例如，大孔类吸附载体、交联类双功能团载体、包埋类凝胶聚合物载体等)。固定化处理后，CsXyl39A的热稳定性无明显变化；

(5)固定化后的β-木糖苷酶CsXyl39A对适当浓度的(10％-60％)有机溶剂水溶液耐受能力有显著提高(例如，利用大孔树脂载体对CsXyl39A固定化处理后，在40％丙酮与60％水的混合溶液中，固定化的CsXyl39A的水解活性可提高至原来的380％)。

序列2的β-木糖苷酶CsXyl39B，具有下述应用方向：

(1)含有序列2的β-木糖苷酶CsXyl39B具有耐受高浓度木糖和葡萄糖的特性；例如：在500毫摩尔/升浓度的木糖或葡萄糖存在的情况下，以“对硝基苯酚木糖苷”为底物，CsXyl39B可保持90％以上的水解活性；

(2)含有序列2的β-木糖苷酶CsXyl39B具有良好的热稳定性特性；例如：以“对硝基苯酚木糖苷”为底物，在80℃下的半衰期超过9小时，60℃的半衰期则超过80小时。

一种对含木糖基天然化合物水解的方法，将含木糖基天然化合物与所述β-1,4-木糖苷酶CsXyl39A和/或CsXyl39B在含终浓度为10％-40％有机溶剂的反应体系内反应即得到水解产物。

所述反应体系为：在pH为4.5-6的缓冲液下40℃-70℃之间反应。

所述含木糖基天然化合物为三七皂苷R1、R2、人参皂苷Ra1、Ra2、紫衫醇前体物7-xylosyl-10-deacetylpaclitaxel，其水解产物分别为人参皂苷Rg1、Rh1、Rb2、Rc、紫杉醇前体物10-deacetylpaclitaxel。

所述缓冲液为pH为4.5-6的任意缓冲液，例如磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液。

本发明所具有的优点：

本发明中，β-木糖苷酶CsXyl39A具有独特的有机溶剂耐受性，在多种有机溶剂存在条件下，可直接对底物进行水解，省略对底物进行有机溶剂去除的步骤，降低工艺成本。而β-木糖苷酶CsXyl39B对产物的反馈抑制有耐受能力，以及有较好的热稳定性，与内切性木聚糖酶有较好的协同能力，可用于木质纤维素的降解。

附图说明

图1为本发明实施例提供的β-木糖苷酶CsXyl39A在重组大肠杆菌中表达的蛋白质电泳图。

图2为本发明实施例提供的β-木糖苷酶CsXyl39B在重组大肠杆菌中表达的蛋白质电泳图。

图3为本发明实施例提供的两种重组木糖苷酶对不同底物的水解酶活图。

图4为本发明实施例提供的CsXyl39A在不同浓度下的各种有机溶剂水溶液中的水解活性图。

图5为本发明实施例提供的CsXyl39A在各种有机溶剂水溶液中的稳定性图。

图6为本发明实施例提供的CsXyl39A在固定化前后，在不同浓度的有机溶剂水溶液中的相对酶活变化图。

图7为本发明实施例提供的CsXyl39A水解三七皂苷R1产生人参皂苷Rg1的HPLC分析图。

图8为本发明实施例提供的CsXyl39B对木糖和葡萄糖耐受性影响图。

图9为本发明实施例提供的CsXyl39B与木聚糖酶协同效应分析图。

具体实施方式

下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下列实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、β-木糖苷酶CsXyl39A和CsXyl39B及其氨基酸序列的获得

提取热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor saccharolyticus)(ATCC 43494/DSM8903)的基因组DNA，并以此作为模板，以正向引物1和反向引物1(参见表1)进行PCR扩增，获得β-木糖苷酶CsXyl39A的基因序列，如序列3所示。以正向引物2和反向引物2(参见表1)进行PCR扩增，获得β-木糖苷酶CsXyl39B的基因序列，如序列4所示。

两者的PCR的扩增体系及条件相同，具体为：50微升PCR扩增体系中包括1微升基因组DNA(15纳克/微升)、25微升2×EASYPfu SuperMix、1微升的引物(10微摩尔)以及22微升的灭菌超纯水。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3.5分钟，30个循环；最后72℃延伸5分钟。

获得的两个基因序列通过DNA序列翻译，得到了CsXyl39A和CsXyl39B的氨基酸序列，如序列1和序列2所示。

将上述所得PCR产物分别与载体pEASY-Blunt E1(购自北京全式金生物技术有限公司)连接，连接产物分别直接转化入大肠杆菌Trans1-T1中进行质粒扩增。通过质粒的DNA测序，确认构建正确的质粒，再分别转化大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达。通过蛋白质纯化和SDS-PAGE的检验，分别得到β-木糖苷酶CsXyl39A(参见图1)和CsXyl39B(参见图2)。

表1根据热解纤维素菌属saccharolyticus基因组中CsXyl39A和CsXyl39B的序列合成下列引物：

实施例2、β-木糖苷酶水解活性的测定：

以对硝基苯酚木糖苷p-Nitrophenyl-β-D-xylopyranoside(pNP-X)为底物测定酶活力。在100微升柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)中，依次加入80微升的pNP-X(10毫摩尔/升)，20微升不同浓度的上述实施例1获得的β-木糖苷酶CsXyl39A或CsXyl39B，在水浴锅(75℃)中孵育5分钟后，再加入100微升2摩尔/升的碳酸钠溶液终止反应。反应液随后放入分光光度计中，在405纳米处测定吸收值(参见图3)。以每分钟水解底物，中释放出1毫摩尔的对硝基苯酚，定义为1个酶活单位。

测定结果：酶的水解活性结果如图3显示，β-木糖苷酶CsXyl39A和CsXyl39B对pNP-X的比酶活分别为180个酶活单位/毫克和40酶活单位/毫克。

实施例3、有机溶剂对β-木糖苷酶CsXyl39A的水解活性的影响：

以对硝基苯酚木糖苷pNP-X为底物测定β-木糖苷酶的水解活性。水解反应体系中分别加入使体系内终浓度为不同含量的有机溶剂(机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、丙酮或乙腈)，反应体系是在100微升柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)中，加入80微升10毫摩尔/升的pNP-X，后加入20微升经上述有机溶剂混合的CsXyl39A酶，在水浴锅(75℃)中进行孵育(5分钟)，随后加入100微升的碳酸钠溶液(2摩尔/升)终止反应。反应液随后放入分光光度计中，在405纳米处测定吸收值(参见图4)。以每分钟从底物中水解释放1毫摩尔的对硝基苯酚，定义为1个酶活力单位。含有机溶剂的β-木糖苷酶的酶活/不含有机溶剂的CsXyl39A酶活×100％＝相对酶活％。

测试结果：β-木糖苷酶CsXyl39A在不同有机溶剂中的相对剩余酶活，如图4所示，在20％的有机溶剂(除正丁醇之外)水溶液中，CsXyl39A的相对酶活均高于95％以上。其中，在20％的丙酮水溶液中，CsXyl39A的酶活是阴性对照的大约2倍；而在40％的丙酮水溶液中，依然能保持高于阴性对照的活性。本实验的结论是：在一定的浓度条件下，大多数有机溶剂能够提高CsXyl39A的酶活。

实施例4、有机溶剂提高β-木糖苷酶CsXyl39A稳定性(相对残余酶活)的测试：

在反应体系中，分别加入至体系内终浓度达到20％的不同的有机溶剂(甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、丙酮、乙腈)在60℃下进行孵育，在不同的时间节点，取出等量的反应液，以对硝基苯酚木糖苷pNP-X为底物测定残余的酶活力。

另，在100微升柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)中，加入80微升10毫摩尔每升的pNP-X，随后加入20微升在不同时间节点获得的CsXyl39A溶液，在水浴锅(75℃)中孵育5分钟后，加入100微升碳酸钠溶液(2摩尔/升)终止反应。其中，不同时间节点获得的CsXyl39A溶液为将CsXyl39A与至体系内终浓度为20％不同的有机溶剂(甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、丙酮、乙腈)在60℃下进行孵育，在不同的时间点上(如图4所示)取出等量的反应液，待用。

反应液随后放入分光光度计中，在405纳米处测定吸收值(参见图5)。以每分钟从底物中水解释放1毫摩尔的对硝基苯酚，定义为1个酶活力单位。残余的酶活/反应体系中的初始酶活×100％＝相对残余酶活％。

测定结果：β-木糖苷酶CsXyl39A在有机溶剂水溶液中的相对残余酶活如图5所示，20％的上述有机溶剂水溶液(除正丁醇外)能够增加CsXyl39A在50℃下的酶活半衰期约5-20个小时。因此，大多数有机溶剂可以增加β-木糖苷酶CsXyl39A的稳定性。

实施例5、β-木糖苷酶CsXyl39A的固定化

酶的固定可采用多种方式，如大孔类吸附载体、交联类双功能团试剂、包埋类凝胶聚合物等，现对CsXyl39A进行固定化，并以大孔树脂对β-木糖苷酶CsXyl39A进行固定化为例分析：准确称量0.5克大孔树脂，用pH为5.5的柠檬酸缓冲液洗三次后置于3.5毫升pH为5.5的柠檬酸缓冲液中，加入150微升CsXyl39A(3毫克/毫升)后，于20℃振荡过夜，进行β-木糖苷酶的固定化。在固定化前后，分别取出上清液进行酶活测定，测定方法同实施例2。

测试结果：通过固定化前后，上清液的酶活比较计算固定化效率，利用公式(固定化前上清液酶活-固定化后上清液酶活)/固定化前上清液酶活×100％＝固定化效率。最终获得固定化效率大于99％。

实施例6、固定化对CsXyl39A有机溶剂耐受能力的影响：

100微升50毫摩尔的柠檬酸缓冲液(pH 5.5)，80微升的pNP-X(10毫摩尔/升)，每次加入等量的上述实施例5经酶固定化后的树脂，于80℃水浴反应5分钟，加入100微升2摩尔/升的碳酸钠溶液终止反应。过滤后取上清液放入分光光度计中，在405纳米处测吸收值。在反应体系中分别加入不同含量的有机溶剂使其终浓度达到40％或60％(甲醇或丙酮)测定固定化后有机溶剂对CsXyl39A相对酶活影响，绘制固定化前后相对酶活变化柱状图。

测试结果：结果如图6所示，固定化进一步提升了CsXyl39A对有机溶剂的耐受性。例如，在40％的丙酮存在下，固定化CsXyl39A的水解活性是未固定化CsXyl39A的380％。对于其他两种固定化方法(交联类双功能团试剂、包埋类凝胶聚合物)，结果同上述相近，不同方法对CsXyl39A进行固定化后都能明显提升其对不同有机溶剂的耐受性。

实施例7、利用上述获得β-木糖苷酶CsXyl39A在水解三七皂苷R1、R2、人参皂苷Ra1、Ra2、紫衫醇前体物7-xylosyl-10-deacetylpaclitaxel等等天然含木糖基化合物制得人参皂苷Rg1、Rh1、Rb2、Rc、紫衫醇前体物10-deacetylpaclitaxel等脱木糖基产物的应用。

反应体系包括，140微升的50毫摩尔/升的柠檬酸缓冲液，40微升的三七皂苷R1(10毫摩尔/升)(或是由三七皂苷R2、人参皂苷Ra1或人参皂苷Ra2进行替换)，20微升的10纳摩尔/升CsXyl39A酶和终浓度达到40％的甲醇(甲醇或丙酮等)，在80℃反应20分钟后，加甲醇稀释后进行产物HPLC分析。

测试结果：结果如图7显示，CsXyl39A均能够与三七皂苷R1反应生成人参皂苷Rg1，通过HPLC检测酶活发现CsXyl39A对三七皂苷R1比酶活为967单位/毫克。对于上述其它三种含木糖基皂苷类化合物，结果同上述实施例7相近，产物均能去掉皂苷上的木糖基，转化率在90％以上。

实施例8、β-木糖苷酶CsXyl39B对木糖和葡萄糖耐受能力的测试：

在CsXyl39B的酶反应体系中，分别加入不同含量的木糖或葡萄糖，以对硝基苯酚木糖苷pNP-X为底物测定酶活力，具体为：在总体积100微升的含不同浓度木糖或葡萄糖的柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)中，加入80微升的pNP-X(10毫摩尔/升)，后加入20微升CsXyl39B，在水浴锅(75℃)中孵育5分钟后，加入100微升2摩尔/升的碳酸钠溶液终止反应。反应液随后放入分光光度计中，在405纳米处测定吸收值。以每分钟从底物中水解释放1毫摩尔的对硝基苯酚，定义为1个酶活力单位。含有木糖或葡萄糖的残余酶活/不含木糖或葡萄糖的初始酶活×100％＝相对残余酶活％。

测定结果：β-木糖苷酶CsXyl39B在含有木糖或葡萄糖的水溶液中的相对残余酶活如图8所示，在500毫摩尔浓度的木糖和葡萄糖水溶液中，CsXyl39B的相对残余酶活依然能够保持在90％以上。因此，β-木糖苷酶CsXyl39B对中终产物木糖和葡萄糖有很好的耐受能力。

实施例9、β-木糖苷酶CsXyl39B与木聚糖酶协同效应分析：

以1％的源自榉木的木聚糖(溶于50毫摩尔/升的柠檬酸缓冲液，pH为5.5)为底物，用β-木糖苷酶CsXyl39B、β-木糖苷酶CsXyl39B与来自Caldicellulosiruptor sp.F32的木聚糖酶XynA(糖苷水解酶11家族)或β-木糖苷酶CsXyl39B与来自Caldicellulosiruptorsp.F32的木聚糖酶XynB(糖苷水解酶10家族)在70℃进行反应12小时，随后产物煮沸15分钟使酶失活，进行离子色谱分析得到结果。测定结果：结果如图9显示，CsXyl39B能够与两种木聚糖酶发生协同效应，促进木聚糖底物的水解。

序列1.

MKITINYGKRLGKINKFWAKCVGSCHATTALREDWRKQLKKCRDELGFEYIRFHGWLNDDMSVCFRNDDGLLSFSFFNIDSIIDFLLEIGMKPFIELSFMPEALASGTKTVFHYKGNITPPKSYEEWGQLIEELARHLISRYGKNEVREWFFEVWNEPNLKDFFWAGTMEEYFKLYKYAAFAIKKVDSELRVGGPATAIDAWIPELKDFCTKNGVPIDFISTHQYPTDLAFSTSSNMEEAMAKAKRGELAERVKKALEEAYPLPVYYTEWNNSPSPRDPYHDIPYDAAFIVKTIIDIIDLPLGCYSYWTFTDIFEECGQSSLPFHGGFGLLNIHGIPKPSYRAFQILDKLNGERIEIEFEDKSPTIDCIAVQNEREIILVISNHNVPLSPIDTENIKVVLKGIENCREVFVERIDEYNANPKRVWLEMGSPAYLNREQIEELIKASELKKEKVSWGIVNNNEITFDLSVLPHSVVAVTIKNG

序列2.

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序列3.

atgaaaataactattaattatggaaagagacttgggaaaataaacaaattttgggcaaaatgtgttggaagctgtcatgctacaactgcgttaagagaagactggcgaaagcaattaaaaaaatgtcgtgacgaacttggttttgagtatattcgatttcatggttggttgaatgatgatatgagtgtttgttttagaaatgatgatgggctactttcattctcattcttcaacatagattctataattgattttcttttggagataggtatgaaaccatttattgaactgagctttatgccagaagcgttagcgtcaggtacaaagacagttttccattacaaaggaaatataacaccgccgaaatcttatgaagaatggggtcagctgattgaggagttagcaaggcatcttattagcagatatgggaaaaatgaagtaagagaatggttttttgaggtatggaacgaaccaaatctaaaggatttcttctgggcaggaacaatggaagaatattttaagctttacaaatatgctgcttttgcaataaagaaagtggactctgaactaagggtaggtggaccagctactgcaatcgatgcatggatacctgaactaaaagatttttgtacaaaaaatggtgttccaatagattttatttcaacgcatcaatatccaacagatttagcattcagtacaagctcaaatatggaagaggctatggcaaaagcaaagagaggtgaattagcagagagggtaaaaaaggctttagaggaagcatatccattgcctgtttactacactgaatggaataactctccaagtcctcgagacccatatcacgacataccttacgatgctgcttttattgtaaaaacaataattgacattatagatttaccacttgggtgttattcttattggacatttacagatatctttgaagaatgtggacagagttctttaccttttcatgggggattcgggcttctaaatattcatggtataccaaaaccatcctatagagcatttcaaattttagataaactaaacggtgagaggattgagatagagtttgaagataaaagcccaaccattgattgtatagctgtccagaatgagagagagataatacttgtgatctcaaaccataatgttccgctgtctcctattgataccgaaaatataaaagttgttttaaaaggtattgagaattgccgagaagtttttgttgagagaatagatgaatataatgccaatccaaaaagagtatggcttgaaatgggcagtcctgcgtatctcaatagagaacagattgaggagttgataaaagcatcagaactaaagaaagagaaagtttcatgggggattgtgaataataatgaaattacatttgatttaagtgttttacctcactcagttgtggctgttacaattaagaatggttag

序列4

atggtgacgaatataaagattgagaaaggcaagcaaataggcatatttccagataaatggaagttttgtgtcggtagtggtcgaataggacttgcattgcaaaaggagtatatagatgctcttttatatgtaaaaaaacacatagattttaaatatataagagctcatgggctgctgcatgatgatgtaggtatttaccgtgaagatataattgatggcaatgaagtttcattttacaattttacgtatattgacagaatatatgactcatttttagaacttggcatacgaccgtttgttgaaattgggttcatgccctcaaaacttgcatctggtactcagacagtattttactggaggggtaatgtcactcctcctaaggactatggtaagtgggaaaggctaatcaaaagtgttgtaaagcattttatagacagatatggcgaaaaagaggttgttcagtggccatttgaaatctggaacgaacctaatttgaatgtattctggaaagatgcaaaccaggcagaatacttcaaattatatgaagttacagcaaaagccataaaagaagtaaatgagaatataaaagtgggtggaccggcaatctgtggcggttccgattattggattgatgattttttgcacttttgctacaagaataaagtgccggtagattttttaacacgacatgcgtacacaggtaagcctcctcaatacacaccacattttgtatatcaggatgtgcatccgattgaatatatgctaaacgagtttaaaagtgtcagagaaaaggtaaggaattcgccgtttcccgaccttccaatacacataaccgaattcaacagttcgtaccatccgctgtgtccgatacatgatacaccatttaatgctgcgtatttggcaagagtgctgagtgaagcgggtgattacgtggattctttttcgtattggacatttagcgatgtgttcgaggaagcagatgttccaagggcaatctttcatggcggttttggccttgttgcatttaataatattccaaaaccagtttttcatatgtttaccttctttaatgctatgggaaacaagatactctatagagatgaacatatattaataacggagagagaaaatggtacaattgccatagttgcatggaatgaagttatgaaaaaagaggaagcaactgatagaaaatataagatagaaatacctgtagattataatgatgtatttataaagcaaaaactaattgacgaagaaaacgggaatccatggcgtacttggatccaaatgggtagacccaggtatcccaccaaagaacaaatagaaacattaagagaggtagcaaagcctaaaataagtacatttagaatgatggcagaaaatggttatattacccttgaatttacgttaagtaaaaatgctgtggtgctttttgaggtaagcaaggttgtagatgagtcagatacttatataggacttgacgatagtaaaataccaggttattag

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> β-木糖苷酶及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 482

<212> PRT

<213> 热解纤维素菌

<220>

<221> PROPEP

<222> (1)..(482)

<223>

<400> 1

Met Lys Ile Thr Ile Asn Tyr Gly Lys Arg Leu Gly Lys Ile Asn Lys

1 5 10 15

Phe Trp Ala Lys Cys Val Gly Ser Cys His Ala Thr Thr Ala Leu Arg

20 25 30

Glu Asp Trp Arg Lys Gln Leu Lys Lys Cys Arg Asp Glu Leu Gly Phe

35 40 45

Glu Tyr Ile Arg Phe His Gly Trp Leu Asn Asp Asp Met Ser Val Cys

50 55 60

Phe Arg Asn Asp Asp Gly Leu Leu Ser Phe Ser Phe Phe Asn Ile Asp

65 70 75 80

Ser Ile Ile Asp Phe Leu Leu Glu Ile Gly Met Lys Pro Phe Ile Glu

85 90 95

Leu Ser Phe Met Pro Glu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Lys Thr Val Phe

100 105 110

His Tyr Lys Gly Asn Ile Thr Pro Pro Lys Ser Tyr Glu Glu Trp Gly

115 120 125

Gln Leu Ile Glu Glu Leu Ala Arg His Leu Ile Ser Arg Tyr Gly Lys

130 135 140

Asn Glu Val Arg Glu Trp Phe Phe Glu Val Trp Asn Glu Pro Asn Leu

145 150 155 160

Lys Asp Phe Phe Trp Ala Gly Thr Met Glu Glu Tyr Phe Lys Leu Tyr

165 170 175

Lys Tyr Ala Ala Phe Ala Ile Lys Lys Val Asp Ser Glu Leu Arg Val

180 185 190

Gly Gly Pro Ala Thr Ala Ile Asp Ala Trp Ile Pro Glu Leu Lys Asp

195 200 205

Phe Cys Thr Lys Asn Gly Val Pro Ile Asp Phe Ile Ser Thr His Gln

210 215 220

Tyr Pro Thr Asp Leu Ala Phe Ser Thr Ser Ser Asn Met Glu Glu Ala

225 230 235 240

Met Ala Lys Ala Lys Arg Gly Glu Leu Ala Glu Arg Val Lys Lys Ala

245 250 255

Leu Glu Glu Ala Tyr Pro Leu Pro Val Tyr Tyr Thr Glu Trp Asn Asn

260 265 270

Ser Pro Ser Pro Arg Asp Pro Tyr His Asp Ile Pro Tyr Asp Ala Ala

275 280 285

Phe Ile Val Lys Thr Ile Ile Asp Ile Ile Asp Leu Pro Leu Gly Cys

290 295 300

Tyr Ser Tyr Trp Thr Phe Thr Asp Ile Phe Glu Glu Cys Gly Gln Ser

305 310 315 320

Ser Leu Pro Phe His Gly Gly Phe Gly Leu Leu Asn Ile His Gly Ile

325 330 335

Pro Lys Pro Ser Tyr Arg Ala Phe Gln Ile Leu Asp Lys Leu Asn Gly

340 345 350

Glu Arg Ile Glu Ile Glu Phe Glu Asp Lys Ser Pro Thr Ile Asp Cys

355 360 365

Ile Ala Val Gln Asn Glu Arg Glu Ile Ile Leu Val Ile Ser Asn His

370 375 380

Asn Val Pro Leu Ser Pro Ile Asp Thr Glu Asn Ile Lys Val Val Leu

385 390 395 400

Lys Gly Ile Glu Asn Cys Arg Glu Val Phe Val Glu Arg Ile Asp Glu

405 410 415

Tyr Asn Ala Asn Pro Lys Arg Val Trp Leu Glu Met Gly Ser Pro Ala

420 425 430

Tyr Leu Asn Arg Glu Gln Ile Glu Glu Leu Ile Lys Ala Ser Glu Leu

435 440 445

Lys Lys Glu Lys Val Ser Trp Gly Ile Val Asn Asn Asn Glu Ile Thr

450 455 460

Phe Asp Leu Ser Val Leu Pro His Ser Val Val Ala Val Thr Ile Lys

465 470 475 480

Asn Gly

<210> 2

<211> 502

<212> PRT

<213> 热解纤维素菌

<220>

<221> PROPEP

<222> (1)..(502)

<223>

<400> 2

Met Val Thr Asn Ile Lys Ile Glu Lys Gly Lys Gln Ile Gly Ile Phe

1 5 10 15

Pro Asp Lys Trp Lys Phe Cys Val Gly Ser Gly Arg Ile Gly Leu Ala

20 25 30

Leu Gln Lys Glu Tyr Ile Asp Ala Leu Leu Tyr Val Lys Lys His Ile

35 40 45

Asp Phe Lys Tyr Ile Arg Ala His Gly Leu Leu His Asp Asp Val Gly

50 55 60

Ile Tyr Arg Glu Asp Ile Ile Asp Gly Asn Glu Val Ser Phe Tyr Asn

65 70 75 80

Phe Thr Tyr Ile Asp Arg Ile Tyr Asp Ser Phe Leu Glu Leu Gly Ile

85 90 95

Arg Pro Phe Val Glu Ile Gly Phe Met Pro Ser Lys Leu Ala Ser Gly

100 105 110

Thr Gln Thr Val Phe Tyr Trp Arg Gly Asn Val Thr Pro Pro Lys Asp

115 120 125

Tyr Gly Lys Trp Glu Arg Leu Ile Lys Ser Val Val Lys His Phe Ile

130 135 140

Asp Arg Tyr Gly Glu Lys Glu Val Val Gln Trp Pro Phe Glu Ile Trp

145 150 155 160

Asn Glu Pro Asn Leu Asn Val Phe Trp Lys Asp Ala Asn Gln Ala Glu

165 170 175

Tyr Phe Lys Leu Tyr Glu Val Thr Ala Lys Ala Ile Lys Glu Val Asn

180 185 190

Glu Asn Ile Lys Val Gly Gly Pro Ala Ile Cys Gly Gly Ser Asp Tyr

195 200 205

Trp Ile Asp Asp Phe Leu His Phe Cys Tyr Lys Asn Lys Val Pro Val

210 215 220

Asp Phe Leu Thr Arg His Ala Tyr Thr Gly Lys Pro Pro Gln Tyr Thr

225 230 235 240

Pro His Phe Val Tyr Gln Asp Val His Pro Ile Glu Tyr Met Leu Asn

245 250 255

Glu Phe Lys Ser Val Arg Glu Lys Val Arg Asn Ser Pro Phe Pro Asp

260 265 270

Leu Pro Ile His Ile Thr Glu Phe Asn Ser Ser Tyr His Pro Leu Cys

275 280 285

Pro Ile His Asp Thr Pro Phe Asn Ala Ala Tyr Leu Ala Arg Val Leu

290 295 300

Ser Glu Ala Gly Asp Tyr Val Asp Ser Phe Ser Tyr Trp Thr Phe Ser

305 310 315 320

Asp Val Phe Glu Glu Ala Asp Val Pro Arg Ala Ile Phe His Gly Gly

325 330 335

Phe Gly Leu Val Ala Phe Asn Asn Ile Pro Lys Pro Val Phe His Met

340 345 350

Phe Thr Phe Phe Asn Ala Met Gly Asn Lys Ile Leu Tyr Arg Asp Glu

355 360 365

His Ile Leu Ile Thr Glu Arg Glu Asn Gly Thr Ile Ala Ile Val Ala

370 375 380

Trp Asn Glu Val Met Lys Lys Glu Glu Ala Thr Asp Arg Lys Tyr Lys

385 390 395 400

Ile Glu Ile Pro Val Asp Tyr Asn Asp Val Phe Ile Lys Gln Lys Leu

405 410 415

Ile Asp Glu Glu Asn Gly Asn Pro Trp Arg Thr Trp Ile Gln Met Gly

420 425 430

Arg Pro Arg Tyr Pro Thr Lys Glu Gln Ile Glu Thr Leu Arg Glu Val

435 440 445

Ala Lys Pro Lys Ile Ser Thr Phe Arg Met Met Ala Glu Asn Gly Tyr

450 455 460

Ile Thr Leu Glu Phe Thr Leu Ser Lys Asn Ala Val Val Leu Phe Glu

465 470 475 480

Val Ser Lys Val Val Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Ile Gly Leu Asp Asp

485 490 495

Ser Lys Ile Pro Gly Tyr

500

Claims

1.一种β-1,4-木糖苷酶，其特征在于：β-1,4-木糖苷酶为源自热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor saccharolyticus)的同一个基因簇中β-木糖苷酶CsXyl39A、β-木糖苷酶CsXyl39B；其中，β-木糖苷酶CsXyl39A，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

β-木糖苷酶CsXyl39B，是如下(c)或(d)：

(c)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.一种权利要求1所述构建β-1,4-木糖苷酶的引物，其特征在于：所述构建β-1,4-木糖苷酶CsXyl39A引物为

正向引物1(CsXyl39A)5’-ATGAAAATAACTATTAATTATGGAAAGAGACTTG-3’；

反向引物1(CsXyl39A)5’-CTAACCATTCTTAATTGTAACAGCCACAAC-3’；

所述构建β-1,4-木糖苷酶CsXyl39A引物为

正向引物2(CsXyl39B)5’-ATGACGAATATAAAGATTGAGAAAGGCAAG-3’

反向引物2(CsXyl39B)5’-CTAATAACCTGGTATTTTACTATCGTCAAG-3’。

3.一种权利要求1所述β-1,4-木糖苷酶的应用，其特征在于：所述β-1,4-木糖苷酶在催化含木糖基修饰的天然药物中的应用；

所述β-1,4-木糖苷酶具有热稳定性；

或，所述β-1,4-木糖苷酶在溶剂内具有耐受性。

或，所述β-木糖苷酶CsXyl39A作为固定化酶中的应用。

5.按权利要求4所述β-1,4-木糖苷酶的应用，其特征在于：所述β-1,4-木糖苷酶CsXyl39A在终浓度为10-40％的有机溶剂水中催化水解含木糖基的天然化合物中的应用。

6.按权利要求1所述β-1,4-木糖苷酶的应用，其特征在于：所述β-1,4-木糖苷酶CsXyl39B在高浓度的木糖和葡萄糖溶液中具有耐受性。

7.按权利要求6所述β-1,4-木糖苷酶的应用，其特征在于：所述β-1,4-木糖苷酶CsXyl39B与内切型木聚糖酶混合在木聚糖水解中作为水解酶的应用。

8.一种对含木糖基天然化合物水解的方法，其特征在于：将含木糖基天然化合物与权利要求1所述β-1,4-木糖苷酶CsXyl39A和/或CsXyl39B在含终浓度为10％-40％有机溶剂的反应体系内反应即得到水解产物。

9.按权利要求8所述的对含木糖基天然化合物水解的方法，其特征在于：所述反应体系为：在pH为4.5～6的缓冲液下40℃～70℃之间反应。