CN108588054A - 一种三七皂苷糖苷水解酶及其突变体在生产越南人参皂苷r7中的应用 - Google Patents

一种三七皂苷糖苷水解酶及其突变体在生产越南人参皂苷r7中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三七皂苷糖苷水解酶及其突变体在生产越南人参皂苷R7中的应用。本发明提供的蛋白，命名为KfGH01。该酶的原始氨基酸序列如SEQNO：1所示。本发明还涉及表达编码基因的宿主细胞及其诱导培养条件。本发明的实验证明，其具有高效转化三七皂苷Fc并专一生成越南人参皂苷R7的作用，因此具有较好的工业应用前景。

Description

一种三七皂苷糖苷水解酶及其突变体在生产越南人参皂苷R7 中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种三七皂苷糖苷水解酶及其突变体在生产越南人参皂苷R7中的应用。
背景技术
五加科人参属植物(如人参Panax ginseng、三七Panax notoginseng、西洋参Panax quinquefolius、越南人参Panax vietnamensis等、竹节参Panax japonicus)具有极高的医药价值和悠久的临床应用历史。人参属植物含有多种不同结构类型的化学成分，如皂苷、黄酮、挥发油、氨基酸、多糖等。研究表明，其所含三萜皂苷类化学成分，是预防和治疗心脑血管、免疫和神经等系统疾病的主要药效物质基础(Chem.Rev.2012，112：3329-3355；J.Pharm. Pharmacol.2006，58：1007-1019)。人参属植物所含皂苷大部分具有相似的母核结构，主要可分为达玛烷型和齐墩果烷型；根据母核C-6位是否具有羟基取代，达玛烷型又可分为原人参二醇(PPD)型和原人参三醇(PPT)型。这些皂苷差别主要存在于其苷元所连糖基的位置、个数或种类不同。最早发现于越南人参根茎当中的越南人参皂苷R7属于PPD型皂苷，其结构式如附图1所示。
鉴于该化合物的分离制备较为困难，一定程度上导致了与其相关的药理活性研究相对空白，目前仅限于本课题组所报道的其具有显著抑制神经炎症中下游代谢产物(如LPS及 TNF-α联合诱导因子)的生产和影响多种炎症基因的表达等作用，在研发与神经炎症相关的中枢神经系统疾病药物方面具有一定的潜力(中国中药杂志，2016，41：1498-1503)。
酶作为一类与化学合成互补的、高效的生物催化剂已被广泛应用于新药研发、食品、化工等领域。采用绿色酶制剂等生物催化方法，通过糖苷水解酶从含有多糖基侧链皂苷的主体结构中选择性水解掉糖残基，定向制备专一人参或三七皂苷及其类似物的研究报道逐年增多。此外，随着基因工程和蛋白质工程技术的飞速发展，越来越多的相关技术不断应用于生物催化剂-蛋白酶的结构和功能的改造研究当中，其已成为设计和开发新型生物催化剂的重要方法和有效手段。有关糖苷水解酶的定向进化报道较多，主要集中在酶的活力、热稳定性及性质改变等方面。通过定向进化方法提高具有转化人参或三七皂苷功能的糖苷水解酶活性，将十分有助于实现特定皂苷化合物的制备。目前，酶法转化对象大多是集中于连有四个或以下糖基单元的人参皂苷，暂未发现含有四个以上糖单位的人参皂苷或三七皂苷的生物转化报道，且产物也以单糖或二糖苷为主，如Rg3、Rh2、PPD、PPT、Rh1和C-K等(Process Biochem. 2014，49：813-820；Appl.Microbiol.Biotechnol.2012，94：377-84)。五糖基达玛烷型三七皂苷Fc在三七茎叶中含量相对较高(1.0-1.5％)，其C-20位为-Glc1-6Xyl连接，仅比越南人参皂苷R7多一个外侧连接的木糖，因此是酶法制备越南人参皂苷R7理想的候选底物。到目前为止，未见有任何三七皂苷Fc糖苷水解酶及其在制备越南人参皂苷R7的报道。
发明内容
针对现有不足，本发明的目的是公开一种三七皂苷糖苷水解酶及其突变体在生产越南人参皂苷R7中的应用。
本发明的蛋白并名为KfGH01，其为如下的蛋白：
(1)氨基酸序列如SEQ NO：2所示；
(2)氨基酸序列为SEQ NO：2序列中的氨基酸经过以下位点突变所得的突变体，即I248F、 I174E、E178T、Q313S、Y410R、I248F/I174E、I248F/E178T、I248F/Q313S、I248F/Y410R、 I248F/I174E/E178T、I248F/I174E/Q313S、I248F/I174E/Y410R、I248F/Y410R/Q313S、 I248F/E178T/Q313S、I248F/E178T/Y410R、I248F/I174E/E178T/Q313S、 I248F/I174E/E178T/Y410R、I248F/I174E/Q313S/Y410R、I248F/E178T/Q313S/Y410R、 I248F/I174E/E178T/Q313S/Y410R；
(3)氨基酸序列为(1)或(2)序列中的氨基酸，经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的突变体，但具有皂苷水解酶活性或对其他化合物具有糖苷水解酶活性的衍生蛋白质；
(4)在(1)或(2)氨基酸序列的N和(或)C末端具有或不具有标签序列，或在(1)或 (2)的N末端含有或不含有信号肽序列的蛋白。
编码上述蛋白质的基因同样在本发明保护的范围之内。
上述基因是如下(1)或(2)或(3)的DNA分子。
(1)序列表中序列1所示的DNA分子。
(2)与(1)限定的DNA序列至少具有70％-100％同源性且编码具有人参皂苷酶活性或对其他化合物具有糖苷水解酶活性蛋白质的DNA分子。
含有上述基因的野生菌株、重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
上述重组载体为将上述蛋白的编码基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体，在一个优选例中，具体为将序列1所示的DNA分子插入到大肠杆菌载体pET-28a(+)的 EcoRI和HindIII识别位点间，而得到的重组载体。
上述野生菌或上述蛋白、基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在作为人参皂苷酶或糖苷水解酶中的应用也是本发明保护的范围。
上述蛋白在转化皂苷和生产皂苷中的应用也是本发明保护的范围。
上述蛋白在生产越南人参皂苷R7中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种生产越南人参皂苷R7的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
(1)发酵本发明所述重组菌，培养、收集发酵液、离心收集菌体、破碎菌体后离心收集上清液或冷冻干燥上清液，分离纯化蛋白；
(2)将所述上清液或上清液冻干粉或纯化蛋白与三七皂苷Fc在缓冲液中反应，经萃取或分离纯化得到越南人参皂苷R7。
上述方法中(1)所述发酵在IPTG诱导下进行或不诱导直接发酵。
上述方法中(2)所述反应条件在温度为10-65℃和pH 3.0-11.0缓冲液中进行。
本发明的实验证明，本发明的一种三七皂苷水解酶及其突变体具有高效专一转化三七皂苷Fc生成越南人参皂苷R7的作用。
附图说明
图1越南人参皂苷R7结构式
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：越南人参皂苷R7水解酶及其编码基因的获得和表达
提取若干种菌的基因组，设计并合成相应引物，以基因组DNA为模板，对目的基因进行分子克隆、构建基因工程菌和表达，附图表1仅列举了除本发明报道外的若干种菌中的7种菌的名称和相关引物。
经大量的预实验可知，从筛选的若干种菌中，仅只从Kribbella flavida的基因组中成功的获得了具有催化三七皂苷Fc专一生成越南人参皂苷R7的酶及其编码基因。这表明，从 Kribbella flavida的基因组中获得人参皂苷水解酶及其编码基因并不是显而易见的，本领域技术人员并不是简简单单地便可从众多预测的具有糖苷水解酶功能的基因序列中获得能够蛋白表达好且具有催化三七皂苷Fc专一生成越南人参皂苷R7的酶。因此，本发明选择了Kribbella flavida DSM 17836的基因组DNA为模版来获得三七皂苷Fc水解酶。
表1基因组来源及引物设计
实施例2：三七皂苷水解酶及其编码基因的克隆
以提取Kribbella flavida DSM 17836的基因组DNA为模版，以5′ -CCGGAATTCATGGTCGAGCTCTCCCCGCT-3′(Forward)和5′ -CCCAAGCTTTCAGGCCTCGCGGTGGC-3′(Reverse)为引物进行聚合酶链式反应PCR 扩增。
PCR体系为：2×Taq Mixture 25μL，上下游引物(10μm)各1μL，基因组1μL和 ddH2O22μL。
PCR条件为：先95℃预变性3min，然后95℃30s，58℃30s，72℃2min，共30 个循环；最后72℃延伸10min。
上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，割胶并用试剂盒回收目的条带。
用限制性内切酶EcoRI和HindIII分别将回收产物与pET-28a(+)载体进行双酶切(37℃，6h)；用试剂盒纯化回收酶切产物，并用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单克隆，PCR验证阳性，获得重组菌。
提取重组菌的质粒测序验证，该PCR产物的基因命名为Kf1，其核苷酸序列为序列表中的序列2，该序列与Kribbella flavida DSM 17836的基因组中预测的具有糖苷酶功能的基因序列一致，证明克隆正确，该基因编码的蛋白命名为KfGH01，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1。将含有该PCR产物的质粒命名为pET-28a(+)-Kf1，该质粒为将序列表中的序列1插入pET-28a(+)载体的EcoRI和HindIII双酶切位点间得到的载体。
实施例3：定点突变获得三七皂苷水解酶KfGH01I248Y。
利用KfGH01的基因工程菌中提取质粒，以5′ -CATCGCCGACGGGCACTACAATCGCTGGTGGCTC-3′(Forward)和5′ -GAGCCACCAGCGATTGTAGTGCCCGTCGGCGATG-3′(Reverse)分别进行聚合酶链式扩增反应。
PCR体系为：Primer STAR 12.5μL，上下游引物(10μm)各0.5μL，基因组1μL和ddH2O 22μL。
PCR条件为：98℃10s，55℃15s，72℃7min，共30个循环；72℃10min，4℃保存。
用Dpn I酶37℃消化PCR产物30min后，转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)中，挑取单克隆，菌落PCR验证所得重组菌。
提取重组菌的质粒测序验证，KfGH01I248Y突变体的基因命名为Kf1I248Y，其核苷酸序列为序列表中的序列3，该基因编码的蛋白命名为KfGH01I248Y，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列4，将含有该突变体基因的质粒命名为pET-28a(+)-Kf1I248Y。
实施例4：重组三七皂苷水解酶KfGH01的表达与纯化
将上述获得的BL21(DE3)/pET-28a(+)-Kf1的单菌落接种至含有卡那霉素(终浓度为50μ g/mL)的LB液体培养基中，37℃培养12h，取1ml菌液(1％，体积百分含量)加入到100 mL新鲜的LB液体培养基中，同时加入卡那霉素(终浓度为50μg/mL)，37℃培养至OD600 达到0.5时，再在培养基中加入IPTG(终浓度为0.1mM)，在16℃进行诱导24h。收集发酵液，将发酵液4℃，8000rpm离心5min收集菌体。用50mL生理盐水洗涤2次，离心，收集菌体。
用10mL A液(20mM的pH7.4的磷酸钠盐缓冲液，含20mM咪唑，500mM NaCl) 重悬菌体。在冰水浴中，用超声波破碎机破碎细菌细胞(400W，工作4s暂停6s，工作99 次)，4℃下15000rpm离心30min，2次离心，上清液即为粗酶液。
将His TrapTM FF crude镍柱装于蛋白纯化仪AKTA上，用A液以5mL/min流速冲洗10个柱体积；尽量保持相同流速(约4mL/min)用1mL注射器将粗酶蛋白注入到镍柱当中，用4倍柱体积的A液冲洗镍柱，以除去未结合蛋白。
以A液为初始液并不断增加B液(20mM的pH7.4磷酸钠盐缓冲液，含500mM咪唑，500mM NaCl)体积，总体积为100mL(此时洗脱液全部为B液)，收集相应洗脱液(5mL/ 管)，继续用20mL B液进行洗脱以除去未洗脱完全的蛋白。
洗脱液经SDS-PAGE蛋白电泳分析，合并目的蛋白，置于30kD的超滤管中，4℃下2800rpm离心若干分钟，待蛋白溶液剩余约2mL时，加入20mL C液(10％甘油(w/v)的 pH 7.0的20mM磷酸钠盐缓冲液)继续超滤，重复3次，于-80℃冻存。
实施例5：重组三七皂苷水解酶KfGH01的最适温度
取一定量的重组三七皂苷水解酶KfGH01和终浓度为2mM的对硝基苯-β-D-葡萄糖苷，加 入 pH 7.0 50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液至体积为0.5mL，于25-55℃水浴反应 5min 后，再加入0.5mL 1mM的Na2CO3溶液终止反应，测定405nm处的吸光值，以最高活力为 100％，相对活力结果如表2所示，该酶在50℃时具有最高的反应活性。
温度(℃) 相对活力(％)
30 63.7±4.2
35 73.8±2.5
40 83.7±1.3
45 98.6±3.2
50 100.0±3.2
55 79.3±3.2
60 39.2±3.2
表2三七皂苷水解酶KfGH01的最适温度
实施例6：重组三七皂苷水解酶KfGH01的热稳定性
在不同温度下，将终浓度为1.8mg/mL的蛋白在pH 7.0的50mM磷酸钠盐缓冲液中保温1h。
取一定量保温后的重组三七皂苷水解酶KfGH01和终浓度为2mM的对硝基苯-β-D- 葡萄糖苷，加入pH 7.0 50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液至体积为0.5mL，25-55℃水 浴反应5min后，再加入0.5mL 1mM的Na2CO3溶液终止反应，测定405nm处的吸光值，测定残余 活力，并以剩余残余活力最高的温度为基准，计算相对活力该酶的热稳定性如表3所示，其 在30℃和35℃时都保持有相对较高的残余活力。
温度(℃) 相对活力(％)
30 100.0±2.9
35 99.3±1.2
40 76.8±2.3
45 9.6±0.3
50 1.3±0.3
表3三七皂苷水解酶KfGH01的热稳定性
实施例7：重组三七皂苷水解酶KfGH01的最适pH
取一定量的重组三七皂苷水解酶KfGH01和终浓度为2mM的对硝基苯-β-D-葡萄糖苷，分 别加入50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.0-5.0)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(6.0- 8.0)、甘氨酸-氢氧化钠溶液(pH 9.0-10.0)至体积为0.5mL；37℃水浴反应5min后，加入 0.5mL 1mM的Na2CO3溶液终止反应，测定405nm处的吸光值，最适pH结果如表4所示，该酶在 pH 7.0时具有最高的相对活力。
pH 相对残余活力(％)
4.0 30.3±0.1
5.0 68.8±2.4
6.0 88.8±4.2
7.0 100.0±2.4
8.0 74.5±2.7
9.0 65.5±4.1
10.0 30.2±1.2
表4三七皂苷水解酶KfGH01的最适pH
实施例8：重组三七皂苷水解酶KfGH01的pH稳定性
取一定体积的终浓度为0.45mg/mL的重组三七皂苷水解酶KfGH01和终浓度为2mM的对硝基苯-β-D-葡萄糖苷，分别加入50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.0-5.0)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(6.0-8.0)、甘氨酸-氢氧化钠溶液(pH 9.0-10.0)至体积为0.5mL，在4℃下保温12h。
取一定量保温后的重组三七皂苷水解酶KfGH01和终浓度为2mM的对硝基苯-β-D- 葡萄糖苷，加入pH 7.0 50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液至体积为0.5mL，37℃水浴反 应5min后，加入0.5mL 1mM的Na2CO3溶液终止反应，测定405nm处的吸光值，该酶的pH稳定性 如表5所示，其在pH 7.0时具有相对最高的残余活力。
pH 相对残余活力(％)
4.0 36.3±0.9
5.0 92.1±0.3
6.0 94.8±3.1
7.0 100.0±2.6
8.0 92.3±1.3
9.0 50.0±0.4
10.0 42.7±0.5
表5三七皂苷水解酶KfGH01的pH稳定性
实施例9：三七皂苷水解酶突变体KfGH01I248F/Y410R转化三七皂苷Fc的考察在0.2mL pH 7.0的50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，加入终浓度为0.34mg/mL纯化后的三七皂苷水解酶突变体KfGH01I248F/Y410R和终浓度为4mM的三七皂苷Fc，37℃反应不同时间后，取样测定。
样品加入甲醇沉淀蛋白，涡旋30s，20,000g离心20min。地高辛作为测定内标，样品稀释到一定浓度，采用高效液相色谱串联质谱检测(Agilent 1290series UHPLC和anAgilent 6410三重四级杆串联电喷雾质谱)。超高效液相色谱检测条件为，ACQUITY UPLCHSS T3column(100mm×2.1mm i.d.,1.8μm；Waters Co.,Milford,MA,USA)，柱温为 45℃，流动相为(A)0.1％甲酸(含5mM醋酸铵)和(B)乙腈。流速为0.4mL/min。
洗脱条件以B所含体积为依据，0-1min(15-37％),1-2min(37％),2-2.5min(37-40％), 2.5-3min(40-45％),3-5min(45-80％),5-5.01min(80-90％),5.01-6min(90％)。
质谱条件：毛细管电压3.4kV，以负离子多重扫描格式进行检测。越南人参R7和三七皂苷ST-4的母/子离子、碎片离子电压、碰撞能分别是：1077.6/945.7，915.6/621.4；205，255V；48，34eV。
如表6结果表明，3h时三七皂苷水解酶突变体KfGH01I248F/Y410R已几乎将底物完全转化。
表6三七皂苷水解酶突变体KfGH01I248F/Y410R转化三七皂苷Fc的考察
实施例10：三七皂苷水解酶突变体KfGH01I248F/Y410R在生产越南人参皂苷R7中的应用
在35℃pH 7.0的100mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，加入终浓度为2mM的三七皂苷Fc和0.2g KfGH01I248F/Y410R突变体冻干的细胞裂解上清，反应8h后，用100mL水饱和正丁醇萃取2次，减压蒸干，得到样品。
在所示实验条件下，三七皂苷Fc已完全转化，得到越南人参皂苷R7约188mg，得率约为87.3％。

Claims (10)

1.一种三七皂苷糖苷水解酶及其突变体，其特征在于：
（1）氨基酸序列如SEQ NO：2所示；
（2）氨基酸序列为SEQ NO：2序列中的氨基酸经过以下位点突变所得的突变体，即I248F、I174E、E178T、Q313S、Y410R、I248F/I174E、I248F/E178T、I248F/Q313S、I248F/Y410R、I248F/I174E/E178T、I248F/I174E/Q313S、I248F/I174E/Y410R、I248F/Y410R/Q313S、I248F/E178T/Q313S、I248F/E178T/Y410R、I248F/I174E/E178T/Q313S、I248F/I174E/E178T/Y410R、I248F/I174E/Q313S/Y410R、I248F/E178T/Q313S/Y410R、I248F/I174E/E178T/Q313S/Y410R；
（3）氨基酸序列为（1）或（2）序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有皂苷水解酶活性或对其他化合物具有糖苷水解酶活性的衍生蛋白质；
（4）在（1）或（2）氨基酸序列的N或C末端具有标签序列，或（1）或（2）的N末端具有信号肽序列的蛋白。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.权利要求2所述的基因，其特征在于：
（1）序列表中序列1所示的DNA分子；
（2）与（1）限定的DNA序列至少具有70%-100%同源性且编码具有人参皂苷酶活性或对其他化合物具有糖苷水解酶活性蛋白质的DNA分子。
4.一种可表达权利要求1所述三七皂苷糖苷水解酶及其突变体的野生菌株或重组体系，其特征在于：在所述的重组体系上克隆有如权利要求2或3所示的DNA序列；野生菌株为Kribbella flavida DSM 17836或其同属菌株；所述的重组体系包括重组质粒、表达盒、转基因细胞系和重组菌。
5.权利要求1所述蛋白在作为转化人参或三七类皂苷酶中的应用。
6.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因或权利要求4所述重组体系在转化皂苷和生产皂苷中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：酶解反应温度为10-65℃，pH 3.0-11.0。
8.权利要求6所述皂苷其特征在于：包括人参皂苷、三七皂苷、西洋参皂苷、竹节参皂苷和越南人参皂苷。
9.一种生产越南人参皂苷R7的方法，包括如下步骤：
（1）发酵权利要求4所述重组菌，培养、收集发酵液、离心收集菌体、破碎菌体后离心收集上清液或冷冻干燥上清液，分离纯化蛋白；
（2）将所述上清液或上清液冻干粉或纯化蛋白与三七皂苷Fc在缓冲液中反应，经萃取或分离纯化得越南人参皂苷R7。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：
（1）所述发酵在IPTG诱导下进行或不诱导直接发酵；
（2）反应条件在权利要求7条件下进行。
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