CN105821019B - 一种越南人参皂苷r7水解酶基因的克隆和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，涉及一种越南人参皂苷R₇水解酶基因的克隆和应用，该水解酶在生产三七皂苷ST‑4中的应用。

Description

一种越南人参皂苷R7水解酶基因的克隆和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种越南人参皂苷R₇水解酶基因的克隆和应用，尤其涉及一种越南人参皂苷R₇水解酶基因的克隆、表达和应用，该水解酶在生产三七皂苷ST-4 中的应用。

背景技术

人参属植物，如人参、三七、西洋参等，都具有广泛的临床及保健应用。其功效主要成分为人参皂苷类物质。现代药理学研究报道，这些皂苷具有调节人体免疫力、抗心肌缺血、抗衰老、促进神经细胞生长、抑制肿瘤生长等活性，并且人参皂苷分子结构中糖基侧链的不同会显示出较大差异的性质和药理活性(Biochem.Pharmacol.1999，58：1685-1693；Chem. Rev.2012，112：3329-3355；J.Pharm.Pharmacol.2006，58：1007-1019)。然而，由于只有数种人参皂苷在人参属植物或药材中的含量占主要地位，一些稀有皂苷含量微乎其微，甚至没有，这就大大限制了新药的研究、开发及临床应用。人参皂苷的不同很大程度上是由于其所带糖基的不同。目前，对于稀有皂苷的制备主要是从主体结构中选择性的水解糖残基，方法有化学水解法和生物转化两大类。化学方法的应用主要受限于其缺乏专一性，因此，一定程度上，生物转化方法更有利于特定稀有人参皂苷的制备(Appl.Microbiol.Biotechnol.2010， 87：9-19)。目前，利用微生物或酶法对人参皂苷的转化主要集中于Rg₃、Rh₂、PPD、PPT、 Rh₁和C-K等的制备(Process Biochem.2014，49：813-820；Appl.Microbiol.Biotechnol.2012， 94：377-84；Bioresource Technol.2010，101：7872-7876)。三七皂苷ST-4，具有抑制单纯疱疹病毒等作用，主要从蒸煮炮制后的三七茎叶中分离得到，只有0.00066％的得率(J.Asian Nat. Prod.Res.13,498-504,NotoginsenosideST-4inhibits virus penetration of herpes simplex virus invitro)。

三七皂苷ST-4结构式为：

糖苷酶广泛存在于自然界中许多植物和微生物体内，是一种能催化水解芳基或烃基等与糖基原子团之间的糖苷键生成相应糖的酶。糖苷酶对底物的专一选择性差异很大，虽然归类划分糖苷酶种类时有葡萄糖苷水解酶，木糖水解酶，阿拉伯糖水解酶等，但是往往一种糖苷酶可以水解不同类型的糖苷或糖基侧链(如二或三糖链)，正因如此增加了特定糖基选择性水解的难度；同时，糖苷酶与小分子底物相互作用，需要特定的空间结构与活性口袋，尤其是越南人参皂苷R₇的分子量已达1107，结构非常复杂，具有多个手性中心。因此，很难寻找到能够与其产生特定相互作用的糖苷酶。越南人参皂苷R₇在20位C上连接有一个葡萄糖， 3位C上连接有一个木糖和两个葡萄糖，因此要将其特定转化成三七皂苷ST-4，需要完全水解20位C上的葡萄糖，同时保证3位C上的葡萄糖和木糖不被降解，这严重阻碍了专一、高效催化越南人参皂苷R₇生成三七皂苷ST-4的生物催化剂的挖掘。目前为止，没有任何越南人参皂苷R₇被酶催化的相关报道。

发明内容

针对现有不足，本发明的目的是提供一种越南人参皂苷R₇水解酶及其在生产三七皂苷ST-4中的应用。

本发明的蛋白命名为HaGH03，其为如下的蛋白：

(1)氨基酸序列如SEQ NO：2所示。

(2)氨基酸序列为SEQ NO：2序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有人参皂苷水解酶活性的衍生蛋白质。

(3)在(1)或(2)氨基酸序列的N或C末端具有标签序列，或在(1)或(2)的N末端具有信号肽序列的蛋白。

编码上述蛋白质的基因同样在本发明保护的范围之内。

上述基因是如下(1)或(2)或(3)的DNA分子。

(1)序列表中序列1所示的DNA分子。

(2)与(1)限定的DNA序列至少具有70％-100％同源性且编码具有人参皂苷酶活性蛋白质的DNA分子。

含有上述基因的野生菌株、重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

上述重组载体为将上述蛋白的编码基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体，在一个优选例中，具体为将序列3所示的DNA分子插入到载体pET28a的BamHI和HindIII识别位点间，而得到的重组载体。

上述野生菌或上述蛋白、基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在作为人参皂苷酶中的应用也是本发明保护的范围。

上述蛋白在转化皂苷和生产皂苷中的应用也是本发明保护的范围。

上述蛋白在生产三七皂苷ST-4中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种生产三七皂苷ST-4的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

(1)发酵本发明所述重组菌，培养、收集发酵液、离心收集菌体、破碎菌体后离心收集上清液或冷冻干燥上清液，分离纯化蛋白；

(2)将所述上清液或上清液冻干粉或纯化蛋白与越南人参皂苷R₇在缓冲液中反应，经萃取或分离纯化得到三七皂苷ST-4。

上述方法中(1)所述发酵在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导下进行或不诱导直接发酵。

上述方法中(2)所述反应条件在温度为10-65℃和pH 4.0-11.0缓冲液中进行。在0.2 mL pH 6-8的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，加入终浓度为0.1-3mg mL^–1纯化后的重组越南人参皂苷R₇水解酶HaGH03和不同底物浓度的越南人参皂苷R₇(2.5-5.5mg mL^–1)，15-45℃反应不同时间后，

本发明的实验证明，本发明的一种越南人参皂苷R₇水解酶具有高效专一的转化越南人参皂苷R₇生成三七皂苷ST4。

附图说明

图1为本发明的越南人参皂苷R₇水解酶的SDS-PAGE图；

图2为利用本发明的越南人参皂苷R₇水解酶催化生成的三七皂苷ST-4的UPLC色谱图；

图3为利用本发明的越南人参皂苷R₇水解酶催化生成的三七皂苷ST-4的高分辨质谱图；

图4为利用本发明的越南人参皂苷R₇水解酶催化生成的三七皂苷ST-4的¹³C核磁图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

预实验1-5种菌的名称和相关引物

提取若干种菌的基因组，以基因组DNA为模板，设计合成引物，并对目的基因进行分子克隆、构建基因工程菌和表达，表1仅列举了除本发明报道外的若干种菌中的6种菌的名称和相关引物。

表1基因组来源及引物设计

预实验2、基因组1编码基因的克隆、蛋白表达、生产三七皂苷ST-4的探索

提取Meiothermus ruber DSM 1279的基因组DNA为模版，以 5′-CCGGAATTCATGAAACGAAGCGATTTCCCCG′(Forward)和5′-CCCAAGCTTTCATGAGCTGGCGACCG-3′(Reverse)为引物进行聚合酶链式反应PCR扩增. PCR体系为：2×Taq Mixture 25μl，上下游引物各1μL，基因组1μL和ddH₂O 22μL。PCR 条件为：先95℃预变性3min，然后95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2mins，共30个循环；最后72℃延伸10min。

上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，割胶并用试剂盒回收目的条带。

用限制性内切酶BamHI和HindIII分别将回收产物与pET28a载体进行双酶切(37℃， 6h)；用试剂盒纯化回收酶切产物，并用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌 E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，PCR验证阳性，获得重组菌。提取重组菌的质粒测序验证，该PCR产物的与目的核苷酸序列一致。挑取单克隆至含有卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的 LB液体培养基中，37℃培养10h，取1mL菌液(1％，体积百分含量)加入到100mL新鲜的LB液体培养基中，同时加入卡那霉素(终浓度为50μg/ml)，37℃培养至OD₆₀₀达到 0.5时，再在培养基中加入IPTG(终浓度为0.1mM)，在16℃进行诱导24h。收集菌体。用10mL pH7.0的磷酸钠盐缓冲液，重悬菌体。超声波破细胞，4℃下15000rpm离心30min，上清即为粗酶液。

在总体积为0.5mL pH 6.5的50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，加入一定浓度粗酶液和一定底物浓度的越南人参皂苷R₇，37℃反应48h后，加入相同体积的水饱和正丁醇终止反应，萃取，60℃加热挥干，甲醇复溶，用薄层色谱进行检测。(展开剂为氯仿：甲醇：水＝6.5：3.5：0.5；显色剂：10％硫酸-乙醇溶液)。结果未检出到三七皂苷ST-4的生成。

无特殊说明外，菌2-5的基因组2-5编码基因的克隆、蛋白表达与生产三七皂苷ST-4 的探索实验均按照预实验2的相同或相似步骤进行。

经大量的预实验可知，虽然从筛选的若干种菌中都成功克隆得到了与预测具有糖苷酶功能的相一致的基因序列，同时经过表达与纯化，但目前也仅仅只从Herpetosiphonaurantiacus 的基因组中成功的获得了具有催化越南人参皂苷R₇专一生成三七皂苷ST-4的酶及其编码基因。这表明，从Herpetosiphon aurantiacus的基因组中获得人参皂苷水解酶及其编码基因并不是显而易见的，因为就算预测有糖苷酶功能，并不意味着对所有的糖苷底物都起催化作用，尤其是具有像越南人参皂苷R₇这么大分子量和结构如此复杂的底物。本领域技术人员并不是简简单单地便可从众多预测的具有糖苷水解酶功能的基因序列中获得催化越南人参皂苷R₇专一生成三七皂苷ST-4的皂苷水解酶。因此，本发明选择了橙色滑柱菌(Herpetosiphon aurantiacus DSM 785)的基因组DNA为模版来获得越南人参皂苷R₇水解酶。

实例1、越南人参皂苷R₇水解酶及其编码基因的克隆

提取橙色滑柱菌(Herpetosiphon aurantiacus DSM 785)的基因组DNA为模版，以5′-CGCGGATCCATGACCGCGAGCGATCAAC-3′(Forward)和5′-CCCAAGCTTCTAGCCCTGATTGACCTTGGC-3′(Reverse)为引物进行聚合酶链式反应PCR扩增。PCR体系为：2× TaqMixture 25μL，上下游引物各1μL，基因组1μL和ddH₂O 22μL。

PCR条件为：先95℃预变性3min，然后95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 2min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，割胶并用试剂盒回收目的条带。

用限制性内切酶BamHI和HindIII分别将回收产物与pET28a载体进行双酶切 (37℃，6h)；用试剂盒纯化回收酶切产物，并用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单克隆，PCR验证阳性，获得重组菌BL21 (DE3)/pET28a-Ha3。

提取重组菌的质粒测序验证，该PCR产物的基因命名为Ha3，其核苷酸序列为序列表中的序列1，该序列与Herpetosiphon aurantiacus的基因组中预测的具有糖苷酶功能的基因序列一致，证明克隆正确，该基因编码的蛋白命名为HaGH03，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。将含有该PCR产物的质粒命名为pET28a-Ha3，该质粒为将序列表中的序列1插入pET28a载体的BamHI和HindIII双酶切位点间得到的载体。

实例2重组越南人参皂苷R₇水解酶HaGH03的表达与纯化

将上述获得的BL21(DE3)/pET28a-Ha3的单菌落接种至含有卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃培养10h，取1mL菌液(1％，体积百分含量)加入到100mL新鲜的LB液体培养基中，同时加入卡那霉素(终浓度为50μg/mL)，37℃培养至OD₆₀₀达到0.5时，再在培养基中加入IPTG(终浓度为0.1mM)，在16℃进行诱导24h。收集发酵液，将发酵液4℃，8000rpm离心5min收集菌体。用50mL生理盐水洗涤2次，离心，收集菌体。

用10mL A液(pH7.4的磷酸钠盐缓冲液，含20mM咪唑，500mM NaCl)重悬菌体。在冰水浴中，用超声波破碎机破碎细菌细胞(400W，工作4s暂停6s，工作99次)，4℃下15000rpm离心30min，2次离心，上清即为粗酶液。

用Ni-NTA亲和层析柱对粗酶液进行纯化。以A液(pH7.4的磷酸钠盐缓冲液，含20mM咪唑，500mM NaCl)和B液(pH7.4的磷酸钠盐缓冲液，含500mM咪唑，500mM NaCl)进行梯度洗脱，流速为5mL/min，收集100mL洗脱液，对纯化酶液进行超滤。纯化酶纯度的鉴定和分子量的测定采用SDS-PAGE方法进行，见图1，从左到右分别为蛋白Marker、粗酶液、纯酶液和蛋白Marker。

实例3重组越南人参皂苷R₇水解酶HaGH03的最适温度

在0.5mL pH 6.550mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，加入终浓度为2mM的对 硝基苯-β-D-葡萄糖苷和一定量的重组越南人参皂苷R7水解酶HaGH03，20-65℃水浴反应 5min后，加入0.5mL 1mM的Na2CO3溶液终止反应，测定405nm处的吸光值，相对活力结果如表2 所示，该酶在50℃时具有最高的反应活性。

温度(℃)	相对活力(％)
		20	17.1±1.0
25	25.1±1.0
		30	36.6±0.7
35	44.7±1.7
		40	62.4±2.1
45	83.3±3.1
		50	100±3.8
55	89.1±2.9
		60	43.2±2.3

表2越南人参皂苷R₇水解酶的最适温度；

实例4重组越南人参皂苷R₇水解酶HaGH03的最适pH

分别在50mM 0.5mL的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4-5)，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲 液 (6-8)，甘氨酸-氢氧化钠溶液(pH 9-10)中，加入终浓度为2mM的对硝基苯-β-D-葡萄糖 苷和一定量的重组越南人参皂苷R7水解酶HaGH03，37℃水浴反应5min后，加入0.5mL 1mM 的Na2CO3溶液终止反应，测定405nm处的吸光值，最适pH结果如图3所示，该酶在pH 6.5 时具 有最高的相对活力。

pH	相对活力(％)
		4.0	24.5±1.2
5.0	60.0±1.3
		6.0	96.1±1.8
6.5	100±4.7
		7.0	76.1±2.6

8.0	48.7±2.1
		9.0	41.5±1.8
10.0	17.4±0.7

表3越南人参皂苷R₇水解酶的最适pH

实例4重组越南人参皂苷R₇水解酶HaGH03的pH稳定性

分别用醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4-5)，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(6-8)，甘氨酸- 氢氧化钠溶液(pH 9-10)稀释重组越南人参皂苷R₇水解酶HaGH03为终浓度1mg/ml，在4℃下保温24h。

在0.5mL pH 6.550mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，加入终浓度为2mM的对 硝基苯-β-D-葡萄糖苷和一定量的在4℃下保温24h后的重组越南人参皂苷R7水解酶 HaGH03，加入终浓度为2mM的对硝基苯-β-D-葡萄糖苷和一定量的重组越南人参皂苷R7水解 酶HaGH03，37℃水浴反应5min后，加入0.5mL 1mM的Na2CO3溶液终止反应，测定 405nm处的吸 光值，该酶的pH稳定性如表4所示，其在pH 7.0时具有相对最高的残余活力。

pH	相对残余活力(％)
		4.0	5.3±0.7
5.0	81.5±3.6
		6.0	88.5±2.6
6.5	89.4±2.7
		7.0	100±3.5
8.0	85.2±4.6
		9.0	73.2±1.9
10.0	59.9±2.4

表4越南人参皂苷R₇水解酶的pH稳定性

实例5不同越南人参皂苷R₇浓度对酶转化作用的影响

在0.2mL pH 6.5的50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，加入终浓度为0.6mgmL^–1纯化后的重组越南人参皂苷R₇水解酶HaGH03和不同底物浓度的越南人参皂苷R₇ (2.5-5.5mg mL^–1)，37℃反应不同时间后，取样测定。

样品加入甲醇以沉淀蛋白，涡旋30s，20,000g离心20min。地高辛作为测定内标，样品稀释到一定浓度，采用高效液相色谱串联质谱检测(Agilent 1290series UHPLC和anAgilent 6410三重四级杆串联电喷雾质谱)。超高效液相色谱检测条件为，ACQUITY UPLCHSS T3column(100mm×2.1mm i.d.,1.8μm；Waters Co.,Milford,MA,USA)，柱温为45℃，流动相为(A)0.1％甲酸(含5mM醋酸铵)和(B)乙腈。流速为0.4ml/min。

洗脱条件以B所含百分体积为依据，0-1min(15-37％)，1-2min(37％)，2-2.5min(37-40％)，2.5-3min(40-45％)，3-5min(45-80％)，5-5.01min(80-90％)，5.01-6min(90％)。流速为0.4mL/min。

如表5结果表明，当越南人参皂苷R₇浓度为2.5mg/mL时，反应24h，转化率已几乎达到100％；当提高底物浓度后，需进一步延长反应时间。

表5不同越南人参皂苷R₇浓度对越南人参皂苷R₇水解酶转化作用的影响

实例6越南人参皂苷R₇水解酶在生产三七皂苷ST-4中的应用

将1.5g的冻干粗酶粉和越南人参皂苷R₇(260mg)加入到300mL pH值为6.5的磷酸钠盐缓冲液中，在37℃反应24h时间后，用等体积的正丁醇萃取3次，合并正丁醇层，并减压蒸干，得到样品。

溶解少量制备的样品，采用高效液相色谱串联质谱检测(Agilent 1290seriesUHPLC和 an Agilent 6410三重四级杆串联电喷雾质谱)。超高效液相色谱检测条件为，ACQUITY UPLC HSS T3column(100mm×2.1mm i.d.,1.8μm；Waters Co.,Milford,MA,USA)，柱温为45℃，流动相为(A)0.1％甲酸(含5mM醋酸铵)和(B)乙腈。

洗脱条件以B所含百分体积为依据，0-1min(15-37％)，1-2min(37％)，2-2.5min(37-40％)，2.5-3min(40-45％)，3-5min(45-80％)，5-5.01min(80-90％)，5.01-6min(90％)。流速为0.4ml/min。

实例7高效液相色谱串联质谱检测的质谱条件

质谱条件：毛细管电压3.4kV，以负离子多重扫描方式进行检测。越南人参皂苷R₇和三七皂苷ST-4的母/子离子、碎片离子电压、碰撞能分别是：1077.6/945.7，915.6/621.4；205，255V；48，34eV。

实例8正丁醇部分纯化得到的三七皂苷ST-4的高分辨质谱条件

质谱条件：负离子扫描模式，毛细管电压2.4kV；锥孔电压35V，离子源温度120℃，扫描范围为100-1200Da。

实例9正丁醇部分纯化得到的三七皂苷ST-4的¹³C核磁条件

核磁条件：样品溶于氘代吡啶，在25℃下，用Bruker AV 400NMR(Faellanden,Switzerland)仪器检测。

采用Waters的UPLC-Synapt G2高分辨飞行时间质谱和核磁共振鉴定为三七皂苷ST-4，分别见图2、图3和图4。本发明的核磁共振鉴定参考Notoginsenoside ST-4inhibitsvirus penetration of herpes simplex virus in vitro等文章的方法,经过比对，与该文献一致。

在所示实验条件下，越南人参皂苷R₇已完全转化为三七皂苷ST-4，得200mg的三七皂苷ST-4。

Claims (2)

1.一种生产三七皂苷ST-4 的方法，包括如下步骤：

步骤一：发酵表达越南人参皂苷R 7水解酶的重组菌，培养、收集发酵液、离心收集菌体、破碎菌体后离心收集上清液或冷冻干燥上清液，分离纯化蛋白；所述发酵在IPTG诱导下进行或不诱导直接发酵；

越南人参皂苷R7水解酶，氨基酸序列如SEQ NO：2所示；

步骤二：将所述上清液或上清液冻干粉或纯化蛋白与越南人参皂苷R7在缓冲液中反应，经分离纯化得到三七皂苷ST-4 ；

酶解反应温度为30-60℃，pH5.0-9.0。

2.一种生产三七皂苷ST-4 的方法，包括如下步骤：

步骤一：发酵表达越南人参皂苷R 7水解酶的重组菌，培养、收集发酵液、离心收集菌体、破碎菌体后离心收集上清液或冷冻干燥上清液，分离纯化蛋白；所述发酵在IPTG诱导下进行或不诱导直接发酵；

越南人参皂苷R7水解酶，氨基酸序列如SEQ NO：2所示；

步骤二：将所述上清液或上清液冻干粉或纯化蛋白与越南人参皂苷R7在缓冲液中反应，经萃取得到三七皂苷ST-4 ；

酶解反应温度为30-60℃，pH5.0-9.0。

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