CN113584002B - 一种α-L-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种α-L-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113584002B
CN113584002B CN202110019051.9A CN202110019051A CN113584002B CN 113584002 B CN113584002 B CN 113584002B CN 202110019051 A CN202110019051 A CN 202110019051A CN 113584002 B CN113584002 B CN 113584002B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rhamnosidase
alpha
chd
epimedin
rhamnoside
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110019051.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113584002A (zh
Inventor
袁其朋
程磊雨
刘芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing University of Chemical Technology
Original Assignee
Beijing University of Chemical Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing University of Chemical Technology filed Critical Beijing University of Chemical Technology
Priority to CN202110019051.9A priority Critical patent/CN113584002B/zh
Publication of CN113584002A publication Critical patent/CN113584002A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113584002B publication Critical patent/CN113584002B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/0104—Alpha-L-rhamnosidase (3.2.1.40)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种新型α‑L‑鼠李糖苷酶及其制备方法和应用，属于基因工程和生物催化领域。具体涉及一种新型的α‑L‑鼠李糖苷酶及其氨基酸序列、编码上述氨基酸序列的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的重组载体和重组细胞、利用上述重组细胞制备α‑L‑鼠李糖苷酶的方法以及上述α‑L‑鼠李糖苷酶在阿可拉定生产中的应用。本发明所提供的α‑L‑鼠李糖苷酶可以高效逐步水解断裂朝藿定C外侧和内侧鼠李糖苷键。在α‑L‑鼠李糖苷酶和β‑D‑葡萄糖苷酶的共同催化下，底物朝藿定C几乎全部转化为阿可拉定，转化率高达99%以上、无副产物、步骤简单、反应时间短、且污染小。

Description

一种α-L-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程和生物转化领域，具体涉及一种α-L-鼠李糖苷酶、其制备方法及应用。
背景技术
淫羊藿是一种中国传统中药，具有补肾祛湿等功效。淫羊藿药材中的主要活性成分有朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷等黄酮皂苷，其中朝藿定C（图1）含量最高，占黄酮总量的70%左右。
阿克拉定（图1），又名淫羊藿素，具有抗炎、调节免疫等作用，是朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷等苷元。研究显示，阿克拉定还具有显著的抗癌活性，尤其是对肝癌细胞具有较好的抑制作用。目前该天然抗肿瘤药物已经进入三期临床实验，未来阿可拉定有望成为晚期肝癌临床治疗的一个重要选择，在药物领域具有广阔的应用前景。
阿可拉定在天然植物中主要是以皂苷形式存在，游离的含量极少，因此从植物中直接提取制备阿可拉定效率低且浪费资源（中国专利申请号：201710079813.8）。而利用水解去除黄酮皂苷的糖基得到阿可拉定成为了目前的主要制备途径。传统的水解方法为酸解法和Smith降解法，虽然皂苷上的糖基可以被有效水解断裂得到阿可拉定，但是该过程对环境污染大、步骤较为复杂，不符合绿色制造战略要求（中国专利申请号：201711485889.7和201810250390.6）。因此生物法转化制备阿可拉定成为了目前该领域的主要研究热点。
中国专利（中国专利申请号：201510128987.X）公开了使用葡萄糖苷酶转化淫羊藿提取物制备阿可拉定，但是收率只有20%。中国专利（中国专利申请号：201310674836.5）还公开了使用果胶酶转化淫羊藿提取物制备阿可拉定，但是收率也只有20%；最近有（中国专利申请号：201910220551.1、201710565481.4）采用化学合成法制备阿可拉定的报道，但是合成法涉及到的催化剂昂贵，且副产物多，不易分离纯化。
朝藿定C在植物中含量丰富，以朝藿定C为底物制备阿可拉定是一种很有潜力的制备途径。朝藿定C的C7位置有一个葡萄糖基，在C3位置连有两个鼠李糖基，因此从朝藿定C转化制备阿可拉定主要涉及到葡萄糖苷键的断裂和鼠李糖苷键的断裂。已有相关专利公开了一些鼠李糖苷酶水解断裂朝藿定C上的外侧鼠李糖苷键制备淫羊藿苷（中国专利申请号：201810110773.3，201811307005.3），但是这些酶无法做到同时水解外侧和内侧的鼠李糖苷键，制约了阿可拉定的规模制备和广泛应用。因此挖掘一种能同时高效水解朝藿定C外侧和内侧的鼠李糖苷键的酶对于阿可拉定的规模生产至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种新型α-L-鼠李糖苷酶及其基因、编码所述糖苷酶氨基酸序列的核苷酸序列、用于表达所述糖苷酶的表达载体、包含或整合所述表达载体的宿主细胞、以及所述α-L-鼠李糖苷酶在制备阿可拉定生产中的应用。所述α-L-鼠李糖苷酶可以高效催化水解朝藿定C外侧和内侧的鼠李糖苷键，弥补该领域的空白，促进阿可拉定的酶催化工业生产。
为实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种α-L-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或为将SEQ ID NO.1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的有α--L-鼠李糖苷酶活性的蛋白质，优选为与SEQ ID NO.1有60%以上的相似度。更优选为90%或95%以上。
一种核苷酸序列，编码所述的α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列或为如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。编码SEQ ID NO.1氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
一种重组载体，包含编码所述的α-L-鼠李糖苷酶的核苷酸序列或者包含如SEQ IDNO. 2所示的核苷酸序列。
一种宿主细胞，包含所述的重组载体或者基因组中整合有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
一种α-L-鼠李糖苷酶的制备方法，采用所述的宿主细胞生产或者蓝状菌发酵生产。
进一步的，通过篮状菌Talaromyces stollii固体发酵获得粗酶液，所述粗酶液分别通过硫酸铵沉淀、DEAE柱纯化以及分子筛层析得到纯化的α-L-鼠李糖苷酶。
所述的α-L-鼠李糖苷酶应用于特异性水解朝藿定C外侧和内侧鼠李糖苷键、芦丁鼠李糖苷键、柚皮苷鼠李糖苷键、杨梅苷鼠李糖苷键以及新橙皮苷鼠李糖苷键。
所述的α-L-鼠李糖苷酶应用于制备阿可拉定。
为实现上述发明目的，本发明通过蛋白纯化以及蛋白质指纹质谱技术从篮状菌（TalaromycesStollii，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No. 3.16013，保藏日期：2020.8.28）的基因组中发现了一种具有高效水解朝藿定C C3位置外侧和内侧鼠李糖苷键能力的新型α-L-鼠李糖苷酶。
上述的糖苷酶基因挖掘具体过程为：1、通过Talaromyces stollii固体发酵获得粗酶液，所述粗酶液分别通过硫酸铵沉淀、DEAE柱纯化（DEAE-Berpharose FF，北京博尔西）以及分子筛层析SuperdexTM 200 Increase 10/300 GL，GE Healthcare）得到纯化的天然α-L-鼠李糖苷酶；3、通过基质辅助激光解析离子化串联飞行时间质谱仪（MALDI-TOF/TOF）对纯化的α-L-鼠李糖苷酶进行分析，并根据质谱鉴定出的肽段与Talaromyces stollii基因组注释信息进行比对，从而确定α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列信息。
应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏好性，本领域技术人员可以根据偏好性优化合适特定物种表达的密码子；因此，本发明的α-L-鼠李糖苷酶核苷酸序列还包括由 SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列经取代、缺失和／或增加得到编码具有α-L-鼠李糖苷酶活性的核苷酸序列。
本发明提供的重组载体，包含所述α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2的核苷酸序列；优选地，所述重组载体为pPIC9k- CHD-R2。（CHD-R2表示本发明的α-L-鼠李糖苷酶代号，下同。）
本发明提供的宿主细胞，包含含有α-L-鼠李糖苷酶核苷酸序列的重组载体，或基因组中整合有α-L-鼠李糖苷酶核苷酸序列。所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌以及乳酸菌等；所述真核细胞为酵母细胞、丝状真菌细胞、植物细胞、动物细胞等；优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母。
本发明提供的α-L-鼠李糖苷酶的制备方法，包括在上述的宿主细胞中生产。还包括由篮状菌（Talaromyces stollii）发酵生产。
本发明提供的α-L-鼠李糖苷酶，可以高效水解朝藿定C外侧和内侧鼠李糖苷键。还可以高效水解芦丁、杨梅苷、新橙皮苷和柚皮苷的鼠李糖键。
所述α-L-鼠李糖苷酶对朝藿定C、芦丁、杨梅苷、新橙皮苷和柚皮苷的比酶活分别高达100~205 U/mg、30~62 U/mg、60~105 U/mg、50~95 U/mg和100~172 U/mg；其中酶活定义（U）为：每小时催化水解1 μmol底物所需要的酶量。
所述α-L-鼠李糖苷酶在制备阿可拉定中的应用，采用α-L-鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶同时加入朝藿定C溶液进行转化。
其具体步骤如下：配置底物浓度为10~100 g/L的朝藿定C溶液，向溶液中同时加入α-L-鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶，在40 ℃~60 ℃、pH为4.0~6.0条件下反应2~5 h；反应结束后过滤制得阿可拉定，转化率达到99%。
优选地，所述的催化条件为45 ℃，pH为4.5，反应时间为3 h。
应说明，根据所提供的α-L-鼠李糖苷酶的催化功能事实，所述α-L-鼠李糖苷酶不仅可以应用于阿可拉定的生产，还可应用于异槲皮苷或槲皮素的生产(水解芦丁)、杨梅素的生产（水解杨梅苷）、新橙皮素的生产（水解新橙皮苷）和柚皮素的生产（水解柚皮苷）。
基于同源序列比对，选取了3种与氨基酸序列SEQ ID NO. 1分别具有90.48%、67.12%以及63.63%左右同源度的糖苷酶进行克隆表达以及催化功能研究，结果显示这3种酶均显示出高效催化水解朝藿定C内侧和外侧鼠李糖苷键的功能。因此，本发明中应用于阿可拉定生产的鼠李糖苷酶还应包括与 SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列具有60%以上同源度的糖苷酶。
基于上述α-L-鼠李糖苷酶的发现过程以及应用事实，使用Talaromyces stollii直接发酵或发酵产酶应用以及使用含有上述α-L-鼠李糖苷酶的复合酶制剂用于阿可拉定的生产对于本技术领域人员来说是显而易见的，它们都有被视为包括在本发明内。
本发明的有益效果：
本发明所提供的α-L-鼠李糖苷酶既能水解朝藿定C外侧鼠李糖苷键，又能水解内侧鼠李糖苷键，且酶活性高。在葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的共催化下，朝藿定C几乎完全转化为阿可拉定，转化率高达99%，且过程简单、时间短、污染小，是一种温和、环保、高效的阿可拉定生产技术，适合工业化生产。
附图说明
图1是朝藿定C和阿可拉定结构图。
图2是α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2蛋白纯化电泳图。
图3是α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2匹配肽段数据。
图4是α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2基因组注释信息比对结果。
图5是重组α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2纯化电泳图。
图6是α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2温度影响和温度稳定性。
图7是α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2 pH影响和pH稳定性。
图8是α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2转化朝藿定C液相图。
图9是α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2转化朝藿定C路径图。
图10是α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2转化芦丁液相图。
图11是α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2转化芦丁路径图。
图12是α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2转化杨梅苷液相图。
图13是α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2转化杨梅苷路径图。
图14是α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2转化新橙皮苷液相图。
图15是α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2 转化新橙皮苷路径图。
图16是α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2转化柚皮苷液相图。
图17是α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2转化柚皮苷路径图。
图中：CHD-R2表示本发明实施例中α-L-鼠李糖苷酶代号，实施例中同。
具体实施方式
为了更好的说明本发明的目的以及有益效果，下面将结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。下面实施例是对本发明所做的进一步解释和说明，不应当作为对本发明的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当修改基因序列、改变重组载体、更换重组细胞、改变培养基条件、改变产酶方式、改变催化条件、改进转化工艺路线。所有类似的改动对于本技术领域人员来说是显而易见的，它们都有被视为包括在本发明内。本发明的实施例中所用材料、试剂若未做特殊说明皆可从商业途径获得。
实施例1
制备α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2并对其酶学性质进行研究：
1、篮状菌基因组测序以及基因功能注释
使用Solarbio公司的真菌基因组提取试剂盒对篮状菌（Talaromycesstollii，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No.3.16013，保藏日期：2020.8.28）的基因组进行提取，随后使用Illumina SolexaGenomeAnalyzer二代测序仪对提取的基因组进行分析，获得篮状菌基因组的原始数据。使用FASTQC对所述测序产生的原始数据进行质量评估，并通过Trimmomatic对Illumina测序数据进行质量剪切，得到相对准确的有效数据，结果表明测得的原始数据质量良好，可以进行下一步的拼接注释。
使用SPAdes拼接二代测序数据，采用GapFiller对拼接得到的contig补GAP，并使用PrInSeS-G进行序列矫正，修正拼接过程中的剪辑错误及小片段的插入缺失。采用NCBI的Blast功能将基因蛋白序列与CDD、KOG、COG、NR、NT、PFAM、Swissprot、TrEMBL等多个数据库进行比对，得到其功能注释信息。
2、α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2的纯化
以篮状菌（Talaromycesstollii，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No. 3.16013，保藏日期：2020.8.28）为菌种。Talaromyces stollii 的固体发酵模式产酶效率较之液体发酵要高出很多，故采用固体发酵模式进行发酵产酶。发酵培养基为：35 g麸皮、15 g黄姜粉以及营养盐离子（硫酸铵0.2%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.2%，pH 5.5），基质湿度为70%，发酵温度为30 ℃，时间为5天，中间两次翻曲。发酵结束后，加入1.2 L pH为6.0的磷酸缓冲溶液（20 mM）在40 ℃下洗曲1 h，后通过过滤得到粗酶液1 L。
向上述粗酶液中加入硫酸铵至75%饱和度，并在4 ℃下过夜沉淀，后在4 °C，10000rpm条件下离心15分钟，去掉上清得到粗酶沉淀。再向上述粗酶沉淀中加入50 mL磷酸缓冲液（20 mM，pH 6.0）重新溶解蛋白，并通过0.22 μm滤膜过滤去掉不溶物。使用10 kDa的超滤管（Millipore）在4000 rpm和4 °C下离心对蛋白粗酶液进行浓缩脱盐，得到15 mL蛋白上样液（S0）。
使用DEAE-Sepharose FF柱（5mL，博尔西，北京）对上述S0进行纯化，其中上样缓冲液为20 mM磷酸缓冲液（pH 6.0），上样体积为5 mL，上样流速为0.5 mL/min。上样结束后使用0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3和0.5 M NaCl溶液分别洗脱2，2，4，4，3，3和3个柱体积（CVs），并收集鼠李糖苷酶活性组分样品。使用10 kDa的超滤管（Millipore）在4000 rpm和4°C下离心对上述活性蛋白样品分别进行浓缩脱盐，得到2 mL鼠李糖苷酶样品（D1）。
最后使用分子筛（SuperdexTM 200 Increase 10/300 GL，GE Healthcare）对上述D1进行进一步的纯化，其中上样体积为 0.5 mL，上样流速为0.1 mL/min，上样缓冲液为pH7.0磷酸缓冲液（50 mM磷酸盐和150 mM NaCl）。上样结束后使用pH 7.0磷酸缓冲液（50 mM磷酸盐和150 mM NaCl）以0.3 mL/min的流速洗脱蛋白，并收集活性蛋白组分，4次上样后，最终得到1 mL纯化的α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2（S1）。
将上述个纯化步骤中的S0，D1，和S1进行10%SDS-PAGE蛋白电泳分析（图3）。结果显示纯化蛋白S1在SDS-PAGE上显示出单一的条带，表明蛋白纯度较高，其中α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2的分子量约为140 KDa（图2）。
3、α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2氨基酸序列的鉴定
将天然来源的纯α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2对应的SDS-PAGE条带切下，利用胰蛋白酶对目标蛋白进行消解后，通过ABI 5800 MALDI-TOF/TOF串联质谱仪对目标蛋白的肽段进行质谱分析（图3），并将得到的数据与Talaromyces stollii的基因组注释信息进行比对（图4），从而鉴定出α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2的氨基酸序列SEQ ID NO. 1。
通过分析，上述α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2的理论分子量为107462.4 Da，预测等电点pI为4.47。
4、重组载体的构建以及转化
基于氨基酸序列信息反推出蛋白序列编码基因，并对其进行（毕赤酵母）密码子优化，优化后的α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
根据优化后的糖苷酶核苷酸序列，通过基因全合成方式获得α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2的核苷酸序列。
合成序列表中SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4共2条引物序列，其中引物序列SEQID NO. 3的5'端设有EcoRI酶切位点及其保护碱基序列，引物序列SEQ ID NO. 4的3'端设有NotI酶切位点及其保护碱基序列。以合成的α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2核苷酸序列为模板进行PCR扩增，其中PCR反应体系为50 μL，反应条件为：95 ℃预变性5min，94 ℃变性2min，58℃退火，72℃延伸270 s，共30个循环，然后72 ℃终延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，得到α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2回收片段H1。
使用EcoRI和NotI两种限制性内切酶对回收片段H1和pPIC9k载体分别进行双酶切，然后通过T4连接酶将酶切后的基因序列分别和酶切后的pPIC9k载体进行连接，获得重组载体pPIC9k-CHD-R2。
5、α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2表达以及纯化
使用SalI限制性内切酶对上述获得的pPIC9k-CHD-R2重组载体进行单酶切线性化，然后将两种线性化的重组载体分别电转化到活化的毕赤酵母GS115中得到产酶宿主细胞GS115- CHD-R2。
将上述宿主细胞GS115-CHD-R2接入BMMG培养基中于220 rpm、30 ℃条件下培养12h；然后收集菌体并用无菌水清洗2遍，并接入BMMY培养基中在220 rpm、30 ℃条件下培养，每隔24 h添加1%甲醇诱导。培养5天后，通过离心和过滤去除菌体得到发酵液，再使用镍柱对上述发酵液进行纯化，最终获得纯化的重组α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2，其分子量约为180kDa（图5）。
上述重组蛋白的分子量与理论分子量相差巨大的原因主要是蛋白表达过程中被过度糖基化。
6、α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2酶学性质的研究
α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2酶活的测定：底物为5 mM 4-硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷，加入α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2，在pH 4.5和温度45 ℃条件下反应2 min，反应结束加入碳酸钠后静置5 min，并在400 nm波长处测定反应液的吸光度，并计算酶活；α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2酶活定义（U）：每分钟反应得到1 μmol对硝基苯所需的酶量。
最适温度的研究：底物为5 mM 4-硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷，加入α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2，改变温度范围10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、45 ℃。50 ℃、55 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃，在pH 4.5条件下反应2 min，反应结束加入碳酸钠后静置5 min，并在400 nm波长处测定反应液的吸光度，并计算酶活。结果显示α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2的最适温度为45℃（图6）。
热稳定性的研究：将α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2置于5 ℃、10 ℃、20 ℃、30 ℃、40℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃中放置1 h，后测定残余酶活，结果显示α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2在温度低于50 ℃的范围内保持稳定（图6）。
最适pH的考察：底物为5 mM 4-硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷，加入α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2，改变pH范围1.5、2、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10、11、12、13，在45℃条件下反应5 min，反应结束加入碳酸钠后静置5 min，并在400 nm波长处测定反应液的吸光度，并计算酶活。结果显示α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2的最适品pH为4.5左右（图7）。
pH稳定性研究：将α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2置于pH为1.5、2、3、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10、11、12中放置3 h，后测定残余酶活。结果显示α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2在pH为2~11范围内保持稳定（图7）。
制备的α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2对不同底物进行催化。
分别以朝藿定C、芦丁、杨梅苷、新橙皮苷和柚皮苷为底物，底物浓度为1mg/mL,然后添加α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2，在45 ℃，pH 4.5条件下反应，并定时取样液相检测，转化结果以及转化路径图分别如图8、图9、图10、图11、图12、图13、图14、图15、图16、和图17所示。
实施例2
α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2二重突变体（A49D/F101E）的表达以及纯化
通过定点突变将序列SEQ ID NO. 1中的氨基酸残基Ala49和Phe101分别突变为Asp49和Glu101，突变后的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 5 所示。合成序列表中SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4，其中引物序列SEQ ID NO. 3的5' 端设有EcoRI酶切位点及其保护碱基序列，引物序列SEQ ID NO. 4的3' 端设有NotI酶切位点及其保护碱基序列。以突变后的α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2核苷酸序列为模板进行PCR扩增。
使用EcoRI 和 NotI两种限制性内切酶将扩增后得到的α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2核苷酸突变序列与pPIC9k载体同时进行双酶切反应，并通过T4连接酶将酶切后的基因序列和载体连接，获得重组载体α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2-1。
使用SalI限制性内切酶对重组载体进行线性化，然后将线性化的重组载体电转化到活化的毕赤酵母中，从而糖苷酶基因即可整合到毕赤酵母的基因组中，得到产酶宿主细胞。
将所述宿主细胞接入BMMG培养基中30 ℃培养12 h，然后将富集的菌体洗净接入BMMY培养基中30 ℃培养，每隔24 h添加1%甲醇诱导产酶。培养5天后，将发酵液液过滤，并使用镍柱纯化得到纯化的重组α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2二重突变体蛋白（A49D/F101E）。
实施例3
α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2三重突变体（A49D/T186E/S389N）的表达以及纯化
通过定点突变将序列SEQ ID NO. 1中的氨基酸残基Ala49, Thr186和Ser398分别突变为Asp49，Glu186和Asn398，突变后的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 6 所示。合成序列表中SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4，其中引物序列SEQ ID NO. 3的5' 端设有EcoRI酶切位点及其保护碱基序列，引物序列SEQ ID NO. 4的3' 端设有NotI酶切位点及其保护碱基序列。以突变后的α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2核苷酸序列为模板进行PCR扩增。
使用EcoRI 和 NotI两种限制性内切酶将扩增后得到的α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2核苷酸突变序列与pPIC9k载体同时进行双酶切反应，并通过T4连接酶将酶切后的基因序列和载体连接，获得重组载体α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2-2。
使用SalI限制性内切酶对重组载体进行线性化，然后将线性化的重组载体电转化到活化的毕赤酵母中，从而糖苷酶基因即可整合到毕赤酵母的基因组中，得到产酶宿主细胞。
将所述宿主细胞接入BMMG培养基中30 ℃培养12 h，然后将富集的菌体洗净接入BMMY培养基中30 ℃培养，每隔24 h添加1%甲醇诱导产酶。培养5天后，将发酵液液过滤，并使用镍柱纯化得到纯化的重组α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2三重突变体蛋白（A49D/T186E/S389N）。
实施例4
α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2在转化朝藿定C制备阿可拉定中的应用，本实施例使用实施例1中制备的α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2。
配置底物浓度为10 mg/mL的朝藿定C溶液1 mL，向溶液中同时加入20 μLα-L-鼠李糖苷酶（0.3mg/mL）和20 μL葡萄糖苷酶（0.5mg/mL），在45 ℃、pH为4.5条件下反应3 h；反应结束后液相检测并计算转化率，结果显示底物的转化率达到99%，几乎完全转化为阿可拉定。
实施例5
α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2在转化朝藿定C制备阿可拉定中的应用，本实施例使用实施例1中制备的α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2。
配置底物浓度为50 mg/mL的朝藿定C溶液1 mL，向溶液中同时加入100 μLα-L-鼠李糖苷酶（0.3mg/mL）和100 μL葡萄糖苷酶（0.5mg/mL），在45 ℃、pH为4.5条件下反应3 h；反应结束后液相检测并计算转化率，结果显示底物的转化率达到99%，几乎完全转化为阿可拉定。
实施例6
α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2在转化朝藿定C制备阿可拉定中的应用，本实施例使用实施例1中制备的α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2。
配置底物浓度为10 mg/mL的朝藿定C溶液1 mL，向溶液中同时加入20 μLα-L-鼠李糖苷酶（0.3mg/mL）和20 μL葡萄糖苷酶（0.5mg/mL），在50 ℃、pH为4.5条件下反应4 h；反应结束后液相检测并计算转化率，结果显示底物的转化率达到99%，几乎完全转化为阿可拉定。
实施例7
α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2在转化朝藿定C制备阿可拉定中的应用，本实施例使用实施例1中制备的α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2。,
配置底物浓度为10 mg/mL的朝藿定C溶液1 mL，向溶液中同时加入20 μLα-L-鼠李糖苷酶（0.3mg/mL）和20 μL葡萄糖苷酶（0.5mg/mL），在50 ℃、pH为5.0条件下反应5 h；反应结束后液相检测并计算转化率，结果显示底物的转化率达到99%，几乎完全转化为阿可拉定。
实施例8
α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2二重突变体（A49D/F101E）在转化朝藿定C制备阿可拉定中的应用，本实施例使用实施例2制备的α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2二重突变体。
配置底物浓度为10 mg/mL的朝藿定C溶液1 mL，向溶液中同时加入20 μLα-L-鼠李糖苷酶二重突变体（A49D/F101E）（0.3mg/mL）和20 μL葡萄糖苷酶（0.5mg/mL），在45 ℃、pH为4.5条件下反应2 h；反应结束后液相检测并计算转化率，结果显示底物的转化率达到99%，几乎完全转化为阿可拉定。
实施例9
α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2三重突变体（A49D/T186E/S389N）在转化朝藿定C制备阿可拉定中的应用，本实施例使用实施例3制备的α-L-鼠李糖苷酶CHD-R2三重突变体。
配置底物浓度为10 mg/mL的朝藿定C溶液1 mL，向溶液中同时加入20 μLα-L-鼠李糖苷酶三重突变体（A49D/T186E/S389N）（0.3mg/mL）和20 μL葡萄糖苷酶（0.5mg/mL），在45℃、pH为4.5条件下反应2 h；反应结束后液相检测并计算转化率，结果显示底物的转化率达到99%，几乎完全转化为阿可拉定。
上述参照具体实施方式是对α-L-鼠李糖苷酶及其应用所进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例；因此，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修饰，在不脱离本发明总体构思下的变化和修改同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种α-L-鼠李糖苷酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-L-鼠李糖苷酶。
2.一种多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求1所述的α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列，多核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的多核苷酸的序列。
4.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求3所述的重组载体或者基因组中整合有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，所述的宿主细胞非动物或植物品种。
5.权利要求1所述的α-L-鼠李糖苷酶的应用，其特征在于：应用于水解朝藿定C外侧和内侧鼠李糖苷键、芦丁鼠李糖苷键、柚皮苷鼠李糖苷键、杨梅苷鼠李糖苷键以及新橙皮苷鼠李糖苷键。
6.权利要求1所述的α-L-鼠李糖苷酶在转化朝藿定C制备阿可拉定中的应用。
CN202110019051.9A 2021-01-07 2021-01-07 一种α-L-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用 Active CN113584002B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110019051.9A CN113584002B (zh) 2021-01-07 2021-01-07 一种α-L-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110019051.9A CN113584002B (zh) 2021-01-07 2021-01-07 一种α-L-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113584002A CN113584002A (zh) 2021-11-02
CN113584002B true CN113584002B (zh) 2024-05-28

Family

ID=78238000

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110019051.9A Active CN113584002B (zh) 2021-01-07 2021-01-07 一种α-L-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113584002B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116334041B (zh) * 2023-02-17 2023-12-05 深圳希吉亚生物技术有限公司 一种鼠李糖苷酶突变体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2802128A1 (en) * 2010-06-29 2012-01-05 Margot Elisabeth Francoise Schooneveld-Bergmans Polypeptide having beta-glucosidase activity and uses thereof
CN103080306A (zh) * 2010-08-20 2013-05-01 科德克希思公司 糖苷水解酶61家族蛋白在纤维素加工中的用途
CN104531733A (zh) * 2014-12-29 2015-04-22 集美大学 一种α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表达及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2802128A1 (en) * 2010-06-29 2012-01-05 Margot Elisabeth Francoise Schooneveld-Bergmans Polypeptide having beta-glucosidase activity and uses thereof
CN103080306A (zh) * 2010-08-20 2013-05-01 科德克希思公司 糖苷水解酶61家族蛋白在纤维素加工中的用途
CN104531733A (zh) * 2014-12-29 2015-04-22 集美大学 一种α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表达及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113584002A (zh) 2021-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101492661B (zh) 一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及用于龙胆低聚糖的制备
CN112210548A (zh) 一种表达α-L-鼠李糖苷酶的毕赤酵母及其制备方法和应用
CN112899177B (zh) 表达黑芥子酶tgg4的重组解脂耶氏酵母菌及其应用
CN108384769B (zh) 一种耐高温复合酶及其应用
CN113584002B (zh) 一种α-L-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用
CN114107255A (zh) 一种竹节参皂苷糖苷水解酶及其在生产姜状三七皂苷r1中的应用
CN114107341B (zh) 真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在生产淫羊藿苷中的应用
CN113684198B (zh) 一种提高纤维素酶催化效率的方法及突变体5i77-m2
CN113584001B (zh) 一种alpha-L-鼠李糖苷酶、其制备方法及应用
Zhu et al. Enzymic synthesis of gastrodin through microbial transformation and purification of gastrodin biosynthesis enzyme
CN106754851B (zh) TaGPI1mS543A蛋白及其编码基因和应用
CN109402080B (zh) 蛋白质ugt142及其编码基因与应用
CN113584000B (zh) 一种α-L-鼠李糖苷酶、其制备方法和应用
CN113736762A (zh) 一种α-L-鼠李糖苷酶突变体及其在制备普鲁宁中的应用
CN106554951A (zh) 重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母cbs4857外切菊粉酶及编码基因与表达和应用
CN105907737B (zh) 一种高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体及其编码基因和应用
CN108588062A (zh) 一种获得海藻糖合成酶突变体的方法及其应用
CN116286567B (zh) 一株产α-氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠埃希氏菌及其构建方法和应用
CN116004582A (zh) 一种水解东莨菪苷的重组β-葡萄糖苷酶的制备方法和应用
CN109929769B (zh) 一种利用fld1启动子调控黏玉米谷氨酰胺转氨酶表达的重组毕赤酵母菌株及构建方法
CN113308424B (zh) 一种产阿魏酸酯酶的短小芽孢杆菌及其应用
CN115011582B (zh) 一种β-葡萄糖苷酶突变体A354P及其应用
CN110791513B (zh) 一种密码子优化的玉足海参α-淀粉酶基因及其重组表达载体与应用
CN117887692A (zh) β-葡萄糖苷酶突变体、核酸、基因工程菌及其应用
CN116836958A (zh) 一种重组蛋白及其编码基因和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant