CN116004582A

CN116004582A - 一种水解东莨菪苷的重组β-葡萄糖苷酶的制备方法和应用

Info

Publication number: CN116004582A
Application number: CN202210449200.XA
Authority: CN
Inventors: 李利君; 于坤朋; 倪辉; 彭程; 林燕玲; 杨远帆; 姜泽东; 李清彪
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2022-04-24
Filing date: 2022-04-24
Publication date: 2023-04-25

Abstract

本发明提供了一种水解东莨菪苷的重组β‑葡萄糖苷酶的制备方法和应用，该方法包括：通过对黑曲霉来源的β‑葡萄糖苷酶的基因组中的β‑葡萄糖苷酶进行系统进化分析；以PUC‑57‑An‑bgl3‑Amp质粒为模板，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列为引物进行PCR扩增，再将扩增产物与pPIC9K质粒连接，转化至毕赤酵母SMD1168中，获得重组菌株，重组菌株诱导表达，即获得重组β‑葡萄糖苷酶。由此可制备专一性转化东莨菪素的重组β‑葡萄糖苷酶，可用于酶法处理植物组织及其初提取物，专一性转化东莨菪苷为东莨菪素，从而增加东莨菪素的提取得率及纯度。

Description

一种水解东莨菪苷的重组β-葡萄糖苷酶的制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水解东莨菪苷的重组β-葡萄糖苷酶的制备方法和应用。

背景技术

东莨菪素(Scopoletin)又称东莨菪内酯、莨菪亭，属香豆素类化合物，化学名为6-甲氧基-7-羟基香豆素；在自然界分布广泛，存在于丁公藤茎、拟南芥全株、天竺葵等植物中。东莨菪素不仅具有抗肿瘤、抗炎及镇痛、降血压血脂、保肝、增强记忆和解痉等药理活性；还具有杀虫、杀螨、抑菌等农用生物活性。

由于人工合成东莨菪素的成本高、制备条件难以控制，目前制备东莨菪素的方法主要是从植物中萃取。研究表明，自然界中东莨菪苷和东莨菪素大多共存于同一植物体中，且东莨菪苷的含量普遍大于东莨菪素的含量，多次分离纯化导致提取回收率低、成本高，且环境污染大。例如从药物丁公藤中提取东莨菪素过程中，其提取物中含有大量的其他物质，会影响东莨菪素的提取率。

相关技术中也有用酶法将东莨菪苷转化为东莨菪素，但由于目前转化东莨菪苷的酶具有广谱的底物特异性，在将植物组织中的东莨菪苷转化的同时，也会转化其他糖苷，产生了大量的东莨菪素结构类似物，同样导致分离困难。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一，即制备专一性转化东莨菪素的重组β-葡萄糖苷酶，可用于酶法处理植物组织及其初提取物，专一性转化东莨菪苷为东莨菪素，从而增加东莨菪素的提取得率及纯度。

为此，在本发明的第一个方面中，本发明提出了一种水解东莨菪苷的重组β-葡萄糖苷酶的制备方法，其包括以下步骤：

(1)利用NCBI数据库从genebank中搜索，得到16条黑曲霉CBS513.88来源β-葡萄糖苷酶序列，对其进化树分析，并以东莨菪苷为底物进行分子对接，筛选出核苷酸序列如 SEQID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的β-葡萄糖苷酶An-bgl3；

(2)以PUC-57-An-bgl3-Amp质粒为模板，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列为引物进行PCR扩增，再将扩增产物与pPIC9K质粒连接，转化至毕赤酵母SMD1168中，获得重组菌株，重组菌株诱导表达，即获得重组β-葡萄糖苷酶。

根据本发明的实施例的水解东莨菪苷的重组β-葡萄糖苷酶的制备方法，该方法通过对黑曲霉来源的β-葡萄糖苷酶的基因组中的β-葡萄糖苷酶进行系统进化分析，以东莨菪苷为底物进行分子对接，筛选对东莨菪苷具有良好的底物特异性的β-葡萄糖苷酶，进一步通过毕赤酵母SMD1168异源表达以制备高效、专一将植物提取物中东莨菪苷水解转化为东莨菪素，提高东莨菪素的得率及纯度的重组β-葡萄糖苷酶。

在本发明的第二方面中，提供了一种上述制备方法制得的重组β-葡萄糖苷酶。该重组β- 葡萄糖苷酶An-bgl3具有底物专一性，可以专一的将东莨菪苷转化为东莨菪素，增加样品中东莨菪素的含量并且不会与其它底物发生反应，使得东莨菪素的进一步制备中达到提高其提取率的目的。

在本发明的第三个方面中，提供了上述重组β-葡萄糖苷酶在水解东莨菪苷生成东莨菪素中的用途。

可选地，水解东莨菪苷的方法为：向东莨菪苷溶液中加入β-葡萄糖苷酶An-bgl3，于温度55℃、pH 4.0下，反应20min，即得东莨菪素。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为根据本发明实施例的β-葡萄糖苷酶An-bgl3的系统进化树图；

图2为根据本发明实施例的PUC-57-An-bgl3-Amp质粒图谱；

图3为根据本发明实施例的β-葡萄糖苷酶An-bgl3的纯化后的SDS-PAGE；

图4为根据本发明实施例的β-葡萄糖苷酶An-bgl3的纯化后的质谱鉴定图；

图5为根据本发明实施例的β-葡萄糖苷酶An-bgl3最适温度曲线图；

图6为根据本发明实施例的β-葡萄糖苷酶An-bgl3最适pH曲线图；

图7为根据本发明实施例的β-葡萄糖苷酶An-bgl3水解粗样品的液相分析图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5′至3′的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。

下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。

实施例1β-葡萄糖苷酶An-bgl3的制备

利用NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库，从genebank中搜索，得到16条黑曲霉CBS513.88来源β-葡萄糖苷酶序列，利用MEGA X构建系统进化树，分析结果将序列分为三个聚类，基于分层抽样原理从中抽取三条序列作为代表性序列，以东莨菪苷为底物进行分子对接，利用Autodock进行分子对接，采用结合自由能小于-1.2 kcal/mol为指标从基因组中筛选，分析表明XP_001398259.2(An-bgl3)与东莨菪苷存在合理的相互作用，推测其可特异性水解东莨菪苷，如图1所示。黑曲霉Aspergillusniger CBS 513.88来源的重组β-葡萄糖苷酶An-bgl3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示(2968bp)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示(781个氨基酸残基)。

利用SignalP 4.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)在线软件分析β- 葡萄糖苷酶(An-bgl3)基因序列，获得信号肽位置，并在后续构建重组质粒时去除信号肽。D NAMAN软件对基因序列进行分析，选择合适的酶切位点AvrⅡ和NotI，设计引物(An-bgl 3-F：CCGGAATTCGTGCAGAATGCCTCCAGACC SEQ ID NO：3；An-bgl3-R：ATTTGCGGCCGCAACAACCCAAAACGCCG SEQ ID NO：4)，划线部分为酶切位点。引物和 DNA测序均由铂尚生物技术(上海)有限公司完成。

以PUC-57-An-bgl3-Amp质粒(图2)为模板(委托金唯智生物科技(苏州)有限公司合成)，在PrimeSTAR HS DNA Polymerase的作用下，以An-bgl3-F和An-bgl3-R为引物进行PCR扩增，扩增程序为：95℃，4min；94℃，1min；55℃，1min；72℃，2 min 30s，进行30次循环；72℃，10min；4℃，保存。反应结束后采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，参照DNA纯化回收试剂盒说明书纯化回收PCR产物。PCR扩增产物和pPIC9K质粒分别经AvrⅡ和NotI酶切回收后，通过T₄ DNA连接酶连接(连接反应体系为：目的基因：x、载体：y(x与y的浓度为2：1)、1μL的T4 DNA连接酶(350U/μL)、2.5μL的10×T4 DNA连接酶缓冲液、无菌水补足至终体积为20μL，16℃条件下，酶反应16h。)，转化至E.coli strain DH5α感受态细胞中，菌液PCR筛选阳性克隆子后进行测序。将测序正确的重组质粒命名为pPIC9K-An-bgl3。参照质粒小提试剂盒提取重组质粒pPIC9K-An-bgl3，备用。

将验证正确的pPIC9K-An-bgl3的阳性克隆子提取质粒并使用Sal I将所提取的质粒线性化，采用电击转化法转化至毕赤酵母SMD1168中，涂于MD平板中30℃培养直至长出单菌落。从MD平板上挑取单菌落，转接于含G418(终浓度为2.5mg/mL)抗性的YPD平板上，在恒温培养箱中30℃条件下倒置培养至有单菌落生长。挑取单菌落，转接于10mL 的YPD液体培养基中，在30℃、180rpm条件下过夜培养18h，将活化菌液进行阳性鉴定。将鉴定成功后的菌种进行发酵。

将菌种以1％接种量接种于50mL YPD液体培养基中进行菌种活化，30℃振荡培养16 h；再以1％的接种量将活化菌种接种至100mL的BMGY培养基，30℃，200rpm/min，培养16h后，测量确定其OD₆₀₀达到3.0-5.0范围内；离心10min收集所有菌体，弃上清，将菌体全部转接至100mL BMMY培养基，30℃，培养7d，培养期间每隔24h则向培养基中加入0.5％无水甲醇；培养结束，离心收集上清，即为酶液。

β-葡萄糖苷酶An-bgl3的粗酶液，经Phenyl疏水柱、Q Sepharose HP阴离子交换柱、 Superdex 200Increase 10/300GL凝胶过滤柱(操作条件：Phenyl疏水柱：通过Plus蛋白纯化系统将过滤后的酶液以2M(NH₄)₂SO₄缓冲液为流动相上样，上样流速为1 mL/min、上样完成后以2mL/min流速洗杂，使用10mM pH 8.0的柠檬酸钠缓冲液以2 mL/min流速洗脱目的蛋白，收集相应洗脱成分放入4℃中；Q Sepharose HP阴离子交换柱：将透析完成的酶液通过Plus蛋白纯化系统以20mM pH6.5的磷酸盐缓冲液为流动相上样，上样流速为1mL/min、上样完成后以2mL/min流速使用1M NaCl-10mM磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集相应洗脱成分放入4℃中。Superdex 200Increase 10/300GL凝胶过滤柱：将浓缩后的酶液通过Plus蛋白纯化系统以超纯水为缓冲液为流动相上样，上样流速为1mL/min，上样完成以后使用20mM pH 6.5的柠檬酸钠缓冲液以2mL/min流速洗脱目的蛋白，收集相应洗脱成分放入4℃中。)进行纯化，通过SDS-PAGE 检验，如图3所示，β-葡萄糖苷酶An-bgl3为均一条带，大小约为120kDa。

从SDS-PAGE切出相应的条带，并进行胰蛋白酶水解的产物进行MS分析。通过 LC-MS/MS(ExactivenanoLC-Q)(A液为0.1％甲酸的水溶液，B液为0.1％甲酸的乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的A液平衡后,样品由自动进样器上样至Trap柱。0.5H梯度)鉴定分离的重组β-葡萄糖苷酶，如图4。再通过MASCOT等质谱匹配软件对LCMSMS数据进行分析获得目标蛋白质多肽分子的定性鉴定信息，该重组蛋白鉴定为 Beta-glucosidase(Aspergillus niger)，UniProt数据库登录号为A0A117E2F4。

实施例2β-葡萄糖苷酶An-bgl3的底物特异性

分别测定重组β-葡萄糖苷酶An-bgl3(实施例1获得的)与2mmol/L的不同的底物(对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、对硝基苯基-N-乙酰基-β-D- 吡喃葡萄糖苷、对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷、栀子苷、水杨苷、虎杖苷、七叶苷和东莨菪苷)在55℃反应20min后的酶活力来研究该酶的底物特异性。测定结果显示如表1， An-bgl3仅对香豆素类底物有转化作用且对东莨菪苷转化能力更强。

表1

实施例3β-葡萄糖苷酶An-bgl3最适温度及pH

酶活的测定：600μL的pH 4.0的2mmol/L的东莨菪苷溶液与100μL的重组β-葡萄糖苷酶An-bgl3酶液在55℃条件下反应20min后，于沸水浴10min终止反应，冷却至室温经微孔过滤后反应液通过HPLC检测东莨菪苷的含量。

在pH 5.0条件下，参照酶活的测定方法通过测定重组β-葡萄糖苷酶An-bgl3在40～75℃温度范围内(每隔5℃)的酶活力来探究该酶的最适温度。结果如图5所示，重组β-葡萄糖苷酶An-bgl3的最适温度为55℃。

用50mmol/L的不同pH(pH 3.0～6.0)的柠檬酸缓冲液与(pH 6.0～8.0)磷酸盐缓冲液配制2mmol/L的东莨菪苷底物溶液。参照酶活的测定方法测定重组β-葡萄糖苷酶An-bgl3与上述不同pH值的底物反应时的酶活力来探究该酶的最适pH。结果如图6所示，重组β-葡萄糖苷酶An-bgl3的最适pH为4.0。

实施例4β-葡萄糖苷酶对于粗提物中东莨菪素提取的影响研究

在含有东莨菪苷和东莨菪素的丁公藤粗提物中用重组β-葡萄糖苷酶An-bgl3进行水解实验，其中，丁公藤粗提物浓度0.002mol/L，重组β-葡萄糖苷酶An-bgl3的浓度为41μg/mL，反应温度55℃，反应pH为4.0，反应时间20min，研究An-bgl3酶对于东莨菪苷提取的影响。结果如图7所示，其中：a为东莨菪苷，b为东莨菪素。加入An-bgl3酶液处理后，该酶将东莨菪苷水解成为了东莨菪素且东莨菪素的含量增加了47.8％，结果如图7。丁公藤粗提物中除东莨菪苷被该酶水解成为了东莨菪素外其它物质成分没有受到影响发生改变，说明An-bgl3酶只水解了东莨菪苷，增加了东莨菪素的含量且对于东莨菪苷有较高的水解效果。为东莨菪素的后期进一步提取中，起到了增加东莨菪素得率的效果。

综上，根据本发明的实施例，通过系统进化树分析基于其聚类情况筛选得到一株β-葡萄糖苷酶An-bgl3，该酶可以专一性水解东莨菪苷制备东莨菪素。在进行东莨菪素的提取中，可使用该酶先使东莨菪苷水解为东莨菪素，增加东莨菪素的含量然后进行后续提取(例如进一步采用乙醇浸提、萃取、结晶、正反向色谱层析等方法得到东莨菪素纯品)，从而达到提高东莨菪素得率目的。该方法可增加东莨菪素的提取得率，具有成本低廉，条件温和，环境友好，节约成本等优点，具有广阔的应用前景，为东莨菪素的工业化制备提供了重要的工具酶。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 集美大学

<120> 一种水解东莨菪苷的重组β-葡萄糖苷酶的制备方法和应用

<130> 无

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2020

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggtggccg gtcttgtcgc aaaggcgctt ttgctccttc agcttgggtc tggggtcgtg 60

gctgcacaga atgcctccag acctctttac aagaatcccc atgcgcctgt ggaggcgcga 120

gtctctgatc ttctcagtcg gatgactatc gaagataaga tgtctcaatt gatgcagggt 180

gcgtatttcc ttttccacgt gtagaaacac ggtcgtgaat acaaatcaat gtttcgctcg 240

attccaatcg cattcattgc agaggcttat gctgggtggt ataggagacg tcggtaactg 300

gatggacagc acaactgggg ctttcaacta cacaggcttg gtggagaaca tggagatgaa 360

ggctggtgca ttctacggta tgaatttact ctgaatattt gctgccagac aactaacatt 420

agtagttgga tatgctgttc cctgggactg gcttgcgacc aatatcaaga gagcccaaga 480

ctacctgctg cagaatacga cgcttgggat tcctgctctt gttcagactg agggtacgtc 540

agtctccata cccagctgga tatctatgct aacccgtggc tgctctttac aggtattcat 600

ggtttcctgc tcgagaacgc cacgatctac aactccccga tagcatacgc ctgttctttc 660

aatagagaag tatgtttgcc tgctgtctgc tatctatgac tgagacttac tccctactat 720

agttggttga gaaaatggga cgactcattg cgcaagaggc ccgtgctatt ggtaccacac 780

aactgtttgc gccgctggct gatctggctc gtgaactccg atatggtcgg gtaaggactg 840

caatatctca agcgatgatg gactggctaa tgatcatcga ttacaggttg aggagacgtt 900

ctcagaggat tcttatcttg ccggcgaaat ggcctatcat tatatcgtag gcctgcagag 960

tctcaacgtg tctgctactg tcaagcactt tgtgggctat agtttgcctg aacagggtct 1020

gaacactgcg cctgtccaag gaggagagag atatctgcgc tcaacgtacg tgtgcattct 1080

ccatataagt agacgaaaat ctaacacggt ctaggtggct gccatccttc aaaagggcca 1140

ttgtggatgc tggggcatgg agtattatga gcgcatacca cgcgtaagct gctacattca 1200

acgaccttcc ttcggctatc aactcactag ttctagatac gacggtatcc ctgcggtggc 1260

cgactggttt accctcacga agatccttag acaagaatgg aactacgatt actatgtgat 1320

cagtgactcc ggtgccacgg atagactgtg cacagccttc aagctctgca gaagctctcc 1380

catcgacatg gaggctgtga ctacccaggc attgcctgcg ggcaacgatg tcgagatggg 1440

cggcggttca ttgtgagtac aacaattact ggagtaaaca atacagctaa caggtcatag 1500

caactaccag aaaatccccg agctcgtcga atcaagccag ctggatatcg aggttgtcaa 1560

caccgccgtc tctagagtgc tcagagccaa gttcgagatg ggtctctttg agaaccccta 1620

ccctgctgct ccccaatccg aatggaacaa gctgatccac agcccggagg cagtcgagct 1680

cgcgagaacc attgacaagg aatccatcgt cctgctagag aaccacaacg agacacttcc 1740

cttgaagaag agcggtaaca tcgccgttat cgggcccatg gcgcacgggt tcatgaacgt 1800

gagaccccta atacctcctg ttgccacgag cgaatgcaca aatgcctagc atcatgctaa 1860

caacatcagt acggcgacta cgtgatctac ggcagccaat ggcgcggcgt cactcccctc 1920

gatggcatca aagccgccgt cggcgacgcc gctaccgtta actacgcgca aggctgcgaa 1980

cgctggagca acgaccagtc gggcttcgac gaagccatcg 2020

<210> 2

<211> 781

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Val Ala Gly Leu Val Ala Lys Ala Leu Leu Leu Leu Gln Leu Gly

1 5 10 15

Ser Gly Val Val Ala Ala Gln Asn Ala Ser Arg Pro Leu Tyr Lys Asn

20 25 30

Pro His Ala Pro Val Glu Ala Arg Val Ser Asp Leu Leu Ser Arg Met

35 40 45

Thr Ile Glu Asp Lys Met Ser Gln Leu Met Gln Gly Asp Val Gly Asn

50 55 60

Trp Met Asp Ser Thr Thr Gly Ala Phe Asn Tyr Thr Gly Leu Val Glu

65 70 75 80

Asn Met Glu Met Lys Ala Gly Ala Phe Tyr Val Gly Tyr Ala Val Pro

85 90 95

Trp Asp Trp Leu Ala Thr Asn Ile Lys Arg Ala Gln Asp Tyr Leu Leu

100 105 110

Gln Asn Thr Thr Leu Gly Ile Pro Ala Leu Val Gln Thr Glu Gly Ile

115 120 125

His Gly Phe Leu Leu Glu Asn Ala Thr Ile Tyr Asn Ser Pro Ile Ala

130 135 140

Tyr Ala Cys Ser Phe Asn Arg Glu Leu Val Glu Lys Met Gly Arg Leu

145 150 155 160

Ile Ala Gln Glu Ala Arg Ala Ile Gly Thr Thr Gln Leu Phe Ala Pro

165 170 175

Leu Ala Asp Leu Ala Arg Glu Leu Arg Tyr Gly Arg Val Glu Glu Thr

180 185 190

Phe Ser Glu Asp Ser Tyr Leu Ala Gly Glu Met Ala Tyr His Tyr Ile

195 200 205

Val Gly Leu Gln Ser Leu Asn Val Ser Ala Thr Val Lys His Phe Val

210 215 220

Gly Tyr Ser Leu Pro Glu Gln Gly Leu Asn Thr Ala Pro Val Gln Gly

225 230 235 240

Gly Glu Arg Tyr Leu Arg Ser Thr Trp Leu Pro Ser Phe Lys Arg Ala

245 250 255

Ile Val Asp Ala Gly Ala Trp Ser Ile Met Ser Ala Tyr His Ala Tyr

260 265 270

Asp Gly Ile Pro Ala Val Ala Asp Trp Phe Thr Leu Thr Lys Ile Leu

275 280 285

Arg Gln Glu Trp Asn Tyr Asp Tyr Tyr Val Ile Ser Asp Ser Gly Ala

290 295 300

Thr Asp Arg Leu Cys Thr Ala Phe Lys Leu Cys Arg Ser Ser Pro Ile

305 310 315 320

Asp Met Glu Ala Val Thr Thr Gln Ala Leu Pro Ala Gly Asn Asp Val

325 330 335

Glu Met Gly Gly Gly Ser Phe Asn Tyr Gln Lys Ile Pro Glu Leu Val

340 345 350

Glu Ser Ser Gln Leu Asp Ile Glu Val Val Asn Thr Ala Val Ser Arg

355 360 365

Val Leu Arg Ala Lys Phe Glu Met Gly Leu Phe Glu Asn Pro Tyr Pro

370 375 380

Ala Ala Pro Gln Ser Glu Trp Asn Lys Leu Ile His Ser Pro Glu Ala

385 390 395 400

Val Glu Leu Ala Arg Thr Ile Asp Lys Glu Ser Ile Val Leu Leu Glu

405 410 415

Asn His Asn Glu Thr Leu Pro Leu Lys Lys Ser Gly Asn Ile Ala Val

420 425 430

Ile Gly Pro Met Ala His Gly Phe Met Asn Tyr Gly Asp Tyr Val Ile

435 440 445

Tyr Gly Ser Gln Trp Arg Gly Val Thr Pro Leu Asp Gly Ile Lys Ala

450 455 460

Ala Val Gly Asp Ala Ala Thr Val Asn Tyr Ala Gln Gly Cys Glu Arg

465 470 475 480

Trp Ser Asn Asp Gln Ser Gly Phe Asp Glu Ala Ile Ala Ala Ala Lys

485 490 495

Lys Ser Asp Val Ala Ile Val Val Val Gly Thr Trp Ser Arg Asp Gln

500 505 510

Thr Glu Leu Trp Glu Asn Tyr Asn Ala Thr Thr Gly Glu His Val Asp

515 520 525

Leu Asp Ser Leu Ala Leu Val Gly Ala Gln Gly Pro Leu Ile Gln Ala

530 535 540

Ile Arg Asp Thr Gly Val Pro Thr Ile Val Val Leu Ser Ser Gly Lys

545 550 555 560

Pro Ile Thr Asp Val Thr Trp Ile Ala Asn Ser Thr Ser Ala Leu Val

565 570 575

Gln Gln Phe Tyr Pro Ser Glu Gln Gly Gly Asn Ala Leu Ala Asp Val

580 585 590

Leu Phe Gly Asp Tyr Asn Pro Ser Gly Lys Leu Ser Val Ser Phe Pro

595 600 605

His Tyr Val Gly Asp Leu Pro Ile Tyr Tyr Asp Tyr Leu Asn Ser Ala

610 615 620

Arg Asn Ile Gly Asp Ala Gly Arg Ala Tyr Pro Asn Gly Thr Leu Glu

625 630 635 640

Phe Gly His Gln Tyr Val Leu Gly Asp Pro His Ala Val Tyr Pro Phe

645 650 655

Gly Tyr Gly Lys Ser Tyr Ser Thr Phe Glu Tyr Ser Asp Ile Lys Val

660 665 670

Ser Lys Thr Asn Val Ser Ala Ser Asp Thr Val Thr Val Gly Leu Glu

675 680 685

Val Lys Asn Leu Asp Glu Ser Arg Glu Ala Thr Glu Val Val Gln Val

690 695 700

Tyr Val Val Asp Glu Ile Ala Ser Val Val Val Pro Asn Arg Leu Leu

705 710 715 720

Lys Gly Phe Glu Lys Val Val Ile Pro Ala Gly Gly Ser Lys Ser Val

725 730 735

Ser Ile Asp Ile Lys Val Glu Asp Leu Gly Leu Trp Asn Asn Lys Met

740 745 750

Glu Tyr Val Val Glu Lys Gly Glu Phe Gly Val Leu Val Gly Ser Ser

755 760 765

Ser Val Asp Ile Arg Gly Arg Val Ala Phe Trp Val Val

770 775 780

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccggaattcg tgcagaatgc ctccagacc 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atttgcggcc gcaacaaccc aaaacgccg 29

Claims

1.一种水解东莨菪苷的重组β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用NCBI数据库从genebank中搜索，得到16条黑曲霉CBS513.88来源β-葡萄糖苷酶序列，对其进化树分析，并以东莨菪苷为底物进行分子对接，筛选出核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的β-葡萄糖苷酶An-bgl3；

2.如权利要求1所述的水解东莨菪苷的重组β-葡萄糖苷酶的制备方法制得的重组β-葡萄糖苷酶。

3.如权利要求2所述的重组β-葡萄糖苷酶的用途，其特征在于，用于水解东莨菪苷生成东莨菪素。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，水解东莨菪苷的方法为：向东莨菪苷溶液中加入β-葡萄糖苷酶An-bgl3，于温度55℃、pH 4.0下，反应20min，即得东莨菪素。