CN114854701B - 一种微泡菌超氧化物歧化酶及其编码基因 - Google Patents

一种微泡菌超氧化物歧化酶及其编码基因 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种微泡菌超氧化物歧化酶SOD及其编码基因。所述超氧化物歧化酶SOD具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其编码基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。生产所述超氧化物歧化酶SOD的方法包括以下步骤：在适合于所述超氧化物歧化酶SOD生产的条件下，对携带有上述能表达超氧化物歧化酶SOD的培养物进行发酵，收获表达产物，得到超氧化物歧化酶SOD。本发明所获得的超氧化物歧化酶具有良好的酶学性质，可以应用于制备饲料添加剂、食品添加剂。

Description

一种微泡菌超氧化物歧化酶及其编码基因
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种微泡菌(Microbulbifersp.)超氧化物歧化酶SOD及其编码基因。
背景技术
超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，简称SOD，EC 1.15.1.1)是一类广泛存在于生物体内,催化超氧阴离子自由基(O2-)发生歧化反应的一类金属酶。1938年Mann和Keilin首次从牛红细胞中分离出一种蓝色的含铜蛋白质(Hemocuprein)，1969年McCord及Fridovich发现该蛋白有催化O2-，发生歧化反应的功能，故将此酶命名为超氧化物歧化酶。
机体物质和能量代谢会产生一些有毒的副产物，例如超氧离子自由基(O2-)，。机体内O2-形成分为生理性和病理性两方面。正常生理过程的O2-主要来源于呼吸链中电子传递过程。多种疾病的发病过程中也会产生大量O2-。生物体内过量的O2-存在能够直接或间接地引起生物分子的氧化破坏,诱发脂质过氧化,降低膜脂质流动性,是导致许多疾病产生的主要原因。机体存在应对超氧离子自由基的一套机制，主要包括超氧化物歧化酶SOD，它可以将O2-歧化为H2O2和O2，而过氧化氢酶等可催化过氧化氢分解，最终清除超氧离子自由基。SOD专一性清除超氧离子自由基，催化反应：2H++O2-→H2O2+O2。国内外研究表明，SOD对多种因O2-诱发的有关疾病具有良好的疗效,并且是一种很有希望的抗衰老剂。
按照SOD中金属辅基的不同，大致可将其分为以下三类：第一类是CuZnSOD，主要存在于真核细胞的细胞质中。第二类是含有Fe-、Mn-或者二者都有的Fe/Mn SOD，FeSOD主要存在于原核细胞和真核细胞的基质中，MnSOD主要存在于原核细胞体，真核细胞的细胞浆和线粒体内。第三类是NiSOD，主要是在土壤链霉菌和藻青菌中发现的。
SOD几乎存在于所有的生物中，不同种SOD在生物中以及生物的组织亚细胞定位不同。很多革兰氏阴性致病菌中存在细胞质Cu/ZnSOD。目前在原生生物中未发现Cu/ZnSOD。酵母中存在细胞质和线粒体Cu/ZnSOD。植物中的Cu/ZnSOD主要位于细胞质和叶绿体中，在过氧化物酶体中也有分布。动物细胞中的Cu/ZnSOD位于胞质中。在血吸虫中，还发现了胞外Cu/ZnSOD。另外胞质Cu/ZnSOD也出现在细胞核，线粒体间隙和过氧化物酶体中。MnSOD和FeSOD非常相似，通常认为起源于相同的祖先。需氧和厌氧细菌及需氧和兼性厌氧的古核生物中均存在FeSOD。甚至在严格厌氧的产甲烷菌中也发现了FeSOD。原生动物内变形虫、锥体虫、疟原虫和帕金虫中也发现有FeSOD。需氧细菌中存在MnSOD并且它的表达量在氧气存在的情况下发生上调。蓝细菌中包含一种独特的膜结合MnSOD。一些古生菌中包含Mn/FeSOD，即结合任意一种金属离子均有活性，但是在需氧的条件下大多结合Mn而在厌氧的条件下则结合Fe。在眼虫属的原生动物中发现了与类囊体膜紧密结合的MnSOD。许多真菌中也有MnSOD的存在。植物中的MnSOD位于线粒体中和过氧化物酶体中。通常情况下动物中的MnSOD位于线粒体中。Youn等在链霉菌中首次发现了NiSOD。Schmidt和Eitinger也分别在放线菌和蓝细菌中发现了与NiSOD高度相似的基因。但是，在革兰氏阳性细菌、古生菌和真核生物中还没有发现NiSOD。
Cu/ZnSOD是相对分子质量在32kDa左右的同源二聚体，每个单体是由八股反平行的β折叠形成的β桶结构。Cu和Zn离子通过两个环结合在β桶的外侧。金属的结合位点在该酶中是保守的。牛红细胞中Cu2+与44、46、61和118位的组氨酸相连，Zn2+与61、69、78位的组氨酸和81位的天冬氨酸相连。Cu、Zn之间通过61位组氨酸形成“咪唑桥”结构。Cu2+与酶的活性直接相关，而Zn2+则与酶的稳定性有关。组成FeSOD和MnSOD的每个单体的分子质量约为20kDa，大多数原核生物的FeSOD和MnSOD是同源二聚体，而植物等真核生物的FeSOD和MnSOD是同源四聚体。每个单体包含由α螺旋组成的N末端结构域以及由α螺旋和三个β折叠组成C末端结构域。金属结合位点就在这两个结构域之间。每个单体含一个Fe离子或Mn离子，它与三个组氨酸，一个天冬氨酸及一个H2O或羟基配体配位。NiSOD是由四个α螺旋组成的同源四聚体，相对分子质量约为80kDa。每个α螺旋在N-末端结合一个Ni离子。此位置包含His-Cys-X-X-Pro-Cys-Gly-X-Tyr模体结构。该模体结构不仅对金属的结合至关重要，而且在酶的催化作用中发挥重要作用。因此，它也是判断NiSOD的标志。
SOD作为生物体内一种重要的氧自由基清除剂，能够平衡机体内的超氧阴离子自由基，从而避免机体内自由基浓度过高时引起的不良反应，在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，受到国内外学者和研究者的广泛关注，其研究领域已涉及到化学、生物学、医学、食品科学和畜牧兽医学等多个学科。SOD在食品工业主要应用四方面：1)作为保健食品的功效因子或食品营养强化剂，添加到各种食品中；2)制成多种剂型的SOD或复合型食品；3)用作食品的天然抗氧化剂；4)以富含SOD的原料加工制成保健食品。此外，SOD添加于化妆品中可起到防晒，防止脂褐素的形成，防治皮肤病以及防治瘢痕形成等作用。
SOD的生产方式主要有以下四种:①利用动物血液提取法；②从植物中提取；③选用高产菌株进行微生物发酵法生产；④基因工程法获得。目前市场上的SOD产品大部分是从动物血液中提取的。由于原材料有限、纯化困难等原因，导致SOD的纯度低、产量少，特别是随着世界各地疯牛病、禽流感、口蹄疫以及由动物传播的SARS等恶性传染病不时报道，生产动物源血液制品的风险加大，此外，对产品纯度要求的增高也增加了生产成本。天然微生物和植物来源的SOD也因其种类少、表达量低、酶分子量大、与动物及人体内SOD的同源性低，从而也难以得到广泛的应用。因此，寻找优质的动物来源的SOD外源基因，对其进行合理的改造，构建廉价、高效的表达系统，是突破传统制备方法的有效途径之一。
本发明从海洋细菌Microbulbifersp.stain BN3(微泡菌)中克隆获得一个新的超氧化物歧化酶基因，实现了其在毕氏酵母菌株中的高水平表达；该重组超氧化物歧化酶具有广泛的温度适用范围和pH适用范围，及良好的温度耐受性、pH耐受性和蛋白酶抗性，其在饲料和食品等领域的有很好的应用价值。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种新的超氧化物歧化酶SOD及其编码基因，并实现其高效重组表达，从而解决现有技术的不足之处，实现超氧化物歧化酶的产业化生产及应用推广。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案，并获得了良好的技术效果。
一种来源于微泡菌(Microbulbifersp.)BN3的超氧化物歧化酶SOD，所述超氧化物歧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述超氧化物歧化酶SOD具有如下特性：
①发酵产品水平可达到28500U/mL，比活力为2300U/mg；
②最适pH为6.0-7.5，其中最高点为7.0；
③最适反应温度为20-40℃，其中最高点为30℃；
④在60-80℃下分别处理5min后，均仍能保持80％以上的残余酶活力；
⑤在pH3.0-9.0下处理60min，均仍能保持85％以上的残余酶活力；
⑥胰蛋白酶或胃蛋白酶分别处理2hr后，仍有90％以上的残余酶活力。
一种重组表达载体，所述重组载体携带上述的超氧化物歧化酶SOD的编码基因。
一种重组基因工程菌株，所述重组基因工程菌株包含上述的重组表达载体。
进一步的，上述的重组基因工程菌株以毕氏酵母细胞GS115为宿主细胞。
上述一种超氧化物歧化酶SOD的编码基因的制备方法，包括以下步骤：培养微泡菌(Microbulbifersp.)BN3，提取基因组DNA，进行全基因组分析；设计特异性引物，以微泡菌(Microbulbifer sp.)BN3基因组DNA为模板进行PCR扩增，从而获得超氧化物歧化酶SOD的编码基因。
上述一种重组载体的制备方法，包括以下步骤：将上述超氧化物歧化酶SOD的编码基因经EcoR I和Not I双酶切后，与同样经过EcoR I和Not I双酶切的pPIC9k载体连接，从而得到酵母重组表达载体SOD/pPIC9k。
上述一种重组基因工程菌株的制备方法，包括以下步骤：将上述的重组载体经过电转化转入毕氏酵母细胞GS115宿主细胞，然后经过平板筛选获得含有重组载体的阳性转化子，由此获得超氧化物歧化酶毕赤酵母重组细胞SOD/pPIC9k/GS115。
上述一种重组超氧化物歧化酶的制备方法，包括以下步骤：培养上述的重组基因工程菌株，诱导超氧化物歧化酶基因的表达，收获表达产物。
上述一种超氧化物歧化酶SOD可应用于制备饲料添加剂和食品添加剂。
本发明的有益效果如下：
本发明获得一种新的超氧化物歧化酶SOD及其编码基因，并实现了其在毕氏酵母菌株中的高效重组表达，并通过酶学性质检验对该重组超氧化物歧化酶的最适作用温度、最适作用pH值、pH稳定性、热稳定性及比活力进行分析，证明本发明的超氧化物歧化酶具有很好的pH稳定性、良好的热稳定性以及抗蛋白酶水解能力，能够很好的满足和适应饲料和食品行业对该产品的应用要求。
附图说明
图1：Microbulbifer sp.stain BN3超氧化物歧化酶基因电泳图；泳道M为Marker，泳道1为克隆的超氧化物歧化酶基因。
图2：重组毕氏酵母超氧化物歧化酶发酵液电泳图；泳道M为Maker，泳道1为重组SOD。
图3：重组毕氏酵母超氧化物歧化酶发酵液电泳图；泳道1-6分别为重组毕氏酵母超氧化物歧化酶不同发酵时间(第3-8天)的取样。
图4：重组超氧化物歧化酶最适反应温度分析。
图5：重组超氧化物歧化酶温度耐受性分析。
图6：重组超氧化物歧化酶最适反应pH分析。
图7：重组超氧化物歧化酶pH耐受性分析。
图8：重组超氧化物歧化酶蛋白酶抗性分析。
图9：重组超氧化物歧化酶对黄羽肉鸡肠道绒毛结构和形态的影响。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
以下实施例中所用到的实验材料及实验方法如下：
1.菌株和载体
大肠杆菌JM109、DH5α及表达载体pET28a(+)均购自安诺伦(北京)生物科技有限公司；毕氏酵母(Pichiapastoris)GS115及表达载体pPIC9k均购自美国英杰生命技术有限公司。
2.酶类及其他生化试剂：
PTM1：30mM硫酸铜，0.54mM碘化钠，17.6mM硫酸锰，0.80mM钼酸钠，0.32mM硼酸，2.4mM氯化钴，0.18mM氯化锌，0.24mM硫酸亚铁，1.6mM生物素，0.19M硫酸。
限制性内切酶EcoR I和Not I、DNAMaker、Protein Maker、T4连接酶、Primescriptdouble strand cDNA synthesis kit均购自宝日医生物技术(大连)有限公司；pfu DNA合成酶购自富酶泰斯生物技术(深圳)有限公司；Ezup Column Bacteria Genomic DNAPurification Kit、SanPreP Column Plasmid Mini-Preps Kit、SanPreP Column DNA GelExtraction Kit、胶回收试剂盒和PCR产物回收试剂盒均购自生物工程(上海)股份有限公司；RNA抽提试剂盒RNeasy Mini Kit(cat.nos.74104)购自凯杰企业管理(上海)有限公司；琼胶购自美国英杰生命技术有限公司。
其他常规试剂均为国产或进口。
3.培养基：
发酵基本培养基：26.2ml/L磷酸，0.80g/L硫酸钙，18.7g/L硫酸钾，15.5g/L硫酸镁，4.17g/L氢氧化钾，40g/L葡萄糖。
除发酵基本培养基，以下实施例中使用的其他培养基均参照美国英杰生命技术有限公司毕氏酵母操作手册进行配制。
4.实验方法：
本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行，包括：[美]J.莎姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用(第二版)；朱检等，生物化学实验[M]。
本发明中所有相关的酶活、酶活力、酶活性均是指超氧化物歧化酶活性，均采用《G/BT 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定》中的第一种方法。
实施例1Microbulbifer sp.stain BN3基因组DNA的提取
Microbulbifer sp.stain BN3由福州大学生物科学与工程学院叶秀云实验室提供，该菌株是从台湾海峡采集的沿海土壤样品中回收的琼脂降解菌分离出来的。根据与NCBI数据库的16srRNA比对结果，该菌株BN3归类为微溃疡菌属。
取1.5mL Microbulbifer sp.stain BN3菌体培养物(28℃培养15-20h，至菌浓OD600nm达到0.7以上)于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min，丢去上清液，收集菌体。用EzupColumn Bacteria Genomic DNA Purification Kit按照其操作步骤提取基因组DNA，然后置于4℃保存备用。
实施例2Microbulbifer sp.stain BN3超氧化物歧化酶基因的克隆对Microbulbifer sp.stain BN3菌株进行全基因组分析，设计上、下游引物SOD F和SOD R。上、下游引物分别含有EcoRI和NotI酶切位点，由上海生工合成，引物序列如下：
SOD F：5’-cgcacgaattcGAGACCGTGGTCAGTGTATTGAAGC-3’(小写部分为为引入EcoRI
的酶切位点及改变引物的GC含量和退火温度所补充的碱基)；
SOD R：5’-acgaccgcggccgcCTACTGAATAACACCGCAGG-3’(小写部分为为引入Not I的酶切位点及改变引物的退火温度所补充的碱基)。
以实施例1中所获得的Microbulbifer sp.stain BN3基因组DNA为模板，用pfuDNA合成酶及引物SOD F和SOD R进行PCR扩增。PCR反应条件为：95℃3min；95℃20sec，55℃30sec，72℃1min15sec，30个循环；72℃6min10sec。PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(见图1)，并用胶回收试剂盒回收目标产物条带。然后用限制性内切酶EcoR I和Not I进行分步酶切，酶切产物用PCR回收试剂盒回收后，用T4连接酶与经过相同酶切的质粒pPIC9k片段连接，16℃连接过夜后，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，LB平板筛选得到阳性菌落(以Amp为抗性，浓度为100ug/ml)SOD/pPIC9k/DH5α。用质粒提取试剂盒从阳性菌落的培养物中提取质粒，送上海英骏生物技术有限公司进行测序。由此获得超氧化物歧化酶SOD的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例3超氧化物歧化酶毕氏酵母重组工程菌株的构建
将实施例2所制备的SOD/pPIC9k/DH5α接种到LB液体培养基中，37℃过夜培养，然后用质粒抽提试剂盒提取获得质粒SOD/pPIC9k，用限制性内切酶Bgl II酶切，胶回收纯化大片段，即得到酵母转化所需含突变基因的线性DNA，然后用电转化法将其转化至毕赤酵母菌株GS115，经筛选(以G418为抗性，浓度为100ug/mL)和鉴定获得重组毕赤酵母菌株SOD/pPIC9k/GS115阳性克隆子。
实施例4毕氏酵母发酵制备重组超氧化物歧化酶
取实施例3所构建的重组毕氏酵母菌株SOD/pPIC9k/GS115阳性克隆子，接种于150mlYPD培养液中，30℃、250rpm振荡培养至OD600nm＝0.3～0.5(约20hr)，然后接种于3L发酵基本培养基(26.2ml/L磷酸，0.80g/L硫酸钙，18.7g/L硫酸钾，15.5g/L硫酸镁，4.17g/L氢氧化钾，40g/L葡萄糖)中，于5L发酵罐中进行发酵。
在起始菌体生长阶段，发酵过程中用25％的氨水调节pH，使其维持在6.5-6.6，并且以4.0ml/hr的速度流加PTM1(30mM硫酸铜、0.54mM碘化钠、17.6mM硫酸锰、0.80mM钼酸钠、0.32mM硼酸、2.4mM氯化钴、0.18mM氯化锌、0.24mM硫酸亚铁、1.6mM生物素、0.19M硫酸)，进行连续流加补料。搅拌并通气培养20-24hr，在菌体生长过程中溶氧逐渐下降至低于100％，直至碳源耗尽，溶氧又逐渐上升至高于80％，此时菌湿重可达到90-95g/L。
进入碳源饲喂阶段，以25ml/hr的速度流加用蒸馏水配置的含有25％(w/v)葡萄糖和12ml/L PTM1的溶液，持续流加4-6hr，并调节通气量，使溶氧维持在20％上下，到该阶段的末期，菌湿重可达到165-175g/L。
进入诱导阶段，以10-15ml/hr的速度流加含有12ml/L PTM1的甲醇，使培养基中甲醇的终浓度最高不要超过0.3％(v/v)，并调节通气量搅拌转速，使溶氧维持在20％上下。发酵到达185hr时，菌湿重可达到295-320g/L，重组超氧化物歧化酶的表达水平(以发酵液上清的酶活力表示)可达到28500U/mL，比活力可达到2300U/mg，这说明Microbulbifersp.BN3来源的超氧化物歧化酶基因在毕氏酵母中得到了高效表达。
收集重组超氧化物歧化酶上清液进行SDS-PAGE分析，结果如图2所示。
在发酵过程中不同时间取样，对发酵样品进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示。
实施例5重组超氧化物歧化酶的酶学性质表征
将实施例4所制备的重组超氧化物歧化酶在磷酸氢二钠-柠檬酸(pH7.0，50mM)缓冲体系及不同温度下(20℃-80℃)进行酶促反应，以测定最适反应温度。结果表明，重组超氧化物歧化酶的最适反应温度为20-40℃(图4)。在不同温度下(30℃-80℃)处理酶5min后测定残余酶活性，以进行热稳定性研究。结果表明，在60-80℃范围内处理5min后，重组超氧化物歧化酶的残余酶活力均能维持在80％以上(图5)，这说明该重组超氧化物歧化酶有广泛的温度适用范围和很好的耐热性。
将实施例4所制备的重组超氧化物歧化酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液的pH范围为3.0-8.0(50mM Na2HPO4-C6H8O7缓冲液)。超氧化物歧化酶在不同的pH的缓冲液中、30℃下测定酶活性。结果表明，超氧化物歧化酶的最适pH为7.0(见图6)。将超氧化物歧化酶发酵液用不同pH值的缓冲液(pH3.0-9.0)稀释5倍后置于室温下处理60min，然后再用pH7.0的缓冲液稀释适当倍数后测定残余酶活性以研究超氧化物歧化酶的pH稳定性。结果表明，在pH3.0-9.0下处理60min，重组超氧化物歧化酶均能保持85％以上的残余酶活力(见图7)。这说明该超氧化物歧化酶具有很广泛的pH适用范围和很好的pH稳定性。
在实施例4所制备的重组超氧化物歧化酶溶液中加入0.05ml胰蛋白酶(0.1mg/ml，用pH7.0 PBS缓冲液配置)或胃蛋白酶(0.1mg/ml，用pH2.0甘氨酸-HCL缓冲液配置)，于37℃处理120min，用pH7.0的缓冲液做适当稀释后再测定超氧化物歧化酶活性。结果表明，经胰蛋白酶或胃蛋白酶分别处理2hr后，重组超氧化物歧化酶的残余酶活力均在90％以上(图8)，说明该超氧化物歧化酶具有较好的抗蛋白酶水解能力。
实施例6重组超氧化物歧化酶对肉鸡增益效果测试肉鸡品种：新矮脚黄鸡，试验周期：2个月，此次试验不分阶段，全程添加。试验分为2组，1个对照组(正常日粮)，1个试验组(正常日粮+加超氧化物歧化酶(1800U/kg饲料))，每组800只鸡，共计1600只鸡。
饲养结束后，测定每组肉鸡的最终总重量和总数量，计算平均增重(表1)；采血样，测定血清生化指标(表2-表4)；进行解剖，测定免疫器官及相关指标和肠道结构(表5-表6，图9)。
以上结果表明，重组超氧化物歧化酶能够显著提升肉鸡血清中总蛋白、白蛋白和球蛋白含量，显著提高血清对多种自由基的抑制或清除能力，从而促进和加快肉鸡的健康生长；能显著提高血清中的溶菌酶活力与IgA、IgG和IgM的含量，改善机体免疫力；能够在一定程度上促进小肠发育，增加小肠的相对重量和相对长度，能显著的增加小肠的肠绒毛高度、隐窝深度、粘膜层厚度和V/C值，从而提高肠道对营养物质的吸收，促进动物生长。
表1重组SOD对黄羽肉鸡生长性能的影响
组别 平均单重(g) 增重(g)
对照组 1240.6 /
试验组 1257.8 17.20
表2对血清蛋白质合成代谢的影响
表3对血清抗氧化能力的影响
表4对血清免疫能力的影响
表5对消化器官重量的影响
表6对小肠结构形态的影响
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种超氧化物歧化酶SOD，其特征在于：所述超氧化物歧化酶SOD来源于微泡菌（Microbulbifer sp.）BN3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体携带权利要求1中所述的超氧化物歧化酶SOD的编码基因。
3.一种重组基因工程菌株，其特征在于：所述重组基因工程菌株包含如权利要求2所述的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的一种重组基因工程菌株，其特征在于：所述重组基因工程菌株以毕赤酵母GS115为宿主细胞。
5.一种重组超氧化物歧化酶SOD的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：培养如权利要求4所述的重组基因工程菌株，诱导超氧化物歧化酶基因的表达，收获表达产物。
6.如权利要求1所述的超氧化物歧化酶SOD在制备食品或饲料添加剂中的应用。
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