CN106554951A - 重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母cbs4857外切菊粉酶及编码基因与表达和应用 - Google Patents

重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母cbs4857外切菊粉酶及编码基因与表达和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106554951A
CN106554951A CN201510631920.8A CN201510631920A CN106554951A CN 106554951 A CN106554951 A CN 106554951A CN 201510631920 A CN201510631920 A CN 201510631920A CN 106554951 A CN106554951 A CN 106554951A
Authority
CN
China
Prior art keywords
spore
cbs4857
chickpea
kluyveromyces
exoinulinases
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510631920.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106554951B (zh
Inventor
尹恒
马君燕
曹海龙
谭海东
王文霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Original Assignee
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Institute of Chemical Physics of CAS filed Critical Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority to CN201510631920.8A priority Critical patent/CN106554951B/zh
Publication of CN106554951A publication Critical patent/CN106554951A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106554951B publication Critical patent/CN106554951B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01007—Inulinase (3.2.1.7)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶。本发明还提供了一种制备该重组外切菊粉酶的高效分泌表达方法，属于基因工程领域。该方法主要包括以下步骤：根据Swiss-Model建模结果，确定外源分离纯化标签引入鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的位置，即在远离该外切菊粉酶催化活性中心的N端引入编码6个组氨酸的分离纯化标签序列，将重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA，并将重组质粒经电转化法整合到毕赤酵母宿主菌X-33中，即可获得能高效分泌表达便于分离纯化、高活性的可降解菊粉产生高纯度果糖浆的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶。本发明制备的外切菊粉酶可广泛应用于食品、药品、生物能源等领域。

Description

重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶及编码基因与表达和应用
技术领域
本发明提供了一种携带6个组氨酸分离纯化标签的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶及其表达方法和应用。用该方法制备的上清中重组外切菊粉酶达到0.357mg/ml，酶活力高达2496U/ml，比活为6992U/mg，能高效降解菊粉产生高纯度的果糖浆，且便于分离纯化，可通过Ni-NTA SepharoseTMexcel column一步法进行纯化，纯化后的酶活力达19875U/ml，比活为10841U/mg，回收率为80％，SDS-PAGE检测酶的纯度达到100％。本发明制备的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶具有潜在的工业应用价值，可广泛应用于食品、药品、生物质转化等领域。
背景技术
菊粉(inulin)是由D-呋喃果糖分子通过β-2,1-糖苷键相连而成的链状多糖，其末端与一分子葡萄糖残基相连。菊粉是继淀粉之后，植物中第二大储藏性多糖，广泛存在于菊芋(Jerusalem artichoke)、菊苣(Chicory)和大丽花(dahlia)等植物的根和块茎中(Kango N et al,Food Biotechnology,2011,25(3):165-212；He M et al,J Ind Microbiol Biotechnol,2014,41:105-114)。由于菊粉来源于非粮作物，近年来，菊粉作为生产果糖浆、果寡糖、生物乙醇、2,3-丁二醇及其它化学品的生物质原料受到广泛关注(Li Y et al,Biores Technol,2013,147:254–259；Wang GY et al,Biores Technol,2012,124:77–82)。开发利用菊粉，是生物炼制研究领域中一个重要的研究方向。
菊粉酶(inulinase)是一类能水解β-2,1-D果聚糖的水解酶，广泛存在于微生物和植物中，尤其是丝状真菌和酵母菌。菊粉酶能直接水解菊粉生产高纯度果糖浆、低聚果糖和燃料酒精，是果聚糖生物炼制中的关键一环，在食品、医药、生物能源方面具有十分重要的生产价值。根据水解菊粉的方式，菊粉酶可以分为外切菊粉酶(EC 3.2.1.80)和内切菊粉酶(EC 3.2.1.7)(Liu G L etal,Appl Microbiol Biotechnol,2014,98(21):9129-9138；李益民等，生物工程学报，2015，31(5)：670-681)。外切菊粉酶可以从菊粉分子的非还原末端催化水解下果糖残基产生果糖浆(Gao J et al,Applied biochemistry andbiotechnology,2014,173:1419-1430)。果糖广泛用于食品、医药和燃料乙醇等行业中。酶法生产果糖，相对于酸法制备果糖(80-100℃，pH＝1.0-2.0)，具有工艺简单、转化率高、产物纯、含量高等优点，是生产果糖最有前途的一条途径(Singh P et al,Food Technol.Biotechnol,2006,44,151–162)。产菊粉酶的微生物主要包括细菌、真菌和酵母菌，其中，酵母菌产菊粉酶的能力比真菌和细菌强，尤其是克鲁维酵母(Chi Z M et al,Appl MicrobiolBiotechnol,2009,82:211–220)。然而，自然界中分离产菊粉酶的菌株即耗时又耗力，且存在发酵周期长、产量不高、活性低等难题，难以满足大规模工业化生产的需求，即使产酶能力强的酵母菌，如来自龙舌兰汁的两株Kluyveromyces marxianus A1和A2所产菊粉酶的活性也仅为171U/mL(Cruz-Guerrero A E et al,World Journal of Microbiology andBiotechnology,2006,22(2):115-117)。采用优化培养基成分及培养条件、氯化锂-紫外线复合诱变、高密度发酵等方法，虽然在一定程度上提高了野生菌株产菊粉酶活性，如P.guilliermondii strain1的突变株M-30菊粉酶活力由原来48.1U/mL达到127.7U/mL(Gong F et al,J Ind Microbiolo Biotechnol,2007,34:179-185；Yu X j et al,Biochemical Engineering Journal,2009,43:266-271)，仍满足不了工业化需求。利用基因工程技术重组菊粉酶基因是解决天然菌株筛选所遇问题的有效措施。目前，许多不同微生物来源的外切菊粉酶基因利用基因重组方法进行了异源表达(Cao T S et al,Gene,2013,516:255-262；Kuzuwa S et al,Gene,2012,495:154-162；Gao J et al,Appliedbiochemistry and biotechnology,2014,173,1419-1430；Treichel H etal,Global Journal of Biochemistry,2012,3:1-13)，取得了一定的进展，将P.guilliermondiijiang strain1菌株的菊粉酶基因在毕赤酵母X-33中重组表达后，外切菊粉酶活力达到286.8±5.4U/mL(Zhang T et al,ProcessBiochemistry,2009,44:1335-1339)，总体而言，重组菊粉酶的活性低于600U/ml。目前为止，只有张素芳等将马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)CBS6556外切菊粉酶基因在毕赤酵母重组表达后，获得了活性高的重组外切菊粉酶(专利号CN 101469325B)，但重组的外切菊粉酶序列不携带分离纯化标签，只能通过超滤进行初步纯化，难以获得高纯度的酶，限制了其在食品、医药行业的应用，也不利于后期酶学性质研究。如何实现携带分离纯化标签序列且高效表达具有高活性的重组外切菊粉酶，成为本专利所要解决的问题。
经过分析发现，以往利用酵母系统进行外切菊粉酶重组表达时，携带的分离纯化标签一般在酶蛋白的C末端，而C端具有和底物结合的作用(M etal,J.Biol.Chem.2012,287:19674-19686)，引入分离纯化标签后可能会影响酶分子与底物的结合，进而对重组酶的活性产生影响；或引入分离纯化标签的同时添加了非酶蛋白自身的额外的氨基酸残基(Cao T Set al,Gene,2013,516:255-262；Zhang LH et al,Process Biochemistry,2003,38:1209-1212)，可能会对重组的外切菊粉酶的活性产生影响。
为此，我们采用Swiss-Model构建目的蛋白三维模型的方法，确定外源分离纯化标签引入鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的位置，即在远离该外切菊粉酶催化活性中心的N端引入编码6个组氨酸的分离纯化标签序列，并且不添加额外的氨基酸残基，然后将重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA，并将重组质粒经电转化法整合到毕赤酵母宿主菌X-33中。本发明制备的外切菊粉酶具有潜在的工业应用价值，可广泛应用于食品、药品、生物能源等领域。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种携带6个组氨酸分离纯化标签的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母(Kluyveromyces cicerisporus)CBS4857外切菊粉酶。
本发明的另一个目的是提供一种制备该重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的高效分泌表达方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种携带6个组氨酸分离纯化标签的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的高效分泌表达方法，其主要步骤为：首先利用Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org)对鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶进行三维模型构建，确定外源分离纯化标签引入该外切菊粉酶的位置，即在远离鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶催化活性中心的N端引入编码6个组氨酸分离纯化标签序列，然后将重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA，并将重组质粒经电转化法整合到毕赤酵母宿主菌X-33中，甲醇诱导表达即可获得重组的鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶。
本发明所述的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的编码基因(不带信号肽序列)是SEQ ID No.2中第16位至第1629位的碱基所构成的核苷酸序列，由其编码产生的外切菊粉酶的氨基酸序列为SEQ ID No.1；所述的分离纯化标签为目的蛋白N端的6个组氨酸，同时引入了XhoI酶切位点和Kex信号肽切割位点，确保对目的蛋白的天然N端进行纯化标签设计，不引入纯化标签序列以外的额外氨基酸残基，同时确保重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶在分泌表达过程中被有效的切割；所述的表达载体为毕赤酵母/大肠穿梭质粒pPICZαA；所述宿主细胞为毕赤酵母X-33；所述的重组质粒电转入毕赤酵母宿主细胞前，需用SacI限制性内切酶进行线性化处理，与宿主细胞在AOX1基因处整合，利用载体pPICZαA的醇氧化酶强启动子(pAOX1)进行外源蛋白的高效分泌表达。
一种高效分泌表达的携带6个组氨酸分离纯化标签的重组质粒的构建过程为：以鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因组为模板，设计了N端携带6个组氨酸分离纯化标签的引物，N-INU1-F：5’-TCTCTCGAGAAAAGA GATGGTGACAGCAAGGCCAT-3’和N-INU1-R：5’-CTCGCGGCCGCTCAAAGGTTAAATTGGGTAACG-3’，其中下划线分别为XhoI、NotI酶切位点，斜线为Kex2蛋白酶切割位点，黑体代表6×his标签序列，然后进行聚合酶链式反应(PCR)扩增得到N-端携带6个组氨酸标签序列的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因(不带信号肽序列)，通过TA克隆连接到T载体，测序正确后，经XhoI和NotI双酶切亚克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA(购自Invitrogen公司)，得到重组表达质粒pPICZαA-N-kcINU1。
一种高效分泌表达的携带6个组氨酸分离纯化标签的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的制备过程为：SacI线性化重组表达质粒后，电转化至毕赤酵母宿主细胞X-33(购自Invitrogen公司)，电转化的具体参数为：2mm转化杯，2000V电压，200Ω电阻，25uF电容，Zeocin抗性筛选后，酵母菌落PCR进行验证，具体过程参照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册(pPICZαA,B,and C Pichia expression vectors for selection on ZeocinTM andpurification of recombinant proteins)，确保重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因已与宿主细胞在AOX1基因处整合，以载体pPICZαA醇氧化酶强启动子(pAOX1)进行高效表达。挑取阳性克隆子参照上述手册，在三角烧瓶中以0.5％甲醇进行诱导表达，96h后离心收集上清，以5％菊粉为底物，DNS法进行活性测定，上清中重组外切菊粉酶达0.357mg/ml，外切菊粉酶的活性达到2496U/ml，比活为6992U/mg，能高效降解菊粉产生高纯度的果糖浆，且便于分离纯化，可通过Ni-NTA SepharoseTM excel column一步法进行纯化，纯化后的酶活达19875U/ml，比活为10841U/mg，回收率为80％，SDS-PAGE检测酶的纯度达到100％。本发明制备的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶具有潜在的工业应用价值，可广泛应用于食品、药品、生物质转化等领域。
与现有技术相比，本发明的优势在于以下几点：
(1)和野生菌株生产菊粉酶相比，获得菊粉酶的发酵周期缩短，诱导24h即可检测到外切菊粉酶的活性，诱导96h发酵上清中的外切菊粉酶活性就可达到2496U/ml，比活为6992U/mg，上清中粗蛋白的表达量为0.357mg/ml。
(2)重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的N端携带6个组氨酸分离纯化标签，其优势在于，一是便于分离纯化，可通过Ni-NTA SepharoseTMexcel column一步法进行纯化，纯化后的酶活力达19875U/ml，比活为10841U/mg，回收率为80％，SDS-PAGE检测酶的纯度达到100％。重组蛋白携带6个组氨酸标签能够进行分离纯化的原理为：组氨酸可以与Ni-NTA SepharoseTM excelcolumn中的氯化镍或者硫酸镍结合，在蛋白上柱子后，带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里，其他的杂蛋白流出。Ni-NTA SepharoseTM excel column柱中的氯化镍或者硫酸镍也可以与咪唑结合，这时候再用咪唑洗脱，梯度洗脱，咪唑竞争性结合到氯化镍或硫酸镍上，目的蛋白被洗脱下来，收集洗脱液，里面就是纯化的目的蛋白。二是若重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的C端直接携带6个组氨酸分离纯化标签，不能起到分离纯化标签的作用，分析原因可能是重组外切菊粉酶C端携带的6个组氨酸被包裹在酶分子内部，无法与Ni-NTA SepharoseTM excel column中的氯化镍或者硫酸镍结合。
附图说明
图1鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的3D结构模式图。模板为酿酒酵母蔗糖酶(Saccharomyces cevevisiae，PDB序列号4EQV)。鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的N端在酶分子外部，远离催化活性中心，C端被包裹在酶分子内部。D30、E215分别为鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的催化活性中心。
图2重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因PCR产物电泳图。产物大小为1643bp。M：DL 5,000DNA分子量标准；1：携带6个组氨酸标签的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因的PCR产物。
图3重组质粒pPICZαA-N-kcINU1构建模式图。
图4重组质粒pPICZαA-N-kcINU1双酶切鉴定结果电泳图。M：DL 5,000DNA分子量标准；1：pPICZαA-N-kcINU1的XhoI和NotI酶切鉴定结果，有两条带，一条为质粒pPICZαA，大小为3.5kb，一条为重组的鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶，大小为1.6kb。
图5重组质粒pPICZαA-N-kcINU1转化毕赤酵母X-33的酵母菌落PCR电泳图。
M：DL 5,000DNA分子量标准；1-8：重组质粒pPICZαA-N-kcINU1与毕赤酵母X-33基因组整合后的菌落PCR条带，条带大小约为2.2kb；9：空载pPICZαA与毕赤酵母X-33基因组整合后的菌落PCR条带，条带大小为540bp。
图6重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的诱导表达时间蛋白电泳图。泳道1：24h，泳道2：48h，泳道3：72h，泳道4：96h，泳道M：蛋白marker。
图7重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的蛋白纯化电泳图。泳道1：重组工程菌的诱导表达上清条带；泳道2：纯化的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶；泳道M：蛋白marker。
图8重组工程菌在诱导培养基中的菌体生长曲线图。
图9重组工程菌上清中外切菊粉酶的时间活性测定图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进一步说明。
序列表
SEQ ID No.1
(1)序列长度：538个氨基酸
(2)序列类型：氨基酸序列；链型：单链；拓扑结构：线性
(3)序列来源：人工序列
(4)序列特征：1-6位为组氨酸标签，7-538位为成熟鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶；7-359位为糖苷水解酶家族32的N端结构域，367-538位为糖苷水解酶家族32的C端结构域，360-366位是连接N端结构域与C端结构域的Linker区；潜在的N-糖基化修饰位点(NXT/S)共6个：209位，274位，369位，377位，392位，406位。
HHHHHHDGDSKAITNTTFSLNRPSVHFTPSHGWMNDPNGLWYDAKEEDWHLYYQYNPAATIWGTPLYWGHAVSKDLTSWTDYGASLGPGSDDAGAFSGSMVIDYNNTSGFFNSSVDPRQRAVAVWTLSKGPSQAQHISYSLDGGYTFQHYSDNAVLDINSSNFRDPKVFWHEGENGEDGRWIMAVAESQVFSVLFYSSPNLKNWTLESNFTITVWTGTQYECPGLVKVPYDSVADSSNSSDSKPDSAWVLFVSINPGGPLGGSVTQYFVGDFNGTHFTPIDDQTRFLDMGKDYYALQTFFNTPNEKDVYGIAWASNWQYAQQAPTDPWRSSMSLVRQFTLKDFSTNPNSADVVLNSQPVLNYDALRKNGTTYSITNYTVTSENGKKIKLDNPSGSLEFHLEYVFNGSPDIKSNVFADLSLYFKGNNDDNEYLRLGYETNGGAFFLDRGHTKIPFVKENLFFNHQLAVTNPVSNYTTNVFDVYGVIDKNIIELYFDNGNVVSTNTFFFSTNNVIGEIDIKSPYDKAYTINSFNVTQFNL
SEQ ID No.2
(1)序列长度：1643个bp
(2)序列类型：DNA序列
(3)序列来源：人工序列
(4)序列特征：编码区为16-1629位，4-9位为XhoI酶切位点，10-15位为Kex2蛋白酶切割位点，16-33位为6个组氨酸基因，上游引物序列为1-53位，下游引物序列为1611-1643位，1633-1640位为NotI酶切位点。
TCTCTCGAGAAAAGACATCATCATCATCATCATGATGGTGACAGCAAGGCCATCACTAACACCACTTTCAGTTTGAACAGACCTTCTGTGCATTTCACTCCATCCCATGGTTGGATGAACGATCCAAATGGTTTGTGGTACGATGCCAAGGAAGAAGACTGGCATTTGTACTACCAGTACAACCCAGCAGCCACGATCTGGGGTACTCCATTGTACTGGGGTCACGCTGTTTCCAAGGATTTGACTTCTTGGACAGATTACGGTGCTTCTTTGGGCCCAGGTTCCGACGACGCTGGTGCGTTCAGTGGTAGTATGGTTATCGATTATAACAATACTTCTGGTTTCTTCAACAGCTCTGTGGACCCAAGACAAAGAGCAGTTGCAGTCTGGACCTTGTCTAAGGGCCCAAGCCAAGCCCAGCACATCAGTTACTCGTTGGACGGTGGTTACACCTTCCAACACTATTCCGACAACGCCGTGTTGGACATCAACAGCTCCAACTTCAGAGACCCTAAGGTGTTCTGGCACGAGGGCGAGAACGGCGAAGATGGTCGTTGGATCATGGCCGTTGCTGAATCGCAAGTGTTCTCTGTGTTGTTCTACTCTTCTCCAAACTTGAAAAACTGGACCTTGGAATCCAACTTCACCATCACGGTCTGGACTGGTACCCAATACGAATGCCCAGGTCTAGTTAAGGTTCCATACGACAGTGTTGCTGACTCTTCGAACTCCTCCGACTCCAAGCCAGACTCCGCATGGGTCTTGTTTGTCTCCATCAACCCTGGTGGTCCATTGGGTGGTTCCGTTACCCAATACTTTGTTGGTGACTTCAACGGTACTCACTTCACTCCAATCGACGACCAAACCAGATTCCTAGACATGGGTAAGGACTACTACGCACTACAAACTTTCTTCAACACTCCAAACGAGAAGGACGTCTACGGTATCGCATGGGCTTCTAACTGGCAATACGCCCAACAAGCCCCAACTGACCCATGGCGTTCATCTATGAGTTTGGTTAGACAATTCACATTGAAAGACTTCAGCACAAACCCTAACTCCGCCGATGTCGTCTTGAACAGTCAACCAGTCTTGAACTATGATGCTTTGAGAAAGAACGGTACCACTTACAGCATCACAAACTACACCGTCACCTCCGAAAACGGCAAGAAGATCAAGCTAGACAACCCATCCGGTTCTCTTGAATTCCATCTTGAATACGTGTTTAACGGCTCCCCAGATATCAAGAGCAACGTGTTCGCTGATCTTTCCTTGTACTTCAAGGGTAACAACGACGACAACGAATACTTGAGATTGGGTTACGAAACCAACGGTGGTGCCTTCTTCTTGGACCGTGGCCACACCAAGATTCCTTTCGTGAAGGAGAACTTGTTCTTCAACCACCAATTGGCAGTTACCAACCCAGTTTCCAACTACACCACAAACGTCTTCGACGTTTACGGTGTCATTGACAAGAACATCATCGAATTGTACTTCGACAACGGTAACGTCGTCTCCACCAACACTTTCTTCTTCTCTACCAACAACGTTATTGGTGAAATTGACATCAAGTCACCATACGACAAGGCTTACACCATTAACTCATTTAACGTTACCCAATTTAACCTTTGAGCGGCCGCGAG
实施例1鹰嘴豆孢克鲁维酵母外切菊粉酶3D模型构建
利用同源建模服务器Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org)，以酿酒酵母蔗糖酶(Saccharomyces cevevisiae，PDB序列号4EQV)为模板，对鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶进行三维结构构建，3D结构如图1。鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的N端由5-折叠β-螺旋片组成，C-端是β-三明治结构，中间由linker连接。从图1可以看出，鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的N末端游离在酶分子外部，并且远离催化活性中心(D30/E215)不会对酶的催化活性产生影响，而C末端序列被包裹在酶分子内部，如果在其末端直接引入6个组氨酸标签，则不能起到分离纯化标签的作用，且C端具有和底物结合的作用(álvaro-Benito M etal,J.Biol.Chem.2012,287:19674-19686)，引入分离纯化标签后可能会影响酶分子与底物的结合，进而对重组酶的活性产生影响。因此，我们在远离鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶酶催化活性中心的N端引入编码6个组氨酸分离纯化标签序列。
实施例2N末端携带6个组氨酸标签序列的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因克隆
以鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因组为模板，N末端携带6个组氨酸分离纯化标签的碱基序列，N-INU1-F:5’-TCTCTCGAGAAAAGA GATGGTGACAGCAAGGCCAT-3’和N-INU1-R:5’-CTCGCGGCCGCTCAAAGGTTAAATTGGGTAACG-3’为引物，其中下划线分别为XhoI、NotI酶切位点，斜线为Kex2蛋白酶切割位点，黑体代表6个组氨酸标签序列，以LATaq DNA聚合酶进行PCR反应，反应条件为：94℃预变性2min，然后94℃变性30sec-55℃退火30sec-72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸7min。1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(图2)，产物大小为1643bp。胶回收试剂盒(购自Axygen公司)纯化PCR产物。
实施例3重组质粒pPICZαA-N-kcINU1的构建
重组质粒pPICZαA-N-kcINU1的构建模式如图3，载体pPICZαA上的α-因子分泌信号序列基因与N末端携带6个组氨酸标签序列的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因(不带信号肽序列)直接相连，使用载体pPICZαA上的Kex2蛋白酶切割位点，切去分泌表达的鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶信号肽序列，得到成熟的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶。pPICZαA-N-kcINU1的具体构建过程如下。
将纯化的PCR产物与T载体pMD19-T进行TA连接，连接产物转化E.coliTop10，经蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定获得阳性克隆子，同时提取质粒送去北京六合华大基因科技股份有限公司测序。将测序正确的质粒和空载体pPICZαA(购自Invitrogen公司)分别用限制性内切酶Xho I和Not I进行双酶切，胶回收试剂盒纯化酶切产物，在T4DNA连接酶的作用下，将纯化的酶切产物进行连接，连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞后，涂布于含有25μg/ml博来霉素(Zeocin，Invitrogen公司)的LLB(酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉15g/L)固体培养基上，37℃培养12h，菌落PCR进行验证。挑取阳性单克隆接入含有25μg/ml Zeocin的液体LLB培养基中培养，提取质粒。将重组质粒分别用限制性内切酶Xho I和Not I进行酶切，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物(如图4)，得到条带大小正确的酶切产物，初步证明构建的重组质粒正确，然后将该重组质粒pPICZαA-N-kcINU1送去北京六合华大基因科技股份有限公司测序。结果表明，在pPICZαA的Xho I和Not I酶切位点之间插入了成熟鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因且N末端携带有6个组氨酸分离纯化标签，插入方向正确，进一步证明构建的重组质粒正确。
实施例4重组质粒电转化至毕赤酵母X-33
用SacI线性化重组质粒pPICZαA-N-kcINU1，参照GeneJET Gel Extractionand DNA Cleanup Micro Kit(法国Fermentas公司)的操作说明对单酶切产物进行柱式纯化，1％琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果，按照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册(pPICZαA,B,and C Pichia expression vectors forselection on ZeocinTM and purification of recombinant proteins)进行电转化和诱导表达。取5μl线性化的重组质粒电转化至毕赤酵母感受态细胞X-33(购自Invitrogen公司)，线性化的空载体pPICZαA作为对照同时进行电转化，电转化的条件为：2mm转化杯，2000V电压，200Ω电阻，25μF电容，在含有100μg/mL Zeocin的YPDS(山梨醇181.6g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L)抗性平板上，30℃培养3-4后长出单菌落，挑取了9个单菌落进行酵母菌落PCR，具体操作步骤见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册，引物为AOX-F：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’和AOX-R：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’，结果如图5所示，1-8号为重组质粒转化毕赤酵母X-33后的菌落PCR结果，产物大小约为2.2kb(1.6kb+540bp)，9号为空载体pPICZαA转化毕赤酵母X-33后的菌落PCR结果，产物大小为540bp，说明外切菊粉酶基因已整合到毕赤酵母X-33基因组中，位于α-信号因子基因的下游，以载体pPICZαA上的醇氧化酶强启动子(pAOX1)进行高效表达。
实施例5重组菌株的诱导表达与纯化
将阳性克隆单菌落接种至50ml BMGY(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB13.4g/L，10％甘油100ml，4×10-5％生物素，100.0mM pH 6.0的磷酸盐缓冲液100ml)培养基中，28℃，200rpm培养至OD600＝2-6，室温下1500rpm离心5min，收集菌体，用100ml BMMY(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB13.4g/L，4×10-5％生物素，100.0mM pH 6.0的磷酸盐缓冲液100ml，0.5％的甲醇)重悬菌体，28℃，180rpm进行诱导表达，每24h加入终浓度为0.5％的甲醇，同时取样5ml，进行菌体密度、菌体湿重的测定。诱导96h后，4℃，8000rpm离心20min收集上清，SDS-PAGE检测诱导表达效果，如图6所示，在SDS-PAGE电泳胶上呈现一条大约90kDa的蛋白条带，比预期蛋白分子量(60.6kDa)大，推测这与蛋白翻译后糖基化修饰有关。
按照GE Healthcare公司提供的纯化方法用Ni-NTA sepharoseTM excelcolumn对40ml上清进行纯化，获得4ml纯化蛋白。纯化过程为：25mlBinding缓冲液(50mM醋酸钠缓冲液，pH 7.4，300mM NaCl，10mM咪唑)预先冲洗柱子，50ml上清过Ni-NTA柱后，依次25ml用Binding缓冲液、25ml Wash缓冲液(50mM醋酸钠缓冲液，pH 7.4，300mM NaCl，20mM咪唑)洗脱杂蛋白，4ml Elution缓冲液(50mM醋酸钠缓冲液，pH 7.4，300mM NaCl，250mM咪唑)洗脱目的蛋白，SDS-PAGE检测纯化效果(如图7)。SDS电泳图上，约90kDa呈现一条很清晰的蛋白条带，其它位置未见蛋白条带，表明纯化的效果很好，凝胶成像软件检测电泳纯度为100％。BCA蛋白浓度试剂盒进行蛋白浓度的测定(购自碧云天公司)。
实施例6重组外切菊粉酶活性的测定
重组外切菊粉酶活性测定采用DNS法(3，5-二硝基水杨酸试剂)。
(1)DNS试剂的配制：
甲液—溶解6.9g结晶酚(上海华舜生物工程有限公司，产品编号0946)于15.2mL 10％NaOH中，用蒸馏水稀释至69mL，再加入6.9g NaHSO3。
乙液—称取255g酒石酸钾钠，加到300mL 10％NaOH中，再加入880mL 1％3，5-二硝基水杨酸溶液。
将甲液与乙液相混合即得黄色DNS试剂，贮于棕色试剂瓶中。在室温下，放置7-10天以后使用。半年内有效。
(2)pH4.6HAc-NaAc缓冲液的配置方法：
①2MNaAc母液：称取272.16g乙酸钠溶于适量蒸馏水中，定容至1000mL。
②2M HAc母液：称取120.10g乙酸溶于适量蒸馏水中，定容至1000mL。
③取24.5mL 2M NaAc溶液和25.5mL 2M HAc溶液混合，定容至1000mL，即得pH 4.6的0.1M HAc-NaAc缓冲液
(3)5％菊粉溶液的配制：
精密称取5.00g菊粉(伊利产品来自大连理工大学)于适量pH4.6HAc-NaAc缓冲液，定容至100mL容量瓶中。
(4)外切菊粉酶活性测定
取适量重组外切菊粉酶，用0.1MHAc-NaAc pH4.6缓冲液稀释(上清稀释100倍、纯化酶稀释1000倍)，取50μL稀释液加入450μl 5％菊粉溶液，混匀，55℃水浴反应10min(精确计时)，立即取出沸水浴灭活5min，从反应液中取出50μl，加入0.3ml DNS试剂和0.35ml水，混匀，沸水浴中反应10min(精确计时)，冷水冷却，定容至5ml，测OD540nm。对应果糖标准曲线计算得样品反应液中的含糖量A(mg)。
对照设置：重组外切菊粉酶稀释液，沸水浴灭活5min，取50μl加入450μl 5％菊粉溶液，混匀，55℃水浴反应10min(精确计时)，从反应液中取出50μl，加入0.3ml DNS试剂和0.35ml水，混匀，沸水浴中反应10min(精确计时)，冷水冷却，定容至5ml,测OD540nm。对应果糖标准曲线计算得样品反应液中的含糖量A(mg)作为对照，调零。
酶活单位(U)为每分钟水解产生1微摩尔果糖所需要的酶量。
酶活计算：每毫升发酵上清液中菊粉酶活性为
实施例7重组酵母菌生长曲线分析和表达上清外切菊粉酶活性测定
将每天取样的重组菌液1ml，12000g离心10min收集菌体沉淀，测菌体湿重，上清用来测定外切菊粉酶的活性和蛋白浓度(空载体pPICZαA重组菌的表达上清中蛋白浓度作为对照)，活性测定方法见实施例6，同时将每天收集的菌液稀释后用紫外分光光计在OD600nm处进行菌体密度的测定。根据结果绘制菌体湿重及菌体密度的生长曲线，如图8，同时绘制重组菌每天表达的上清外切菊粉酶的活性测定图，诱导96h后发酵上清中的粗蛋白含量为0.357mg/ml，重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的活性达2496U/ml，比活为6992U/mg，可经Ni-NTA SepharoseTM excel column一步法进行纯化，纯化后的酶活达19875U/ml，比活为10841U/mg，回收率为80％，SDS-PAGE检测酶的纯度达到100％。
实施例8重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的应用(外切菊粉酶降解菊粉制备果糖浆)
利用实施例5中纯化的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶，对菊粉进行了水解实验。取0.5ml纯化的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶(酶活达19875U/ml)与50ml 10％的菊粉溶液(pH4.6的0.1mol/LHAc-NaAc缓冲液配制)，55℃反应24h，降解率达到95％以上，表明所获得的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶可用于高果糖浆的制备。
实施例9C末端携带6个组氨酸标签序列的重组基因克隆、表达及纯化
通过PCR方法将6个组氨酸标签序列基因直接引入到鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的C端，引物序列为INU1-C-his-F:5’-TCTCTCGAGAAAAGAGATGGTGACAGCAAGGCCAT-3’和INU1-C-his-R:5’-CTCGCGGCCGCTCAAAGGTTAAATTGGGTAACG-3’，其中下划线分别为XhoI、NotI酶切位点，斜线为Kex2蛋白酶切割位点，黑体代表6个组氨酸标签序列。按照实施例2-6相同的方法，将重组基因kcINU1-C-his克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA，将重组质粒经电转化法整合到毕赤酵母宿主菌X-33中，甲醇诱导进行分泌表达，镍柱亲和层析法纯化目的蛋白，DNS法进行外切菊粉酶的活性测定。结果显示，重组外切菊粉酶无法从分泌的上清中纯化出来，C末端的6个组氨酸不能起到分离纯化标签序列的作用，分析原因可能是C末端序列的组氨酸标签被包裹在酶分子内部，无法与Ni-NTA SepharoseTM excel column结合。
通过PCR方法将linker(G4S)-His6-tag基因引入到鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的C端，引物序列为INU1-linker-C-his-F:5’-TCTCTCGAGAAAAGAGATGGTGACAGCAAGGCCAT-3’和INU1-linker-C-his-R:5’-CTCGCG GCCGCTCAAAGGTTAAATTGGGTAACG-3’，其中下划线分别为XhoI、NotI酶切位点和linker(G4S)基因，斜线为Kex2蛋白酶切割位点，黑体代表6个组氨酸标签序列。按照实施例2-6相同的方法，诱导96h后发酵上清中的粗蛋白含量为0.206mg/ml，C端连接linker(G4S)后携带6个组氨酸标签的重组外切菊粉酶的活性为963U/ml，比活为4685U/mg，表达量仅为N端携带6个组氨酸标签的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的58％，活性仅剩43％，比活为74％。虽然可以得到纯化的C端连接linker(G4S)后携带6个组氨酸标签的重组外切菊粉酶，但无论从粗蛋白的含量、活性还是比活与N端携带6个组氨酸标签的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶相比都有较大幅度的下降。分析可能原因，一是C端序列上有潜在的糖基化位点，携带组氨酸标签后封闭了某个潜在的糖基化位点，影响了毕赤酵母X-33对重组蛋白的糖基化修饰，而糖基化修饰可以影响蛋白的分泌表达，并且对维持酶活力具有非常重要的作用，所以C端连接linker(G4S)后携带6个组氨酸标签的重组外切菊粉酶的表达量、活性与比活都比较低；二是C端可能具有促进酶和底物分子结合的作用，携带组氨酸标签影响了酶和底物的结合，使其活性降低。

Claims (6)

1.重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶，其特征在于：具有序列表SEQ ID NO：1中氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶，其特征在于：编码基因在远离鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶催化活性中心的N端引入编码6个组氨酸的分离纯化标签序列，所述重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的编码基因(不带信号肽序列)具有序列表SEQ IDNO：2中第16位至第1629位的碱基所构成的核苷酸序列，由其编码产生的外切菊粉酶的氨基酸序列为SEQ ID No.1。
3.一种权利要求1所述的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶编码基因，其特征在于：具有序列表SEQ ID NO：2中第16位至第1629位的碱基所构成的核苷酸序列，或具有序列表SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
4.一种权利要求1所述的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的表达方法，其特征在于：采用生物信息学和基因工程技术相结合的方法，首先利用同源建模服务器Swiss-Model，对鹰嘴豆孢克鲁维酵母(Kluyveromycescicerisporus)CBS4857外切菊粉酶进行蛋白质三维结构的构建，确定外源分离纯化标签引入该外切菊粉酶的位置，即在远离鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶催化活性中心的N端引入编码6个组氨酸的分离纯化标签序列，然后采用PCR的方法扩增得到重组的鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因，克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA，经电转化法将重组的鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因导入毕赤酵母(Pichia pastoris)宿主菌X-33中，经甲醇诱导表达获得重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶。
5.按照权利要求4所述的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的表达方法，其特征在于：所述的表达载体为毕赤酵母/大肠穿梭质粒pPICZαA，所述宿主细胞为毕赤酵母X-33。
6.一种权利要求1或2所述的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的应用，其特征在于：所述的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶可用于水解菊粉或果聚糖的β-2,1-D糖苷键，获得果糖。
CN201510631920.8A 2015-09-29 2015-09-29 重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母cbs4857外切菊粉酶及编码基因与表达和应用 Active CN106554951B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510631920.8A CN106554951B (zh) 2015-09-29 2015-09-29 重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母cbs4857外切菊粉酶及编码基因与表达和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510631920.8A CN106554951B (zh) 2015-09-29 2015-09-29 重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母cbs4857外切菊粉酶及编码基因与表达和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106554951A true CN106554951A (zh) 2017-04-05
CN106554951B CN106554951B (zh) 2020-05-26

Family

ID=58416853

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510631920.8A Active CN106554951B (zh) 2015-09-29 2015-09-29 重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母cbs4857外切菊粉酶及编码基因与表达和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106554951B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109207456A (zh) * 2018-10-19 2019-01-15 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种外切菊粉酶、其制备方法及应用
CN115976104A (zh) * 2023-01-03 2023-04-18 中国食品药品检定研究院 一种纯化蛋白的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1495252A (zh) * 2002-07-12 2004-05-12 王建华 一种外切菊粉酶的生产方法
CN101063089A (zh) * 2007-04-30 2007-10-31 复旦大学 一种含有菊粉外切酶基因序列的基因工程菌株及其用于制备菊粉外切酶的方法
CN101469325A (zh) * 2007-12-26 2009-07-01 中国科学院大连化学物理研究所 一种马克斯克鲁维酵母外切菊粉酶的分泌表达方法
CN103952326A (zh) * 2014-05-21 2014-07-30 山东大学 一种共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株及其构建方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1495252A (zh) * 2002-07-12 2004-05-12 王建华 一种外切菊粉酶的生产方法
CN101063089A (zh) * 2007-04-30 2007-10-31 复旦大学 一种含有菊粉外切酶基因序列的基因工程菌株及其用于制备菊粉外切酶的方法
CN101469325A (zh) * 2007-12-26 2009-07-01 中国科学院大连化学物理研究所 一种马克斯克鲁维酵母外切菊粉酶的分泌表达方法
CN103952326A (zh) * 2014-05-21 2014-07-30 山东大学 一种共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株及其构建方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WEN,T.ET AL.: "ACCESSION AF178979.1", 《GENBANK》 *
蔡显鹏: "鹰嘴豆孢克鲁维酵母分泌表达系统的构建及菊粉酶的高效分泌表达", 《万方.中国学位论文全文数据库》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109207456A (zh) * 2018-10-19 2019-01-15 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种外切菊粉酶、其制备方法及应用
CN115976104A (zh) * 2023-01-03 2023-04-18 中国食品药品检定研究院 一种纯化蛋白的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106554951B (zh) 2020-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101492661B (zh) 一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及用于龙胆低聚糖的制备
CN105821020B (zh) 一种β-甘露聚糖酶mRmMan5A及其编码基因与应用
CN105018448B (zh) 一种真菌来源的耐热酸性纤维素酶及其基因和应用
CN102732494B (zh) β-甘露聚糖酶及其制备方法
CN103215244B (zh) 一种碱性果胶酶PelN及其编码基因与应用
CN103088041B (zh) 一种可用于高效生产角质酶的角质酶基因及其应用
CN107142253A (zh) 一种高催化效率且耐高温木聚糖酶突变体及其制备方法和应用
CN105886484A (zh) 一种嗜热纤维素酶及其编码基因和应用
CN101343635B (zh) 构建表达预定糖链修饰糖蛋白工程菌株的方法
CN113684198B (zh) 一种提高纤维素酶催化效率的方法及突变体5i77-m2
CN101469325B (zh) 一种马克斯克鲁维酵母外切菊粉酶的分泌表达方法
CN107257851A (zh) 正面影响天然或工程化的真核细胞的生理学的细菌伴侣蛋白的组合
CN109207497B (zh) 纤维素外切酶基因和编码的蛋白及其应用
CN109280673B (zh) 糖苷水解酶家族7蛋白基因及其编码的蛋白和应用
CN106554951A (zh) 重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母cbs4857外切菊粉酶及编码基因与表达和应用
CN103952326A (zh) 一种共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株及其构建方法与应用
CN109321551A (zh) 一种新Trx-β-葡萄糖苷酶的基因及其蛋白表达、载体和应用
CN105154417B (zh) 一种真菌来源的酸性纤维素酶及其基因和应用
CN107418941B (zh) 一种重组黄曲霉壳聚糖酶和编码基因及制备和应用
CN116286750A (zh) 一种β-葡萄糖苷酶、编码基因、重组载体、工程菌及应用
CN104726388B (zh) 一种普鲁兰酶产酶菌株及提高其产酶能力的方法
CN113584002B (zh) 一种α-L-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用
CN113584001B (zh) 一种alpha-L-鼠李糖苷酶、其制备方法及应用
CN110564748B (zh) 一种茯苓纤维素内切酶基因及其表达载体和蛋白
CN103667212B (zh) 一种糖化酶及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant