CN107418941B - 一种重组黄曲霉壳聚糖酶和编码基因及制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高效黄曲霉(Aspergi llus sp.Y2K)壳聚糖内切酶突变体的制备，该突变酶可用于水解壳聚糖，获得寡糖或单糖。该方法主要包括以下步骤：将成熟的重组壳聚糖酶基因突变A286G,C287T两个位点的DNA序列克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA，并将重组质粒经电转化法整合到毕赤酵母宿主菌X‑33中，即可获得能高效分泌表达、高效降解壳聚糖，高纯度的重组壳聚糖酶突变体，比较没有突变前的发酵酶活力提高了3倍，本发明制备的内切壳聚糖酶可广泛应用于食品、药品、生物能源等领域。

Description

一种重组黄曲霉壳聚糖酶和编码基因及制备和应用

技术领域

本发明提供了一种高效重组黄曲霉壳聚糖酶突变体的制备以及应用。用该方法制备的上清中重组壳聚糖酶突变体达1.02mg/ml，发酵酶活力高达4400U/ml，能高效降壳聚糖产生高纯度的壳寡糖，SDS-PAGE检测分泌酶的纯度达到90％。本发明制备的重组壳聚糖酶突变体具有潜在的工业应用价值，可广泛应用于食品、药品、生物质转化等领域。

背景技术

壳聚糖(chitosan)最早发现于19世纪，是由自然界中广泛存在的甲壳素经过脱乙酰作用得到的，这种天然高分子具有良好的安全性、生物相容性和微生物降解性。大量研究表明壳聚糖在食品、化工、医药及农业等领域都有广泛的应用前景(高维,丁文平.低分子量壳聚糖的制备及其应用研究[J].武汉工业学院学报,2007,26(3):28-31.)。但由于壳聚糖的溶解性问题，严重阻碍了其资源的有效利用与高值化(邹耀邦,王璐,刘孝波.生物质材料：甲壳素/壳聚糖的溶解性与应用研究进展[J].材料导报,2003,17(5):51-55.)。壳寡糖又名壳聚寡糖或几丁寡糖，作为壳聚糖的下一级产物，具有壳聚糖无法比拟的特性，它具有较高的溶解度和较低的分子量，更容易被生物体吸收，近年来的研究发现，低分子量壳寡糖(如五糖、六糖)还具有抗肿瘤、抗菌、免疫激活及保湿吸湿等特性(单晓雪,郑人源,张涛,等.壳聚糖酶的研究进展[J].成都医学院学报,2007,2(3):192-198.)。

目前壳寡糖的制备大多数是以甲壳动物(虾、蟹等)的骨骼为主要原料，经过脱乙酰基、脱钙、脱蛋白等处理得到壳聚糖，再进一步水解得到壳寡糖(刘幸海,李正名,王宝雷.壳寡糖的制备工艺最新研究进展[J].天津化工,2006,20(1):1-6.)。制备壳寡糖的方法主要有化学降解法、物理降解法和酶降解法等。化学降解法产生的衍生物较多，低聚糖得率低且环境污染严重；物理降解法生产成本较高，难以实现工业化；酶法因条件温和、选择性高，对环境污染小，产物安全性好，受到了越来越多的重视与关注(叶淑红,孙浩,陈丽,等.产壳聚糖酶菌株的筛选及壳寡糖性质的研究[J].食品研究与开发,2007,28(1):23-27.)。如今，酶法水解壳聚糖制备壳寡糖已成为甲壳素领域的一个研究热点。

壳聚糖酶(chitosanase)是一种能分解壳聚糖的专一性酶，它是由Monaghan于1973年在研究细菌和真菌过程中首先提出来的。壳聚糖酶不同于几丁质酶，它能够降解完全脱乙酰化的壳聚糖，生成壳寡糖 (Monaghan R L,Eveleigh D E,Tewari F P,etal.Chitosanase,a novel enzyme[J].Nature New Biol,1973,245(142):78-80.)。壳聚糖酶在细菌、真菌和病毒等类群的微生物中均有存在，但大多数微生物产壳聚糖酶的活性较低，分离和提纯技术比较复杂，使生产成本相对较高，从而影响壳寡糖的酶法生产。微生物产壳聚糖酶的分子质量一般为10～50ku，同时也存在少数分子量较高的壳聚糖酶，如曲霉Aspergillussp CJ-22-326所产的两种壳聚糖酶，其中内切酶的相对分子质量高达109ku(Chen X,Xia W,Yu X.Purification and characterization of two types ofchitosanase from Aspergillus sp.CJ22-326[J].Food research international,2005,38(3):315-322.)。根据壳聚糖酶的作用模型可分为内切型和内切型两种。内切型壳聚糖酶可随机切断壳聚糖链，释放小分子量低聚糖，其中以二聚体和三聚体为主；外切型则从壳聚糖的非还原末端逐个切下单糖残基，产生单糖残基-氨基葡萄糖。至今发现的壳聚糖酶一般多为内切型，从食品工业生产应用的角度来说，内切型壳聚糖酶所产生的功能性低聚糖也正是人们所需要的。然而，自然界中分离产壳聚酶的菌株即耗时又耗力，且存在发酵周期长、产量不高，难以满足大规模工业化生产的需求。采用优化培养基成分及培养条件、氯化锂-紫外线复合诱变、高密度发酵等方法，虽然在一定程度上提高了野生菌株产壳聚糖酶活性，仍满足不了工业化需求。利用基因工程技术重组壳聚糖酶基因是解决天然菌株筛选所遇问题的有效措施。目前，许多不同微生物来源的内切壳聚糖酶基因利用基因重组方法进行了异源表达(Kang,L.X.,Chen,X.M.,Fu,L.,and Ma,L.X.(2012).Recombinantexpression of chitosanase from Bacillus subtilis HD145 in Pichiapastoris.Carbohydrate research 352,37-43；Kilani-Feki,O.,Frikha,F.,Zouari,I.,and Jaoua,S.(2013).Heterologous expression and secretion of an antifungalBacillus subtilis chitosanase(CSNV26)in Escherichia coli.Bioprocess andbiosystems engineering 36,985-992；Seo,D.J.,Lee,J.H.,Song,Y.S.,Park,R.D.,andJung,W.J.(2014).Expression patterns of chitinase and chitosanase producedfrom Bacillus cereus in suppression of phytopathogen.Microb Pathog 73,31-36；Sun,Y.,Zhang,J.,and Wang,S.(2015).Heterologous Expression and EfficientSecretion of Chitosanase from Microbacterium sp.in Escherichia coli.Indian JMicrobiol 55,194-199.)，取得了一定的进展。将黄曲霉菌株的壳聚糖酶基因在毕赤酵母X-33中重组表达后，内切壳聚糖酶活力达到286.8±5.4U/mL(Zhang T et al,ProcessBiochemistry,2009,44:1335-1339)，但重组的壳聚糖酶产量和活性仍然难以满足其在食品、医药行业的应用。黄曲霉中的壳聚糖酶已在毕赤酵母分泌表达，但表达量和活性仍然离工业生产有些距离(Xiaomei Chen et al,Biotechnol Lett(2012)34:689–694)，活性有待提高。该基因来源于真 核生物，表达宿主因而要选真核生物，毕赤酵母仍然是最佳选择。如何实现高效表达具有高活性的重组内切壳聚糖酶，成为本专利所要解决的问题。这个创新点感觉弱，我们的产量和活性更高。

我们采用Swiss-Model构建目的蛋白三维模型的方法，通过原子能势计算，经过系列筛选，确定壳聚糖酶突变体酶蛋白的突变位置，即在远离壳聚糖酶突变体酶催化活性中心的95位将天冬氨酸突变为甘氨酸，并且不添加额外的氨基酸残基，然后将重组壳聚糖酶突变体基因克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA，并将重组质粒经电转化法整合到毕赤酵母宿主菌X-33中。本发明制备的内切壳聚糖酶突变体具有潜在的工业应用价值，可广泛应用于食品、药品、生物能源等领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组黄曲霉壳聚糖酶突变体的制备和应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下。

一种重组黄曲霉壳聚糖酶突变体的高效分泌表达方法，其主要步骤为：首先利用Swiss-Model对壳聚糖酶突变体自动建模，确定引入壳聚糖酶突变体酶蛋白的突变位置，即在其成熟基因A286G和C287T引入突变点，然后将重组壳聚糖酶突变体基因克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA，并将重组质粒经电转化法整合到毕赤酵母宿主菌X-33中，甲醇诱导表达即可获得重组的壳聚糖酶突变体。

本发明所述的重组壳聚糖酶突变体编码基因(不带信号肽序列)是SEQ ID No.1中第16位至第678位的碱基所构成的核苷酸序列，由其编码产生的内切壳聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2中的氨基酸所构成的蛋白序列；重组基因同时引入了XhoI酶切位点和Kex信号肽切割位点，确保目的蛋白的天然N端完整性，不引入纯化标签序列等额外氨基酸残基，同时确保重组壳聚糖酶突变体在分泌表达过程中被有效切割；所述的表达载体为毕赤酵母/大肠穿梭质粒pPICZαA；所述宿主细胞为毕赤酵母X-33；所述的重组质粒电转入毕赤酵母宿主细胞前，需用SacI限制性内切酶进行线性化处理，与宿主细胞在AOX1基因处整合，利用载体pPICZαA的醇氧化酶强启动子(AOX)进行外源蛋白的高效分泌表达。

一种高效分泌表达壳聚糖酶突变体的重组质粒的构建过程为：以黄曲霉基因(序列有苏州金唯智公司合成，GenBank编号AY190324)为模板，设计扩增引物，C-F：

5’-TCTCTCGAG

TACAACCTACCCAAC-3’和C-R：5’-CTCGCGGCCGCTTAAGCCTTCAAACCAGCAAC-3’，其中下划线分别为XhoI、NotI酶切位点，序列斜体

为Kex2信号切割位点， 然后进行聚合酶链式反应(PCR)扩增得到重组壳聚糖酶突变体基因(不带信号肽序列)，通过TA克隆连接到T载体，测序正确后，经XhoI和NotI双酶切亚克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA(购自Invitrogen公司)，得到重组表达质粒pPICZαA-N-壳聚糖酶突变体。

一种高效分泌表达重组壳聚糖酶突变体制备过程为：SacI线性化重组表达质粒后，电转化至毕赤酵母宿主细胞X-33(购自Invitrogen公司)，电转化的具体参数为：2mm转化杯，2000V电压，200Ω电阻，25uF电容，Zeocin抗性筛选后，酵母菌落PCR进行验证，具体过程参照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册(pPICZαA,B,and C Pichia expressionvectors for selection on Zeocin^TM and purification of recombinant proteins)，确保壳聚糖酶突变体已与宿主细胞在AOX1基因处整合，以载体pPICZαA醇氧化酶强启动子(AOX)进行高效表达。挑取阳性克隆子参照上述手册，在三角烧瓶以0.5％甲醇进行诱导表达，96h后离心收集上清，以1％壳聚糖为底物，DNS法进行活性测定，上清中重组壳聚糖酶突变体达1.02mg/ml，内切壳聚糖酶的活性达到4400U/ml。经质谱分析，利用该突变酶能高效降解壳聚糖产生高纯度的壳寡糖，SDS-PAGE检测酶的纯度达到90％。本发明制备的重组壳聚糖酶突变体具有潜在的工业应用价值，可广泛应用于食品、药品、生物质转化等领域。

与现有技术相比，本发明的优势在于以下几点：

(1)和野生菌株生产壳聚糖酶相比，获得壳聚糖酶的发酵酶活高，诱导96h发酵上清中的内切壳聚糖酶活性就可达到4400U/ml，未突变的发酵酶活1400U/ml。酶活提高3倍。

(2)利用酵母系统进行内切壳聚糖酶突变体重组表达时，引入了XhoI酶切位点，确保目的蛋白的天然N端的完整性，不引入额外氨基酸残基。突变酶表达量(1.02mg/ml)比未突变前(0.35mg/ml)提高了将近3倍，比活力比出发菌株的壳聚糖酶提高了20％，SDS-PAGE检测酶的纯度达到90％。

本发明获得能高效分泌表达、高效降解壳聚糖，高纯度的重组壳聚糖酶突变体，比较没有突变前的发酵酶活力提高了3倍，本发明制备的内切壳聚糖酶可广泛应用于食品、药品、生物能源等领域。

附图说明

图1黄曲霉壳聚糖酶的3D结构模式图。壳聚糖酶突变位点位于95位的天冬氨酸(D),突变为甘氨酸，远离催化活性中心143D和152E，被包裹在酶分子内部。

图2重组质粒pPICZαA-N-壳聚糖酶突变体构建模式图。

图3重组壳聚糖酶突变体的诱导表达蛋白电泳图(SDS-PAGE)。泳道1：未突变的壳聚糖酶，泳道2：突变的壳聚糖酶。

图4整合了载体pPICZαA-N-壳聚糖酶突变体的重组毕赤酵母X-33在诱导培养基中的菌体增长曲线

图5重组菌诱导表达上清中的内切壳聚糖酶突变体的活性测定图。

图6质谱分析内切壳聚糖酶突变体降解壳聚糖的产物。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进一步说明。

实施例1黄曲霉内切壳聚糖酶3D模型构建

利用同源建模服务器Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org)，对壳聚糖酶突变体进行自动建模，3D结构如图1。壳聚糖酶突变体的N端由3个片层和3个螺旋片组成，C-端是2个片层和线性结构组成，中间由linker连接。从图1可以看出，壳聚糖酶突变体位置95D，远离催化活性中心(D143/E152)，不会对酶的催化活性产生影响

实施例2成熟壳聚糖酶突变体基因克隆

以黄曲霉壳聚糖酶基因为参考(序列有苏州金唯智公司合成，GenBank编号AY190324，将成熟的重组壳聚糖酶基因突变A286G,C287T两个位点，相应的氨基酸残基95D突变为95G)，设计扩增引物，C-F：5’-TCTCTCGAG

TACAACCTACCCAAC-3’和C-R：5’-CTCGCGGCCGCTTAAGCCTTCAAACCAGCAAC-3’，其中下划线分别为XhoI、NotI酶切位点，斜体为Kex2信号切割位点，然后进行聚合酶链式反应(PCR)扩增得到重组壳聚糖酶突变体基因(不带信号肽序列)，其中下划线分别为XhoI、NotI酶切位点，斜线为Kex2信号切割位点。以LATaq DNA聚合酶进行PCR反应，反应条件为：94℃预变性2min，然后94℃变性30sec-55℃退火30sec-72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸7min。1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，产物大小为700bp。胶回收试剂盒(购自Axygen公司)纯化PCR产物。

序列表

(1)SEQ ID No.1的信息(参见序列表)

(a)序列特征

*长度：692碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

SEQ ID No.1

全长692,包括酶切位点和保护碱基29个，编码区为16-678位，4-9位为XhoI酶切位点，10-16位为Kex2信号肽切割位点，682-689位为NotI酶切位点。

TCTCTCGAGAAAAGATATAATTTGCCCAACAACTTGAAACAGATCTACGACAAACACAAGGGAAAATGTTCCAAGGTACTGGCAAAAGGGTTCACCAATGGTGATGCTAGCCAAGGCAAGTCTTTCAGTTACTGCGGCGACATCCCGGGTGCCATTTTCATCTCCTCCTCCAAGGGGTACACCAATATGGACATTGACTGCGACGGCGCCAACAACTCCGCCGGCAAGTGCGCCAACGACCCGTCCGGCCAGGGCGAGACTGCCTTCAAGTCCGACGTGAAGAAGTTTGGCATCTCCGGTCTGGACGCCAACATCCACCCCTATGTGGTGTTTGGAAACGAGGACCACTCTCCCAAGTTCAAGCCCCAGTCACATGGCATGCAGCCATTGAGTGTTATGGCTGTCGTGTGCAATGGCCAACTGCATTACGGAATCTGGGGTGACACCAACGGTGGCGTTTCTACCGGCGAAGCCTCCATTTCTTTGGCCGACCTTTGCTTCCCCAACGAGCATCTCGATGGCAACCATGGTCACGATCCCAATGATGTCCTCTTCATTGGCTTCACTAGCAAGGACGCCGTGCCTGGAGCGACTGCCAAGTGGAAGGCAAAGAATGCGAAAGAATTCGAGGACAGTATCAAGTCGATTGGTGACAAGCTGGTTGCTGGTTTGAAAGCATAAGCGGCCGCGAG

SEQ ID No.2的信息

(a)序列特征

*长度：238氨基酸残基

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白

SEQ ID No.2

全长238个氨基酸，18-238为成熟壳聚糖酶突变体蛋白序列。

MRLSEILTVALVTGATAYNLPNNLKQIYDKHKGKCSKVLAKGFTNGDASQGKSFSYCGDIPGAIFISSSKGYTNMDIDCDGANNSAGKCANDPSGQGETAFKSDVKKFGISGLDANIHPYVVFGNEDHSPKFKPQSHGMQPLSVMAVVCNGQLHYGIWGDTNGGVSTGEASISLADLCFPNEHLDGNHGHDPNDVLFIGFTSKDAVPGATAKWKAKNAKEFEDSIKSIGDKLVAGLKA

实施例3重组质粒pPICZαA-N-壳聚糖酶突变体的构建

重组质粒pPICZαA-N-壳聚糖酶突变体的构建模式如图2，载体pPICZαA上的α-因子分泌信号序列基因与N末端的重组壳聚糖酶突变体基因(不带信号肽序列)直接相连，使用载体pPICZαA上的Kex2信号肽切割位点，切去分泌表达的壳聚糖酶突变体信号肽序列，得到成熟的重组壳聚糖酶突变体。pPICZαA-N-壳聚糖酶突变体的具体构建过程如下。

将纯化的PCR产物与T载体pMD19-T进行TA连接，连接产物 转化E.coli Top10，经蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定获得阳性克隆子，同时提取质粒送去北京六合华大基因科技股份有限公司测序。将测序正确的质粒和空载体pPICZαA(购自Invitrogen公司)分别用限制性内切酶Xho I和Not I进行双酶切，胶回收试剂盒纯化酶切产物，在T4DNA连接酶的作用下，将纯化的酶切产物进行连接，连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞后，涂布于含有25μg/ml博来霉素(Zeocin，Invitrogen公司)的LLB(酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉15g/L)固体培养基上，37℃培养12h，菌落PCR进行验证。挑取阳性单克隆接入含有25μg/ml Zeocin的液体LLB培养基中培养，提取质粒。将重组质粒分别用限制性内切酶Xho I和Not I进行双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，得到条带大小正确的酶切产物，初步证明构建的重组质粒正确，然后将该重组质粒pPICZαA-N-壳聚糖酶突变体送去北京六合华大基因科技股份有限公司测序。结果表明，在pPICZαA的Xho I和Not I酶切位点之间插入了成熟壳聚糖酶突变体基因，插入方向正确，进一步证明构建的重组质粒正确。

实施例4重组质粒电转化至毕赤酵母X-33

用SacI线性化重组质粒pPICZαA-N-壳聚糖酶突变体，参照Gene JET GelExtraction and DNA Cleanup Micro Kit(法国Fermentas公司)的操作说明对单酶切产物进行柱式纯化，1％琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果，按照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册(pPICZαA,B,and C Pichia expression vectors for selection on Zeocin^TM andpurification of recombinant proteins)进行电转化和诱导表达。取5ul线性化的重组质粒电转化至毕赤酵母感受态细胞X-33(购自Invitrogen公司)，线性化的空载体pPICZαA作为对照同时进行电转化，电转化的条件为：2mm转化杯，2000V电压，200Ω电阻，25uF电容，在含有100μg/mL Zeocin的YPDS(山梨醇181.6g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L)抗性平板上，30℃培养3-4后长出单菌落，挑取了9个单菌落进行酵母菌落PCR，具体操作步骤见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册，引物为AOX-F：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’和AOX-R 5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’，重组质粒转化毕赤酵母X-33后的菌落PCR结果，产物大小约为1.24kb(700bp+540bp)，空载体pPICZαA转化毕赤酵母X-33后的菌落PCR结果，产物大小为540bp，说明内切壳聚糖酶基因已整合到毕赤酵母X-33基因组中，位于α-信号因子基因的下游，以载体pPICZαA上的醇氧化酶强启动子(AOX)进行高效表达。

实施例5重组菌株的诱导表达

将阳性克隆单菌落接种至50ml BMGY(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB13.4g/L，10％甘油100ml，4×10^-5％生物素，100.0mM pH 6.0的磷酸盐缓冲液100ml)培养基中，28℃，200rpm培养至OD600＝2-6，室温下1500rpm离心5min，收集菌体，用100ml BMMY(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB13.4g/L，4×10^-5％生物素，100.0mM pH 6.0的磷酸盐缓冲液100ml，0.5％的甲醇)重悬菌体，28℃，180rpm进行诱导表达，每24h加入终浓度为0.5％的甲醇，同时取样5ml，进行菌体密度、菌体湿重的测定。诱导96h后，4℃，8000rpm离心20min收集上清，SDS-PAGE检测诱导表达效果，如图3所示，在SDS-PAGE电泳胶上呈现一条大约26kD的蛋白条带，比预期蛋白分子量(24kD)大，推测这与蛋白翻译后糖基化修饰有关。

实施例6重组内切壳聚糖酶活性的测定

重组内切壳聚糖酶活性测定采用DNS法(3，5-二硝基水杨酸试剂)。

(1)DNS试剂的配制：

甲液-溶解6.9g结晶酚(上海华舜生物工程有限公司，产品编号0946)于15.2mL10％NaOH中，用蒸馏水稀释至69mL，再加入6.9g NaHSO₃。

乙液-称取255g酒石酸钾钠，加到300mL 10％NaOH中，再加入880mL 1％3，5-二硝基水杨酸溶液。

将甲液与乙液相混合即得黄色DNS试剂，贮于棕色试剂瓶中。在室温下，放置7-10天以后使用。半年内有效。

(2)pH4.6 HAc-NaAc缓冲液的配置方法：

①2MNaAc母液：称取272.16g乙酸钠溶于适量蒸馏水中，定容至1000mL。

②2M HAc母液：称取120.10g乙酸溶于适量蒸馏水中，定容至1000mL

③取24.5mL 2M NaAc溶液和25.5mL 2M HAc溶液混合，定容至1000mL，即得pH 4.6的0.1M HAc-NaAc缓冲液

(3)1％壳聚糖酶溶液的配制：

精密称取10.00g壳聚糖酶(伊利产品来自大连理工大学)于适量醋酸缓冲液，定容至100mL容量瓶中。

(4)内切壳聚糖酶活性测定

取适量重组内切壳聚糖酶，用0.1MHAc-NaAc pH4.6缓冲液稀释(上清稀释100倍)，取50uL稀释液加入450ul 1％壳聚糖溶液，混匀，39℃水浴反应10min(精确计时)，立即取出沸水浴灭活5min，从反应液中取出50ul，加入0.3ml DNS试剂和0.35ml水，混匀，沸水浴中反应10min(精确计时)，冷水冷却，用容量瓶定容至5ml，测 OD_540nm。对应葡萄糖标准曲线计算得样品反应液中的含糖量A(mg)。

对照设置：重组内切壳聚糖酶稀释液，沸水浴灭活5min，取50ul加入450ul 5％壳聚糖溶液，混匀，39℃水浴反应10min(精确计时)，从反应液中取出50ul，加入0.3ml DNS试剂和0.35ml水，混匀，沸水浴中反应10min(精确计时)，冷水冷却，用容量瓶定容至5ml,测OD_540nm。对应果糖标准曲线计算得样品反应液中的含糖量A(mg)作为对照，调零。

酶活单位(U)为每分钟水解产生1微摩尔果糖所需要的酶量。

酶活计算：每毫升发酵上清液中壳聚糖酶活性为倍数

实施例7重组酵母菌生长曲线分析和表达上清内切壳聚糖酶活性测定

将每天取样的重组菌液1ml，12000g离心10min收集菌体沉淀，测菌体湿重，上清用来测定内切壳聚糖酶的活性和蛋白浓度(空载体pPICZαA重组菌的表达上清中蛋白浓度作为对照)，活性测定方法见实施例6，同时将每天收集的菌液稀释后用紫外分光光计在OD_600nm处进行菌体密度的测定。根据结果绘制菌体湿重及菌体密度的生长曲线，如图4，同时绘制重组菌每天表达的上清内切壳聚糖酶的活性测定图，诱导96h后发酵上清中的粗蛋白含量为1.01mg/ml，未突变前的表达量为0.35mg/ml(图5)。重组壳聚糖酶突变体的活性达4400U/ml，未突变的酶活力为1400U/ml，SDS-PAGE检测酶的纯度达到90％(图5)。

实施例8:重组壳聚糖酶突变体的降解率检测

利用实施例5中的重组壳聚糖酶突变体，对壳聚糖酶进行了水解实验。取0.5ml的重组壳聚糖酶突变体(酶活达4400U/ml)与50ml1％的壳聚糖酶溶液，39℃反应24h，降解率达到95％以上，表明所获得的重组壳聚糖酶突变体可用于壳寡糖的制备。

实施例9：重组壳聚糖酶突变体的产物分析

重组壳聚糖酶突变体的产物分析采用ESI-MS(电喷雾质谱)对酶反应产物进行分析。反应体系为500μL，将10μg纯酶与10mg的壳聚糖于39℃条件下反应0.5h，沸水水浴10min终止反应，12000rpm离心20min，取上清液，采用Sevage试剂除去反应体系中的蛋白。利用安捷伦公司生产的Carbograph column除去反应体系中的盐类，冷冻干燥后用1mL甲醇-水混合液(1:1，v/v)溶解备用。产物在正离子模式下检测，质谱条件设置为离子源电压4.5kV，毛细管温度275～300℃，tube lens电压250V，鞘气流速30arb，扫描范围150～2000m/z。分析结果显示，壳聚糖的降解产物主要为寡三糖，四糖和五糖(图6)。

Claims (4)

1.一种重组黄曲霉壳聚糖酶，其特征在于：

其氨基酸序列为SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-238位或第18-238位氨基酸序列。

2.一种重组黄曲霉壳聚糖酶的编码基因，其特征在于：由其编码产生的壳聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2；

或，由其编码产生的内切壳聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2从氨基端开始的第18-238位氨基酸序列。

3.一种权利要求1所述重组黄曲霉壳聚糖酶的制备方法，其特征在于：

在成熟的黄曲霉壳聚糖酶基因引入两突变位点A286G, C287T ，相应的氨基酸残基95D突变为95G，然后采用PCR的方法扩增得到重组的壳聚糖酶突变基因，克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA，经电转化法将重组的突变基因导入毕赤酵母（Pichia pastoris）宿主菌X-33中，经甲醇诱导表达获得重组壳聚糖酶突变体。

4.一种权利要求1所述的重组黄曲霉壳聚糖酶的应用，其特征在于：所述的重组黄曲霉壳聚糖酶可用于水解壳聚糖，获得寡糖或单糖。

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