CN109868266A - 一种重组黑曲霉果胶酶及编码基因和制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组黑曲霉(Aspergillus niger)果胶酶及其编码基因和高效的制备方法，属于基因工程领域。该方法主要包括以下步骤：将成熟的重组果胶酶基因DNA序列克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA，并将重组质粒经电转化法整合到毕赤酵母宿主菌X‑33中，即可获得能高效分泌表达、高效降解果胶，高纯度的重组果胶酶，本发明制备的内切果胶酶可广泛应用于食品、药品、生物能源等领域。

Description

一种重组黑曲霉果胶酶及编码基因和制备与应用

技术领域

本发明提供了一种高效分泌表达重组黑曲霉果胶酶的方法。用该方法制备的上清中重组果胶酶达0.62mg/ml，发酵酶活力高达200U/ml，能高效降果胶产生高纯度的果胶寡糖，SDS-PAGE检测分泌酶的纯度达到90％。本发明制备的重组果胶酶具有潜在的工业应用价值，可广泛应用于食品、药品、生物质转化等领域。

背景技术

果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键聚合而成的多糖链, 常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链,游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子,特别是与硼化合物结合在一起.它存在于所有的高等植物中,沉积于初生细胞壁和细胞间层,在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白(extensin)相互交联,使各种细胞组织结构坚硬,表现出固有的形态.果胶分子的结构因植物的种类、组织部位、生长条件等的不同而不同,其大致的结构可分为光滑区(smooth region)和须状区(hairy region)两部分,主要由HGA、RG-Ⅰ和RG-Ⅱ三个结构区域构成,其中RG-Ⅱ常以二聚体的形式存在.同其它植物多糖一样,果胶也是多分子的、多分散的、多结构的、有高级空间构象的,也具有一定的相对分子质量分布.

果胶由于其不溶性，不能被人类很好利用，它必须通过果胶酶(pectolyticenzyme or pectinase)降解成水溶性寡糖。果胶酶是指能够分解果胶物质的多种酶的总称.许多霉菌及少量的细菌和酵母菌都可产生果胶酶,主要以曲霉和杆菌为主. 新近报道的其它菌有青霉如意大利青霉(Penicillium itaticum)、扩展青霉 (Penicilliumexpansum)以及Penicilliumgriseoroseum等,白绢菌(Sclerotium rolfsii)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、微小毛霉(Mucorpusilus)、高大毛霉(Mucor mucedo)、热解糖梭菌(Cloctridium thermosaccharolyticum)、匐枝根霉(Rhizopus stolonifer)、出芽短梗霉(Aureobasidu-im pullulans)、粗糙链孢霉(Neurospora rassa) 嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)]等.由于真菌中的黑曲霉(Aspergillus niger) 属于公认安全级(GRAS,General Regarded As Safe),其代谢产物是安全的,因此目前市售的食品级果胶酶主要来源于黑曲霉,最适pH值一般在酸性范围.

果胶酶大致分为果胶水解酶(pectin hydrolas-es)、果胶裂解酶(pentinlyases, PL)、果胶酯酶(pectin esterases,PE)和原果胶酶等,其中果胶水解酶又可分为聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonas-es,PG)、聚半乳糖醛酸甲酯水解酶 (polymethylga-lacturonases,PMG)、聚鼠李半乳糖醛酸酶(rham-nogalacturonases, RHG)、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木糖基半乳糖醛酸酶(xylogalacturonase)等, 由于人们对PG的认识最早、应用最广泛,因此早先常被称为果胶酶(pectinase).为避免发生概念混淆,国际上常用Pectolytic Enzyme来代替Pectinase.PMG水解高酯化果胶分子的α-1,4糖苷键,而PG则通过水解作用切断果胶酸分子的α-1,4糖苷键,后者对果胶的水解速度及程度随果胶酸酯化程度的增加而降低,与PE协同作用可加速降解。

果胶酶在细菌、真菌和病毒等类群的微生物中均有存在，但大多数微生物产果胶酶的活性较低，分离和提纯技术比较复杂，使生产成本相对较高，从而影响果胶寡糖的酶法生产。微生物产果胶酶的分子质量一般为10～50kDa。根据果胶酶的作用模型可分为内切型和内切型两种。内切型果胶酶可随机切断糖链，释放小分子量低聚糖，其中以二聚体和三聚体为主；外切型则从果胶的非还原末端逐个切下单糖残基。至今发现的果胶酶一般多为内切型，从食品工业生产应用的角度来说，内切型果胶酶所产生的功能性低聚糖也正是人们所需要的。然而，自然界中分离产果胶酶的菌株即耗时又耗力，且存在发酵周期长、产量不高，难以满足大规模工业化生产的需求。采用优化培养基成分及培养条件、氯化锂-紫外线复合诱变、高密度发酵等方法，虽然在一定程度上提高了野生菌株产果胶酶活性，仍满足不了工业化需求。利用基因工程技术重组果胶酶基因是解决天然菌株筛选所遇问题的有效措施。目前，许多不同微生物来源的内切果胶酶基因利用基因重组方法进行了异源表达，取得了一定的进展。将果胶酶基因在毕赤酵母中重组表达后，内切果胶酶活力达到286.8±5.4U/mL(C.Perez-Fuentes,M.Cristina Ravanal,and J.Eyzaguirre,Heterologousexpression of a Penicillium purpurogenum pectin lyase in Pichia pastoris andits characterization.Fungal Biol 118(2014)507-15； X.Jiang,P.Chen,M.Yin,andQ.Yang,Constitutive expression,purification and characterisation of pectinmethylesterase from Aspergillus niger in Pichia pastoris for potentialapplication in the fruit juice industry.J Sci Food Agric 93(2013)375-81；C.Zhang,J.Yao,C.Zhou,L.Mao,G.Zhang,and Y.Ma,The alkaline pectate lyase PEL168ofBacillus subtilis heterologously expressed in Pichia pastoris is more stableand efficient for degumming ramie fiber.BMC Biotechnol 13(2013)26.)，但重组的果胶酶产量和活性仍然难以满足其在食品、医药行业的应用。如何实现高效表达具有高活性的重组内切果胶酶，成为本专利所要解决的问题。

我们采用Swiss-Model构建目的蛋白三维模型的方法，确定果胶酶酶蛋白的位置，并且不添加额外的氨基酸残基，然后将重组果胶酶基因克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA，并将重组质粒经电转化法整合到毕赤酵母宿主菌X-33中。本发明制备的内切果胶酶具有潜在的工业应用价值，可广泛应用于食品、药品、生物能源等领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组黑曲霉果胶酶及其高效制备方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下。

一种重组黑曲霉果胶酶的高效分泌表达方法，其主要步骤为：首先利用 Swiss-Model对果胶酶自动建模，确定引入果胶酶酶蛋白的位置，选择其成熟基因，然后将重组果胶酶基因克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA，并将重组质粒经电转化法整合到毕赤酵母宿主菌X-33中，甲醇诱导表达即可获得重组的果胶酶。

本发明所述的重组果胶酶编码基因(不带信号肽序列)是SEQ ID No.1中碱基所构成的核苷酸序列，由其编码产生的内切果胶酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2中的氨基酸所构成的蛋白序列；重组基因同时引入了XhoI酶切位点和Kex 信号肽切割位点，确保目的蛋白的天然N端完整性，不引入纯化标签序列等额外氨基酸残基，同时确保重组果胶酶在分泌表达过程中被有效切割；所述的表达载体为毕赤酵母/大肠穿梭质粒pPICZαA；所述宿主细胞为毕赤酵母X-33；所述的重组质粒电转入毕赤酵母宿主细胞前，需用SacI限制性内切酶进行线性化处理，与宿主细胞在AOX1基因处整合，利用载体pPICZαA的醇氧化酶强启动子(AOX)进行外源蛋白的高效分泌表达。

一种高效分泌表达果胶酶的重组质粒的构建过程为：以黑曲霉基因(序列有苏州金唯智公司合成，GenBank编号X60724.1)为模板，设计扩增引物，C-F：5’-TCTCTCGAGgtcggcgtgtccggctctgc-3和C-R：5’- CTCGCGGCCGCttacaggttgccctgacc-3’，其中下划线分别为XhoI、NotI酶切位点，斜线为Kex2信号切割位点，然后进行聚合酶链式反应(PCR)扩增得到重组果胶酶基因(不带信号肽序列)，通过TA克隆连接到T载体，测序正确后，经XhoI 和NotI双酶切亚克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA(购自Invitrogen公司)，得到重组表达质粒pPICZαA-N-果胶酶。

一种高效分泌表达重组果胶酶制备过程为：SacI线性化重组表达质粒后，电转化至毕赤酵母宿主细胞X-33(购自Invitrogen公司)，电转化的具体参数为： 2mm转化杯，2000V电压，200Ω电阻，25uF电容，Zeocin抗性筛选后，酵母菌落PCR进行验证，具体过程参照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册(pPICZαA, B,and C Pichia expression vectorsfor selection on Zeocin^TM and purification of recombinant proteins)，确保果胶酶已与宿主细胞在AOX1基因处整合，以载体 pPICZαA醇氧化酶强启动子(AOX)进行高效表达。挑取阳性克隆子参照上述手册，在三角烧瓶以0.5％甲醇进行诱导表达，96h后离心收集上清，以1％果胶为底物，DNS法进行活性测定，上清中重组果胶酶达1.02mg/ml，内切果胶酶的活性达到200U/ml，能高效降解果胶产生高纯度的果胶寡糖，SDS-PAGE检测酶的纯度达到90％。本发明制备的重组果胶酶具有潜在的工业应用价值，可广泛应用于食品、药品、生物质转化等领域。

与现有技术相比，本发明的优势在于以下几点：

(1)和野生菌株生产果胶酶相比，获得果胶酶的发酵酶活高，诱导96h发酵上清中的内切果胶酶活性就可达到200U/ml，比野生菌提高了10倍(野生菌的活性为19U/ml)

(2)利用酵母系统进行内切果胶酶重组表达时，引入了XhoI酶切位点，确保目的蛋白的天然N端的完整性，不引入额外氨基酸残基。酶表达量(0.62mg/ml)， SDS-PAGE检测酶的纯度达到90％。

附图说明

图1黑曲霉果胶酶的3D结构模式图。

图2重组质粒pPICZαA-N-果胶酶构建模式图。

图3重组果胶酶的诱导表达蛋白电泳图(SDS-PAGE)。泳道1：诱导表达3天的果胶酶，泳道2：诱导表达4天的果胶酶。

图4整合了载体pPICZαA-N-plB的重组毕赤酵母X-33在诱导培养基中的菌体增长曲线

图5重组菌诱导表达上清中的内切果胶酶的活性测定图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进一步说明。

(1)SEQ ID NO：1的信息(参见序列表)

(a)序列特征：

*长度：1140bp(有效长度1-1137)

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：人工合成

(1)SEQ ID NO：2的信息(参见序列表)

(a)序列特征：

*长度：379bp

*类型：氨基酸

(b)分子类型：

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：人工合成

实施例1黑曲霉内切果胶酶3D模型构建

利用同源建模服务器Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org)，对果胶酶进行自动建模，3D结构如图1。果胶酶由线性结构组成，中间由linker连接。从图1可以看出，N端离催化活性中心较近，完整的N端不会对酶的催化活性产生影响

实施例2成熟果胶酶基因克隆

以黑曲霉果胶酶基因为模板(GenBank编号X60724.1，将成熟的重组果胶酶基因)，设计扩增引物，，C-F：5’-TCTCTCGAGgtcggcgtgtccggctctgc-3和C-R：5’- CTCGCGGCCGCttac aggttgccctgacc-3’，其中下划线分别为XhoI、NotI酶切位点，斜线为Kex2信号切割位点，然后进行聚合酶链式反应(PCR)扩增得到重组果胶酶基因(不带信号肽序列)，其中下划线分别为XhoI、NotI酶切位点，斜线为 Kex2信号切割位点。以LA Taq DNA聚合酶进行PCR反应，反应条件为：94℃预变性2min，然后94℃变性30sec-55℃退火30sec-72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸7min。1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，产物大小为700bp。胶回收试剂盒(购自Axygen公司)纯化PCR产物。

实施例3重组质粒pPICZαA-N-果胶酶的构建

重组质粒pPICZαA-N-果胶酶的构建模式如图2，载体pPICZαA上的α-因子分泌信号序列基因与N末端的重组果胶酶基因(不带信号肽序列)直接相连，使用载体pPICZαA上的Kex2信号肽切割位点，切去分泌表达的果胶酶信号肽序列，得到成熟的重组果胶酶。pPICZαA-N-果胶酶的具体构建过程如下。

将纯化的PCR产物与T载体pMD19-T进行TA连接，连接产物转化E.coli Top10，经蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定获得阳性克隆子，同时提取质粒送去北京六合华大基因科技股份有限公司测序。将测序正确的质粒和空载体pPICZαA(购自Invitrogen公司)分别用限制性内切酶Xho I和Not I进行双酶切，胶回收试剂盒纯化酶切产物，在T4DNA连接酶的作用下，将纯化的酶切产物进行连接，连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞后，涂布于含有25μg/ml博来霉素 (Zeocin，Invitrogen公司)的LLB(酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉15g/L)固体培养基上，37℃培养12h，菌落PCR进行验证。挑取阳性单克隆接入含有25μg/ml Zeocin的液体LLB培养基中培养，提取质粒。将重组质粒分别用限制性内切酶XhoI和Not I进行双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，得到条带大小正确的酶切产物，初步证明构建的重组质粒正确，然后将该重组质粒pPICZαA-N-果胶酶送去北京六合华大基因科技股份有限公司测序。结果表明，在pPICZαA的Xho I和Not I酶切位点之间插入了成熟果胶酶基因，插入方向正确，进一步证明构建的重组质粒正确。

实施例4重组质粒电转化至毕赤酵母X-33

用SacI线性化重组质粒pPICZαA-N-果胶酶，参照Gene JET Gel Extraction andDNA Cleanup Micro Kit(法国Fermentas公司)的操作说明对单酶切产物进行柱式纯化，1％琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果，按照 Invitrogen公司毕赤酵母操作手册(pPICZαA,B,and C Pichia expression vectors for selection on Zeocin^TM and purification ofrecombinant proteins)进行电转化和诱导表达。取5ul线性化的重组质粒电转化至毕赤酵母感受态细胞X-33(购自 Invitrogen公司)，线性化的空载体pPICZαA作为对照同时进行电转化，电转化的条件为：2mm转化杯，2000V电压，200Ω电阻，25uF电容，在含有100μg/mLZeocin的YPDS(山梨醇181.6g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L)抗性平板上，30℃培养3-4天后长出单菌落，挑取了9个单菌落进行酵母菌落PCR，具体操作步骤见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册，引物为 AOX-F：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’和AOX-R 5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’，重组质粒转化毕赤酵母X-33后的菌落 PCR结果，产物大小约为1.24kb(700bp+540bp)，空载体pPICZαA转化毕赤酵母X-33后的菌落PCR结果，产物大小为540bp，说明内切果胶酶基因已整合到毕赤酵母X-33基因组中，位于α-信号因子基因的下游，以载体pPICZαA上的醇氧化酶强启动子(AOX)进行高效表达。

实施例5重组菌株的诱导表达

将阳性克隆单菌落接种至50ml BMGY(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L， YNB13.4g/L，10％甘油100ml，4×10^-5％生物素，100.0mM pH 6.0的磷酸盐缓冲液100ml)培养基中，28℃，200rpm培养至OD600＝2-6，室温下1500rpm离心5min，收集菌体，用100ml BMMY(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB13.4 g/L，4×10^-5％生物素，100.0mM pH 6.0的磷酸盐缓冲液100ml，0.5％的甲醇) 重悬菌体，28℃，180rpm进行诱导表达，每24h加入终浓度为0.5％的甲醇，同时取样5ml，进行菌体密度、菌体湿重的测定。诱导96h后，4℃，8000rpm离心20min收集上清，SDS-PAGE检测诱导表达效果，如图3所示，在SDS-PAGE 电泳胶上呈现一条大约46kDa的蛋白条带，比预期蛋白分子量(38kDa)大，推测这与蛋白翻译后糖基化修饰有关。

实施例6重组内切果胶酶活性的测定

重组内切果胶酶活性测定采用DNS法(3，5-二硝基水杨酸试剂)。

(1)DNS试剂的配制：

甲液-溶解6.9g结晶酚(上海华舜生物工程有限公司，产品编号0946)于15.2 mL10％NaOH中，用蒸馏水稀释至69mL，再加入6.9g NaHSO₃。

乙液-称取255g酒石酸钾钠，加到300mL 10％NaOH中，再加入880mL 1％ 3，5-二硝基水杨酸溶液。

将甲液与乙液相混合即得黄色DNS试剂，贮于棕色试剂瓶中。在室温下，放置7-10天以后使用。半年内有效。

(2)pH4.6HAc-NaAc缓冲液的配置方法：

①2MNaAc母液：称取272.16g乙酸钠溶于适量蒸馏水中，定容至1000mL。

②2M HAc母液：称取120.10g乙酸溶于适量蒸馏水中，定容至1000mL

③取24.5mL 2M NaAc溶液和25.5mL 2M HAc溶液混合，定容至1000mL，即得pH 4.6的0.1M HAc-NaAc缓冲液

(3)1％果胶酶溶液的配制：

精密称取1.0g果胶酶(上海源叶生物科技有限公司)于适量PBS缓冲液，定容至100mL容量瓶中。

(4)内切果胶酶活性测定

取适量重组内切果胶酶，用0.1MHAc-NaAc pH4.6缓冲液稀释(上清稀释 100倍)，取50uL稀释液加入450ul 1％果胶溶液，混匀，39℃水浴反应10min (精确计时)，立即取出沸水浴灭活5min，从反应液中取出50ul，加入0.3ml DNS 试剂和0.35ml水，混匀，沸水浴中反应10min(精确计时)，冷水冷却，用容量瓶定容至5ml，测OD_540nm。对应葡萄糖标准曲线计算得样品反应液中的含糖量 A(mg)。

对照设置：重组内切果胶酶稀释液，沸水浴灭活5min，取50ul加入450ul 5％果胶糖溶液，混匀，39℃水浴反应10min(精确计时)，从反应液中取出50ul，加入0.3ml DNS试剂和0.35ml水，混匀，沸水浴中反应10min(精确计时)，冷水冷却，用容量瓶定容至5ml,测OD_540nm。对应果糖标准曲线计算得样品反应液中的含糖量A(mg)作为对照，调零。

酶活单位(U)为每分钟水解产生1微摩尔果糖所需要的酶量。

酶活计算：每毫升发酵上清液中果胶酶活性为倍数

实施例7重组酵母菌生长曲线分析和表达上清内切果胶酶活性测定

将每天取样的重组菌液1ml，12000g离心10min收集菌体沉淀，测菌体湿重，上清用来测定内切果胶酶的活性和蛋白浓度(空载体pPICZαA重组菌的表达上清中蛋白浓度作为对照)，活性测定方法见实施例6，同时将每天收集的菌液稀释后用紫外分光光计在OD_600nm处进行菌体密度的测定。根据结果绘制菌体湿重及菌体密度的生长曲线，如图4，同时绘制重组菌每天表达的上清内切果胶酶的活性测定图，诱导96h后发酵上清中的粗蛋白含量为0.62mg/ml(图5)。重组果胶酶的活性达200U/ml，SDS-PAGE检测酶的纯度达到90％(图5)。

实施例8:重组果胶酶的应用(内切果胶酶降解果胶酶制备果糖浆)

利用实施例5中的重组果胶酶，对果胶酶进行了水解实验。取0.5ml的重组果胶酶(酶活达200U/ml)与50ml 1％的果胶酶溶液，39℃反应24h，降解率达到85％以上，表明所获得的重组果胶酶可用于果胶寡糖的制备。

序列表

SEQ ID No.1

全长1140bp

atgaagtactctactatcttcagcgctgctgccgctgttttcgctggttccgccgctgcagtcggcgtgtccggctctgctgagggtttcgccga gggcgtcaccggtggcggtgatgccacccccgtctaccccgacactatcgatgagctggtctcttaccttggagacgatgaggcccgcgtcat tgtcctgaccaagaccttcgacttcaccgacagcgaaggtaccaccactggcactggttgcgctccctggggtaccgcttccgcctgccaggt tgctattgaccaggacgactggtgcgagaactacgagcccgatgctccctctatcagcgttgaatactacaacgctggtgtcctcggtatcaccgtcacctccaacaagtccctcatcggtgagggctcctctggtgcaatcaagggcaagggtctccgtattgtcagcggtgctgagaacatcat catccagaacatcgcggttaccgacatcaaccccaagtacgtctggggtggtgatgctattactcttgatgactgcgacctggtctggatcga ccatgttactaccgcccgcatcggtcgccagcactacgtccttggaaccagcgccgacaaccgcgtctctctcaccaacaactacattgacgg tgtctccgactactccgccacctgcgatggctaccactactggggcatctacctcgatggtgacgccgacttggtcaccatgaagggcaacta catctaccacacctccggccgtagccccaaggtccaggacaacactctcctccactgtgtcaacaactacttctacgacatctccggccacgcttttgagatcggtgagggtggctacgtcctggctgagggcaacgttttccagaacgtcgacaccgtccttgagacctacgagggcgcggcctt caccgtcccctccaccaccgccggtgaagtctgctccacctaccttggccgtgactgtgtcatcaacggcttcggctcctccggcactttctccg aggacagcacctctttcctctccgacttcgagggcaagaacattgcctctgcttccgcttacacctctgttgcctctagcgttgttgctaacgcc ggtcagggcaacctgtaa

SEQ ID No.2

全长379个氨基酸，21-379为成熟果胶酶蛋白序列。

mkystifsaaaavfagsaaavgvsgsaegfaegvtgggdatpvypdtidelvsylgddearvivltktfdftdsegtttgtgcapwgtasac qvaidqddwcenyepdapsisveyynagvlgitvtsnksligegssgaikgkglrivsgaeniiiqniavtdinpkyvwggdaitlddcdlv widhvttarigrqhyvlgtsadnrvsltnnyidgvsdysatcdgyhywgiyldgdadlvtmkgnyiyhtsgrspkvqdntllhcvnnyfyd isghafeigeggyvlaegnvfqnvdtvletyegaaftvpsttagevcstylgrdcvingfgssgtfsedstsflsdfegkniasasaytsvassv vanagqgnl。

序列表

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 一种重组黑曲霉果胶酶及编码基因和制备与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1140

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaagtact ctactatctt cagcgctgct gccgctgttt tcgctggttc cgccgctgca 60

gtcggcgtgt ccggctctgc tgagggtttc gccgagggcg tcaccggtgg cggtgatgcc 120

acccccgtct accccgacac tatcgatgag ctggtctctt accttggaga cgatgaggcc 180

cgcgtcattg tcctgaccaa gaccttcgac ttcaccgaca gcgaaggtac caccactggc 240

actggttgcg ctccctgggg taccgcttcc gcctgccagg ttgctattga ccaggacgac 300

tggtgcgaga actacgagcc cgatgctccc tctatcagcg ttgaatacta caacgctggt 360

gtcctcggta tcaccgtcac ctccaacaag tccctcatcg gtgagggctc ctctggtgca 420

atcaagggca agggtctccg tattgtcagc ggtgctgaga acatcatcat ccagaacatc 480

gcggttaccg acatcaaccc caagtacgtc tggggtggtg atgctattac tcttgatgac 540

tgcgacctgg tctggatcga ccatgttact accgcccgca tcggtcgcca gcactacgtc 600

cttggaacca gcgccgacaa ccgcgtctct ctcaccaaca actacattga cggtgtctcc 660

gactactccg ccacctgcga tggctaccac tactggggca tctacctcga tggtgacgcc 720

gacttggtca ccatgaaggg caactacatc taccacacct ccggccgtag ccccaaggtc 780

caggacaaca ctctcctcca ctgtgtcaac aactacttct acgacatctc cggccacgct 840

tttgagatcg gtgagggtgg ctacgtcctg gctgagggca acgttttcca gaacgtcgac 900

accgtccttg agacctacga gggcgcggcc ttcaccgtcc cctccaccac cgccggtgaa 960

gtctgctcca cctaccttgg ccgtgactgt gtcatcaacg gcttcggctc ctccggcact 1020

ttctccgagg acagcacctc tttcctctcc gacttcgagg gcaagaacat tgcctctgct 1080

tccgcttaca cctctgttgc ctctagcgtt gttgctaacg ccggtcaggg caacctgtaa 1140

Claims (5)

1.一种重组黑曲霉果胶酶，其特征在于：其具有序列表中SEQ ID No.2中的21-379所述的氨基酸序列。

2.一种权利要求1所述重组黑曲霉果胶酶的编码基因，其特征在于：所述酶的编码基因是SEQ ID No.1中的1140碱基所构成的核苷酸序列，由其编码产生的果胶酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2中的1-379所述的氨基酸序列。

3.一种权利要求1所述的重组黑曲霉果胶酶的编码基因，其特征在于：所述酶的编码基因是SEQ ID No.1碱基中61-1140所构成的核苷酸序列是成熟的黑曲霉果胶酶基因。

4.一种权利要求1所述的重组黑曲霉果胶酶的制备方法，其特征在于：选择成熟的黑曲霉果胶酶基因SEQ ID No.1，采用PCR的方法扩增得到重组的果胶酶基因，克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA(毕赤酵母/大肠穿梭质粒pPICZαA)，经电转化法将重组的基因导入毕赤酵母(Pichia pastoris)宿主菌X-33中，经甲醇诱导表达获得重组果胶酶。

5.一种权利要求1所述的重组黑曲霉果胶酶的应用，其特征在于：可用于水解果胶，获得寡糖和/或单糖。