CN103789289A

CN103789289A - 一种耐碱高温甘露聚糖酶ManB的制备方法及其基因和应用

Info

Publication number: CN103789289A
Application number: CN201410029501.2A
Authority: CN
Inventors: 熊海容; 王亚伟; 钱国岗
Original assignee: HUBEI HUILONG FOOD Co Ltd
Current assignee: HUBEI HUILONG FOOD Co Ltd
Priority date: 2014-01-22
Filing date: 2014-01-22
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2034-01-22
Also published as: CN103789289B

Abstract

本发明提供了一种耐碱高温甘露聚糖酶ManB的优化基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，该基因可在毕赤酵母表达系统中高效表达，从而制得耐碱高温甘露聚糖酶ManB，该酶在饲料添加剂、保健食品、造纸、洗涤、医药等领域具有广阔的应用前景。本发明还提供了一种含有该优化基因的重组表达质粒，以及一种生产该耐碱高温甘露聚糖酶ManB的毕赤酵母重组菌株。该菌株所分泌的甘露聚糖酶ManB在发酵液中的蛋白质含量达到电泳纯级别，几乎不需要纯化，降低生产成本。

Description

一种耐碱高温甘露聚糖酶ManB的制备方法及其基因和应用

技术领域

本发明提供了一种耐碱高温甘露聚糖酶ManB，以及其编码基因序列重排与优化，包含该酶基因的重组表达载体，及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

甘露聚糖是半纤维素家族的重要成分之一，分为以下四个亚类：直链甘露聚糖，葡甘露聚糖，半乳甘露聚糖，半乳葡甘露聚糖。它们由甘露糖或甘露糖与葡萄糖组合以β-1,4-糖苷键形成骨架，另外半乳糖会以α-1,6-糖苷键连接于骨架上作为侧链。甘露聚糖是软木中半纤维素成分的主要组分，并广泛分布于植物组织中，如角豆胶，魔芋和瓜尔豆胶等。

β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78）是水解β-1,4-D-吡喃甘露糖为主链的内切水解酶，作用底物主要是甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、以及半乳葡甘露聚糖。β-甘露聚糖酶主要属于糖苷水解酶类第5和26家族，少部分属于第113家族，其中第5家族又分为8个亚类，β-甘露聚糖酶属于第7和8亚类，分别来源于真核生物和细菌，这两个亚类成员之间的序列相似性低于20%（Larsson AM,et al.Three-dimensional crystalstructure and enzymic characterization of beta-mannanase Man5A from blue mussel Mytilusedulis.Journal of Molecular biology2006,357:1500-1510.）。

随着β-甘露聚糖酶的深入研究，其应用领域也在不断的扩展，并拥有一个广泛的工业酶应用市场，包括食品和饲料，咖啡萃取，生物乙醇生产，杀粘菌剂，制药，纺织，洗涤，造纸，石油，天然气工业，及生物技术等领域。在食品和医疗领域，作为甘露聚糖丰富来源的魔芋粉、角豆胶和瓜尔豆胶等被甘露聚糖酶降解为甘露寡糖后，能够代替蔗糖作为食品添加剂，降低血糖，维持胆固醇平衡，增加肠道益生菌，并促进其生长和繁殖。动物的植物性饲料中添加甘露聚糖酶能破坏细胞壁释放密封的能增高肠壁绒毛的营养物质，水解饲料中甘露聚糖等抗营养因子，降低饲料粘度，从而达到改善饲料吸收率的目的。在纸浆漂白的过程中需要除去木质素，使用甘露聚糖酶不仅能去除该杂质，同时又减少污染。软木是纸浆的主要来源，含有15～20%主要成分为半乳甘露聚糖的半纤维素。这就使得具有该成分特异性的甘露聚糖酶成为软木纸浆漂白的最佳选择。树胶中的甘露聚糖通常被用作冰激凌、调味酱、发胶、护发素等的增稠剂，而甘露聚糖倾向于吸附衣物纤维，因此很难去除含有甘露聚糖的污渍，采用含有耐碱甘露聚糖酶的洗涤剂则可以将其水解为易溶的小分子，使衣物等易漂洗。在石油和天然气工业中，甘露聚糖酶作为钻探过程中的优质生物破胶剂，具有成本低，破坏小，效率高等优点。甘露聚糖酶是天然多糖结构分析和植物细胞破壁的良好工具酶，生成具有增殖双歧杆菌生理功效的低聚糖（Chauhan PS,et al.Mannanases:microbial sources,production,properties andpotential biotechnological applications.Applied Microbiology and Biotechnology2012,93:1817-1830.）。

来源于细菌的甘露聚糖酶普遍比来源于真菌的甘露聚糖酶具有更高的稳定性，将来源于细菌的甘露聚糖酶基因经序列优化后应用于可高密度培养的毕赤酵母，更适宜于工业化生产。本发明中，来源于褐色高温单孢菌Thermomonospora Fusca的甘露聚糖酶1BQC由具有较优良的酶学性质（Hilge M,et al.High-resolution native and complexstructures of thermostable beta-mannanase from Thermomonospora fusca-substratespecificity in glycosyl hydrolase family5.Structure.1998,6(11):1433-1444.），属于糖苷水解酶类第5家族，其基因大小为906bp，氨基酸序列大小为302aa，预测其分子量为33.1kDa，其结晶体三维结构等研究深入，便于进行体外突变等进一步研究，且具有宽广的pH耐受范围。

发明内容

本发明提供了一种耐碱高温甘露聚糖酶ManB的优化基因，该基因可在毕赤酵母表达系统中高效表达，从而制得耐碱高温甘露聚糖酶ManB，该酶在饲料添加剂、保健食品、造纸、洗涤、医药等领域具有广阔的应用前景。

本发明所提供的耐碱高温甘露聚糖酶ManB的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种含有该优化基因的重组表达质粒。

本发明还提供了一种生产该耐碱高温甘露聚糖酶ManB的毕赤酵母重组菌株。

为实现本发明上述目的，本发明中所采用的耐碱高温甘露聚糖酶ManB的制备方法的步骤如下：

（1）、在不改变甘露聚糖酶1BQC的氨基酸序列的条件下，对其进行基因重排和优化密码子，去除毕赤酵母稀有密码子，并提高mRNA的二级结构稳定性，获得优化的甘露聚糖酶ManB基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；（2）、将步骤（1）中甘露聚糖酶ManB基因的5'端和3'端位置分别设计EcoR I和Not I酶切位点，完成全基因合成后插入表达载体pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K-ManB；（3）将步骤（2）中重组质粒pPIC9K-ManB采用Dra I线性化该重组质粒后，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，并筛选获得产酶最高的重组毕赤酵母菌株ManB-GS115；（4）将步骤（3）中重组毕赤酵母菌株ManB-GS115接种于毕赤酵母发酵培养基，并维持甲醇诱导产酶，从而获得甘露聚糖酶ManB。

步骤（2）和步骤（4）中所述的甘露聚糖酶ManB被分泌至胞外培养液中。

本发明中与现有技术相比，具有以下优点：首先依据PDB中发表的来源于褐色高温单孢菌Thermomonospora Fusca的甘露聚糖酶1BQC氨基酸序列（SEQ ID NO.2）与Thermomonospora Fusca YX基因组序列（CP000088.1：3,642,249bp）中预测甘露聚糖酶（AAZ54938.1）的氨基酸序列相似性高达99%，本发明为了提高甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达效率，在不改变甘露聚糖酶1BQC氨基酸序列情况下，对预测甘露聚糖酶（AAZ54938.1）基因序列（SEQ ID NO.3）进行序列重排与密码子优化并提高mRNA二级结构稳定性，从而获得优化的甘露聚糖酶ManB基因（SEQ ID NO.1）。

本发明首先解决来源于细菌的耐碱高温甘露聚糖酶基因在真核表达系统中因密码子偏爱性所导致的表达效率降低，提供了一种性质优良目前全球尚未被用于毕赤酵母表达的甘露聚糖酶ManB，对葡甘露聚糖具有较强的降解能力，如角豆胶，而对半乳甘露聚糖的降解能力稍差，如魔芋粉。该酶在碱性条件下具有较强的稳定性，最适pH为9.0，在pH6.0～10条件下处理30min后仍能维持70%以上相对酶活力，最适温度为70℃，在40～60℃下处理30min维持90%以上相对酶活力，针对工业应用中常出现的中高温及碱性环境具有较强的适应能力。

二、本发明所提供的含有优化的甘露聚糖酶ManB基因的重组表达质粒pPIC9K-ManB中包括：优化的甘露聚糖酶ManB基因，终止子序列，及5′端和3′端限制性内切酶位点EcoR I和Not I。

三、本发明所使用宿主菌为巴斯德毕赤酵母GS115，适度糖基化修饰表达的外源蛋白质，并促使蛋白质的正确折叠，能够有效的提高该酶的半衰期。经过N-糖基化分析预测该酶仅有一个糖基化位点，同时，SDS-PAGE结果显示甘露聚糖酶ManB的分子量大小约为34kD，而预测该酶的分子量为33.1kD，表明该酶不存在过度修饰，增加该酶与底物的亲和力。本发明中参考Invitrogen毕赤酵母表达手册，提取步骤（2）中阳性克隆菌株内的重组表达质粒pPIC9K-ManB，以限制性内切酶Dra I线性化后，电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，采用遗传霉素G418浓度梯度法增加选择压力和相对酶活力检测等方法，筛选出多拷贝高效表达甘露聚糖酶ManB的重组毕赤酵母菌株ManB-GS115，该菌株所分泌的甘露聚糖酶ManB在发酵液中的蛋白质含量达到电泳纯级别，几乎不需要纯化，降低生产成本。

附图说明

图1为优化的甘露聚糖酶ManB基因重组质粒pPIC9K-ManB示意图；

图2来源于Thermomonospora Fusca甘露聚糖酶基因的mRNA核心二级结构模式图；

图3甘露聚糖酶ManB基因的mRNA核心二级结构模式图；

图4重组毕赤酵母ManB-GS115发酵液的SDS-PAGE分析；

图5甘露聚糖酶ManB的最适温度；

图6甘露聚糖酶ManB的热稳定性；

图7甘露聚糖酶ManB的最适pH；

图8甘露聚糖酶ManB的pH稳定性；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。

实验材料：

1）菌株和质粒：大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α和毕赤酵母GS115获赠于中国农业科学院饲料研究所；pPIC9K分泌型表达载体购自Invitrogen公司。

2）酶和试剂盒：限制性内切酶、Taq酶、Pyrobest DNA聚合酶、T4DNA连接酶等工具酶购TaKaRa公司；DNA纯化试剂盒购自爱思进生物技术有限公司。

3）生化试剂：G418购自Invitrogen公司；蛋白质分子量标准购自上海生物化学研究所；IPTG、X-Gal、SDS及角豆胶购自Sigma公司；TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺为国药试剂。

50mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：取7.10g磷酸氢二钠溶解于800mL双蒸水，用柠檬酸调节pH为4.0～7.5范围内任一值后，定容至1L。

50mM Tris-HCl缓冲液：取6.06g Tris溶解于800mL双蒸水，用1M HCl节pH至7.5～9.0范围内任一值后，定容至1L。

50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液：取7.50g甘氨酸溶解于800mL双蒸水，用1M氢氧化钠溶液调pH至9.0～12范围内任一值后，定容至1L。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1：优化的甘露聚糖酶ManB基因序列的获得

依据序列比对，来源于褐色高温单孢菌Thermomonospora Fusca甘露聚糖酶1BQC（PDB:1BQC_A）的氨基酸序列与预测甘露聚糖酶（AAZ54938.1）氨基酸序列相似性高达99%。该预测甘露聚糖酶（AAZ54938.1）基因序列是Thermomonospora Fusca YX基因组序列（CP000088.1：3,642,249bp）中一段基因序列（1,061,327→1,062,232bp）（如SEQ ID NO.3所示）。

基于巴斯德毕赤酵母密码子使用偏好性，将其中稀有密码子转换为高频表达密码子，同时对照甘露聚糖酶1BQC的氨基酸序列，对预测甘露聚糖酶（AAZ54938.1）基因序列进行密码子优化，获得优化后甘露聚糖酶ManB基因序列，如图1所示。

采用RNAfold web server（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi）分析预测甘露聚糖酶（AAZ54938.1）基因与优化的甘露聚糖酶ManB基因的mRNA折叠最小自由能，两者的mRNA二级结构分别如图2及图3所示。

结果显示，预测甘露聚糖酶（AAZ54938.1）基因的mRNA折叠后最小自由能为△G=-385.70kcal/mol，优化的甘露聚糖酶ManB基因mRNA折叠后最小自由能为△G=-362.50kcal/mol，另外两者GC含量分别为65.67%和63.02%。由此表明优化的甘露聚糖酶ManB基因mRNA的二级结构自由能绝对值变小，说明了经密码子优化后基因的mRNA二级结构稳定性有一定程度的提高，更加有利于翻译的顺利进行。

实施例2：含有优化的甘露聚糖酶ManB基因的重组表达质粒pPIC9K-ManB的构建

在优化的甘露聚糖酶ManB基因3′端添加毕赤酵母偏好的终止子序列，并在5′端和3′端分别引入限制性内切酶EcoR I和Not I位点，将该基因序列交与武汉擎科创新生物科技有限公司完成全基因合成。

采用限制性内切酶EcoR I和Not I完成优化的甘露聚糖酶ManB基因和分泌型表达载体pPIC9K双酶切，再使用连接酶将两者连接，构建重组表达质粒pPIC9K-ManB。将该重组表达质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，以PCR验证法筛选出阳性克隆菌株pPIC9K-ManB-DH5α。

实施例3：高效分泌表达甘露聚糖酶ManB的毕赤酵母基因工菌株的构建

采用LB液体培养基活化培养菌株pPIC9K-ManB-DH5α，提取重组质粒pPIC9K-ManB。采用限制性内切酶Dra I线性化该重组质粒，并回收酶切产物。参考EasySelect^TM Pichia Expression Kit制备毕赤酵母GS115感受态细胞。取约10μg线性化质粒与80μL的感受态细胞轻柔混匀后置于冰上15min，转移至预冷的0.2cm电转杯中，1500V电击完成后立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，在30℃培养箱中静置1h，涂布于MD平板上，于30℃倒置培养约48h至转化子出现。

挑取单菌落按相应编号依次分别接种于含0.25，0.5，1.0，2.0，3.0和4.0mg/mL G418的MD平板上，于30℃倒置培养约48h至单菌落出现。筛选抗性最强的重组菌株，接种于相应编号的含有3mL BMGY培养基中，30℃，200rpm摇床培养约48h，至OD₆₀₀达1.8～6.0。收集菌体，重悬于1mL BMMY培养基，0.5%甲醇诱导培养约48h。

收集上清液，采用DNS法检测酶活力以筛选产酶量较高的阳性重组菌株ManB-GS115。

实施例4：毕赤酵母基因工程菌ManB-GS115的发酵罐高密度发酵

采用毕赤酵母基因工程菌ManB-GS115在10升发酵罐中高密度发酵生产甘露聚糖酶。发酵过程具体如下：

1）种子液制备阶段。将保存的毕赤酵母基因工程菌ManB-GS115接种于YPD培养基，30℃，200rpm摇床培养约8h，获得种子液。

2）发酵前期培养阶段。以2%接种量将种子液接入BSM无机盐甘油培养基，接种前使用氨水调节pH至5.5，通气搅拌培养，在培养过程中随着菌株的生长，培养基中的溶氧量由100%逐渐降低。当碳源消耗完后溶氧量会再度升高，当溶氧升高至80%以上时，开始碳源流加补料发酵阶段。

其中，BSM培养基由以下成分组成：85%H₃PO₄26.7mL/L，CaSO₄·2H₂O0.93g/L，K₂SO₄18.2g/L，MgSO₄·2H₂O14.9g/L，KOH4.13g/L，甘油40g/L，PMT14.0mL/L。所述PMT1配方：CuSO₄·5H₂O6.0g/L，KI0.088g/L，MnSO₄·H₂O3.0g/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.2g/L，H₃BO₃0.02g/L，CoCl₂·6H₂O0.5g/L，ZnCl₂20.0g/L，FeSO₄·7H₂O65.0g/L，Biotin0.2g/L，浓H₂SO₄5.0mL/L（过滤除菌）。

3）流加补料发酵阶段。流加40%甘油溶液(含12mL/L PTM1)，同时控制溶氧在60%左右，至菌体湿重达130g/L时，停止甘油补料。

4）诱导表达阶段。流加甲醇（含12mL/L PTM1）诱导产酶，同时调节甲醇补料速度将溶氧维持在30%左右，检测甘露聚糖酶活力不再升高时即可停止诱导。

检测结果显示，发酵液的蛋白质浓度为0.3mg/mL。在65O的反应温度下，甘露聚糖酶ManB活力为1649U/mL，比活力为493.81U/mg。发酵液经SDS-PAGE检测，结果显示，发酵液中甘露聚糖酶ManB的蛋白质含量达到电泳纯级别，分子量大小约为34kD，如图4所示。

实施例5：甘露聚糖酶ManB的性质分析

1）甘露聚糖酶ManB最适温度的测定：采用DNS法检测该甘露聚糖酶最适温度，pH5.5缓冲液下与0.6%角豆胶溶液分别在不同温度下反应15min，加入2.5mL DNS试剂，沸水浴5min，冷却至室温，加水定容至12.5mL。于分光光度计中检测OD₅₄₀。以最高酶活力为100%，计算其他条件下的相对残余酶活力。结果显示，甘露聚糖酶ManB最适反应温度为70O，在65O～80O下甘露聚糖酶ManB能够保持60%以上的相对酶活力，如图5所示。

2）甘露聚糖酶ManB热稳定性的测定：于pH6.5下将酶液在不同温度下准确处理30min，迅速置于冰上冷却。于65O，pH6.5下反应，检测OD₅₄₀。结果显示，甘露聚糖酶ManB在40～60O下处理30min后仍能维持90%以上相对酶活力，在65O条件下处理30min后维持74%相对酶活力，如图6所示。

3）甘露聚糖酶ManB最适pH的测定：65O时，甘露聚糖酶ManB在不同pH缓冲液条件下准确反应15min，测定OD₅₄₀。结果显示，甘露聚糖酶ManB最适pH为9.0，在pH6.0～7.5和9.0～10范围内均能保持60%以上的相对酶活力，另外该酶在pH7.5～9.0范围内对具有50%以上的相对酶活力，表明其对Tris-HCl缓冲液较为敏感，如图7所示。

4）甘露聚糖酶ManB pH稳定性的测定：于37O下，将酶液在不同pH缓冲液中准确处理30min，迅速置于冰上冷却。于65℃，pH6.5下反应，检测OD₅₄₀。结果显示，甘露聚糖酶ManB在pH6.0～10条件下处理30min后仍能维持70%以上相对酶活力，如图8所示。

Claims

1.一种耐碱高温甘露聚糖酶ManB的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）、在不改变甘露聚糖酶1BQC的氨基酸序列的条件下，对其进行基因重排和优化密码子，去除毕赤酵母稀有密码子，并提高mRNA的二级结构稳定性，获得优化的甘露聚糖酶ManB基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；（2）、将步骤（1）中甘露聚糖酶ManB基因的5'端和3'端位置分别设计EcoR I和Not I酶切位点，完成全基因合成后插入表达载体pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K-ManB；（3）将步骤（2）中重组质粒pPIC9K-ManB采用Dra I线性化该重组质粒后，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，并筛选获得产酶最高的重组毕赤酵母菌株ManB-GS115；（4）将步骤（3）中重组毕赤酵母菌株ManB-GS115接种于毕赤酵母发酵培养基，并维持甲醇诱导产酶，从而获得甘露聚糖酶ManB。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）和步骤（4）中所述的甘露聚糖酶ManB被分泌至胞外培养液中。

3.权利要求1中所述的优化的甘露聚糖酶ManB基因，其特征在于：其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

4.权利要求1中所述的含有优化的甘露聚糖酶ManB基因的重组表达质粒pPIC9K-ManB。

5.权利要求1所述的重组毕赤酵母菌株ManB-GS115。

6.权利要求1所述的耐碱高温甘露聚糖酶ManB，在饲料、食品、造纸、洗涤和医药中的应用。