CN103146724A - 一种重组甘露聚糖酶及其基因工程菌和水解制备甘露寡糖的方法 - Google Patents
一种重组甘露聚糖酶及其基因工程菌和水解制备甘露寡糖的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出了一种重组甘露聚糖酶及其基因工程菌和水解制备甘露寡糖的方法，其步骤为：1）根据毕赤酵母密码子偏爱性，优化重组β-甘露聚糖酶基因；2）构建含有重组β-甘露聚糖酶基因的表达载体pHBM905BDM-Man，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，培养验证得单拷贝基因工程菌；3）构建培养验证多拷贝的基因工程菌；4）用不同拷贝数的基因工程菌高效表达制备重组β-甘露聚糖酶；5）用重组β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖底物生产甘露寡糖，底物水解浓度15-40%，温度50-55℃，时间0.5-2小时。目前，两拷贝β-甘露聚糖酶基因工程菌GS115/MAN78（CCTCCNo：2012554）表达水平较高。本发明重组β-甘露聚糖酶活性高达5000U/mL（DNS法），水解底物特异性高，水解底物浓度明显高于其他方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种编码重组的β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株的构建以及利用毕赤酵母表达甘露聚糖酶的方法，同时，利用该重组甘露聚糖酶水解高浓度甘露聚糖制备甘露寡糖的方法，在工业生产中无需调节PH，操作简单，能够降低生产成本，缩短工艺流程，简化后续处理步骤。
背景技术
甘露低聚糖是由2一10个单糖分子通过糖苷键连接而成的低度聚合糖，可以有效促进生物体内以双歧杆菌为代表的肠道有益菌群的特异性增殖，并具有抑制体内病原菌生长、减少有毒代谢产物产生、防止便秘、保护肝脏、抗肿癌及增强机体免疫力等多种生理功能。此外，低聚甘露糖还具有不被人体降解、低甜度、不引发龋齿、不增加血糖浓度等特点，是新一代功能性食品。
近年来，关于低聚糖的研究越来越多，已有多种功能性低聚糖产品投入市场，但目前大多数低聚糖产品属于普通型的低聚糖，有效成分不足50％。欧美等国因限于资源，主要采用化学合成方法和从酵母细胞壁分离提取甘露低聚糖，其中酵母发酵法成本低，污染少，但它们的产品纯度低、性能差。为了提高产品纯度，必须在后续工艺中使用操作复杂成本过高的提纯工序，例如离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法等。酵母发酵法生产的关键是甘露聚糖酶。如何寻找高活力的甘露聚糖酶，使水解的效率提高，使产品的纯度提高，使后续提纯工序简单有效，能低成本地生产高纯度低聚糖，显得尤为重要。
甘露聚糖酶，是一类能够水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及半乳葡萄甘露聚糖的内切酶，能水解植物胶(如角豆胶、瓜儿豆胶和魔芋等)生成低聚甘露糖。甘聚聚糖酶广泛存在于自然界中，在动物、植物和微生物体内有该酶的存在，而微生物是其主要来源。芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌、真菌中的曲霉、青霉、酵母菌和放线菌中的链霉菌都是产甘露聚糖酶的常见菌群。国内现在有许多相关科研单位，如中科院微生物研究所，南开大学等广泛进行了甘露聚糖酶及其相关内容的研究，但所报道的发酵酶活性不高，酶解产物纯度低，生产成本高，难以工业化。
魔芋是我国南方地区的特有经济作物，其主要成分为葡甘聚糖，在西南贫困山区产量很高，目前在国内主要作为一种粗纤维食粮或作为食品添加剂，附加值不高。将魔芋利用甘露聚糖酶经酶法水解制成甘露低聚糖，有很好的市场前景。在生产中的一般甘露聚糖酶活性差，水解效率低，底物浓度低，不能适应生产的要求。
发明内容
本发明的目的是运用基因工程手段寻找毕赤酵母偏爱密码，构建重组的β-甘露聚糖酶基因，实现甘露聚糖酶的高效稳定表达，同时利用表达的重组β-甘露聚糖酶水解高浓度甘露聚糖制备甘露寡糖。
本发明是这样实现的。本发明的步骤为：
一、重组β-甘露聚糖酶基因的合成
在氨基酸序列不改变的前提下，对原始的β-甘露聚糖酶基因的核苷酸序列利用DNAWORKS工具进行优化，优化后的基因全部由毕赤酵母偏爱密码组成。优化后的核苷酸序列与原始基因的核苷酸序列(GeneBankTM accession XM_001390670.1)相比，有257个核苷酸发生变化，核苷酸的同源性为76％。同时为了使β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中能够高效稳定的分泌表达，优化后的β-甘露聚糖酶基因少了编码5’端信号肽序列的20个氨基酸。
优化前的序列：
atgaagcttt ccaacgccct cctcaccctg gctagcctgg cgctggccaa cgtctccacg 60
gctctgccga aagcctcccc tgcaccgagc accagcagca gtgctgcctc cacctccttc 120
gccagcacct ccggcctcca attcaccatt gatggcgaaa ctggctactt cgccggaacg 180
aacagctact ggatcggttt cctcactgac aacgcggacg tcgacctcgt catgggccac 240
ctgaagtcgt ccggcctcaa gatcctccgc gtgtggggct tcaacgatgt cacctcgcag 300
ccctcctccg gcacagtctg gtaccaactg caccaggacg gcaaatcgac aatcaacacg 360
ggtgccgacg gtctccagcg cctcgactac gtcgtctcgt ctgccgaaca gcacgacatc 420
aaactcatca tcaacttcgt caactactgg accgattacg gtggtatgtc tgcgtacgtg 480
agcgcgtatg gcggatccgg cgagacggat ttctatacca gtgataccat gcagagtgcc 540
tatcagacat atatcaagac ggtcgtggag cggtacagta actcctcggc ggtgtttgcg 600
tgggagttgg cgaatgagcc gagatgtccg agttgcgata cttctgtgtt gtataactgg 660
attgagaaga cgagtaagtt tattaagggg ttggatgcgg atcgtatggt ttgtattggt 720
gatgagggct tcggtctcaa catcgactcg gacggcagct acccttatca attctccgag 780
ggcttgaact ttacgatgaa cctcggtatc gatactattg actttggtac cctccacttg 840
taccctgata gctggggcac ctccgacgac tggggcaacg gctggatcac cgcccacggc 900
gcagcctgca aagcggccgg caagccatgt ctcctggagg aatacggagt cacctcgaac 960
cactgcagtg tggagggctc gtggcagaag acagcgctca gcacaacggg cgtcggcgcg 1020
gatctgttct ggcagtatgg tgatgatttg agtaccggga agtcgccgga tgatgggaat 1080
actatctact atgggactag tgattatcag tgcctggtga cggatcatgt tgctgctatt 1140
ggtagtgctt aa 1152
优化后的序列为：
atgttgccaa aggcttctcc agccccatcc acttcttcta gtgccgcctc tacatctttt 60
gcatctactt ctggcttgca gtttactatt gatggtgaaa ctggttattt tgctggtact 120
aactcttact ggattggttt tttgactgat aacgctgatg ttgatttggt catgggtcat 180
ttgaagtctt caggattgaa gattttgaga gtttggggtt ttaacgatgt cacttctcaa 240
ccatctagtg gtactgtttg gtatcaacta catcaggatg gcaagtctac tattaacaca 300
ggtgctgacg gtttgcagag attggattac gttgtcagtt cagccgaaca gcacgatatc 360
aaacttatca taaacttcgt gaattattgg acagactacg gcggcatgtc tgcatacgtt 420
tctgcttacg gtggatctgg tgagactgat ttttacactt ctgacactat gcaaagtgct 480
taccagacct acattaagac agttgtcgag cgttactcta attcctctgc tgtttttgct 540
tgggaattgg ctaacgaacc aagatgtcct tcttgcgata cttcagtcct atataactgg 600
atcgagaaga cctctaagtt catcaagggc ttggacgccg atagaatggt ttgtattggt 660
gacgaaggtt ttggtttgaa tattgactcc gatggttctt acccatacca attctctgaa 720
ggtctgaact ttaccatgaa cctaggcata gatactatcg actttggaac tctgcacttg 780
tatccagatt catggggtac gtctgatgat tggggtaatg gctggatcac cgctcatgga 840
gccgcctgca aggcagctgg taaaccttgt ttgttggagg aatacggtgt aacatctaat 900
cactgttctg tggaaggttc ttggcagaag actgctttgt ctaccactgg tgtgggagct 960
gatttgtttt ggcagtacgg agacgatttg agtactggaa agtctcccga tgatggtaac 1020
acaatttact acggtacttc cgactatcag tgcttggtta cagatcatgt tgcagctatc 1080
ggttctgct 1089
优化后的甘露聚糖酶基因序列(Sbjct表示)与原始(Query表示)基因序列比较如下：(竖线表示上下对应的碱基相同，空格表示对应碱基不同)
然后根据优化序列设计引物，利用套叠PCR的方法合成该基因。设计的引物长度为40-50bp，相邻两引物之间有20bp左右重叠序列，Tm值为55-60℃，设计的引物序列为：
man-1
ATGTTGCCAAAGGCTTCTCCAGCCCCATCCACTTCTTCTAG
man-2TAGATGCAAAAGATGTAGAGGCGGCACTAGAAGAAGTGGATGGGGC 46
man-3GCCTCTACATCTTTTGCATCTACTTCTGGCTTGCAGTTTACTATTG 46
man-4CAGCAAAATAACCAGTTTCACCATCAATAGTAAACTGCAAGCCAGA 46
man-5GGTGAAACTGGTTATTTTGCTGCTACTAACTCTTACTCGATTGGTT 46
man-6ACATCAGCGTTATCAGTCAAAAAACCAATCCAGTAAGAGTTAGTAC 46
man-7TTTTGACTGATAACGCTGATGTTGATTTGGTCATGGGTCATTTGAA 46
man-8TCTCAAAATCTTCAATCCTGAAGACTTCAAATGACCCATGACCAAA 46
man-9TCTTCACGATTGAAGATTTTCACAGTTTCCGGTTTTAACGATGTCA 46
man-10ACAGTACCACTAGATGGTTGACAAGTGACATCGTTAAAACCCCAAA 46
man-11TCAACCATCTAGTGGTACTGTTTCGTATCAACTACATCAGGATGGC 46
man-12AGCACCTGTGTTAATAGTAGACTTGCCATCCTGATGTAGTTGATAC 46
man-13AGTCTACTATTAACACAGGTGCTGACGGTTTGCAGAGATTGGATTA 46
man-14GTCCTCTTCGCCTCAACTGACAACGTAATCCAATCTCTGCAAACCG 46
man-15AGTTCAGCCGAACAGCACGATATCAAACTTATCATAAACTTCGTGA 46
man-16CGCCGTAGTCTGTCCAATAATTCACGAAGTTTATGATAAGTTTGAT 46
man-17TATTGGACAGACTACGGCGGCATGTCTGCATACGTTTCTGCTTACG 46
man-18TAAAAATCAGTCTCACCAGATCCACCGTAAGCAGAAACGTATGCAG 46
man-19CGATCTGGTGACACTGATTTTTACACTTCTGACACTATGCAAAGTG 46
man-20CTGTCTTAATGTAGGTCTGCTAAGCACTTTGCATAGTGTCAGAAGT 46
man-21CTTACCAGACCTACATTAAGACAGTTGTCGAGCGTTACTCTAATTC 46
man-22AATTCCCAAGCAAAAACAGCAGAGGAATTAGAGTAACGCTCGACAA 46
man-23TGCTGTTTTTGCTTGGGAATTGGCTAACGAACCAAGATGTCCTTCT 46
man-24AGTTATATAGGACTGAAGTATCGCAAGAAGGACATCTTCGTTCGTT 46
man-25GCGATACTTCACTCCTATATAACTGGATCGAGAAGACCTCTAAGTT 46
man-26CTATCGGCGTCCAAGCCCTTGATGAACTTAGAGGTCTTCTCGATCC 46
man-27GGCTTGGACCCCGATAGAATGGTTTGTATTGGTGACGAAGGTTTTG 46
man-28AACCATCGGAGTCAATATTCAAACCAAAACCTTCGTCACCAATACA 46
man-29TTTCAATATTGACTCCGATCGTTCTTACCCATACCAATTCTCTCAA 46
man-30AGGTTCATGGTAAAGTTCACACCTTCAGAGAATTCGTATGGGTAAG 46
man-31GTCTGAACTTTACCATGAACCTACGCATAGATACTATCGACTTTGG 46
man-32AATCTGGATACAAGTGCAGAGTTCCAAAGTCGATAGTATCTATGCC 46
man-33ACTCTGCACTTGTATCCAGATTCATGGGGTACGTCTGATGATTGGG 46
man-34TCCATGAGCGGTGATCCAGCCATTACCCCAATCATCAGACGTACCC 46
man-35TGGATCACCGCTCATCGAGCCGCCTGCAAGGCAGCTGGTAAACCTT 46
man-36ATGTTACACCGTATTCCTCCAACAAACAAGGTTTACCAGCTGCCTT 46
man-37TGGAGGAATACGGTGTAACATCTAATCACTGTTCTGTGGAAGGTTC 46
man-38TGGTAGACAAAGCAGTCTTCTGCCAAGAACCTTCCACAGAACAGTG 46
man-39AGAAGACTGCTTTGTCTACCACTGGTGTGGGAGCTGATTTGTTTTG 46
man-40AGTACTCAAATCGTCTCCGTACTGCCAAAACAAATCAGCTCCCACA 46
man-41TACGGAGACGATTTGAGTACTGGAAAGTCTCCCGATGATGGTAACA 46
man-42ATAGTCGGAAGTACCGTAGTAAATTGTGTTACCATCATCGGGAGAC 46
man-43TTTACTACGGTACTTCCGACTATCAGTGCTTGGTTACAGATCATGT 46
man-44AGCAGAACCGATAGCTGCAACATGATCTGTAACCAAGCAC
man-45
AGCAGAACCGATAGCTGCAACAT
其中，引物man-1和man-45含有部分COP I和NOT I酶切位点，man-45添加了His标签序列和终止密码。(斜线标明)
将man-1到man-22引物加入一个反应体系中，引物之间互为模板进行退火，延伸，第一次PCR扩增，得到前段约600bp的甘露聚糖酶基因，命名为man-片段1，扩增条件为98℃10s，55℃15s，72℃1min，共30个循环，最后72℃7min。
反应体系为：
1ul(10umol/L)man-1+1ul(10umol/L)man-22
+1.5ul(1umol/L)man-2+1.5ul(1umol/L)man-3
+1.5ul(1umol/L)man-4+1.5ul(1umol/L)man-5
+1.5ul(1umol/L)man-6+1.5ul(1umol/L)man-7
+1.5ul(1umol/L)man-8+1.5ul(1umol/L)man-9
+1.5ul(1umol/L)man-10+1.5ul(1umol/L)man-11
+1.5ul(1umol/L)man-12+1.5ul(1umol/L)man-13
+1.5ul(1umol/L)man-14+1.5ul(1umol/L)man-15
+1.5ul(1umol/L)man-16+1.5ul(1umol/L)man-17
+1.5ul(1umol/L)man-18+1.5ul(1umol/L)man-19
+1.5ul(1umol/L)man-20+1.5ul(1umol/L)man-21
将man-23到man-44引物加入一个反应体系中，引物之间互为模板进行退火，延伸， 第二次PCR扩增，得到后段约600bp的甘露聚糖酶基因，命名为man-片段2，扩增条件为98℃10s，55℃15s，72℃1min，共30个循环，最后72℃7min。
反应体系为：
1ul(10umol/L)man-23+1ul(10umol/L)man-44
+1.5ul(1umol/L)man-24+1.5ul(1umol/L)man-25
+1.5ul(1umol/L)man-26+1.5ul(1umol/L)man-27
+1.5ul(1umol/L)man-28+1.5ul(1umol/L)man-29
+1.5ul(1umol/L)man-30+1.5ul(1umol/L)man-31
+1.5ul(1umol/L)man-32+1.5ul(1umol/L)man-33
+1.5ul(1umol/L)man-34+1.5ul(1umol/L)man-35
+1.5ul(1umol/L)man-36+1.5ul(1umol/L)man-37
+1.5ul(1umol/L)man-38+1.5ul(1umol/L)man-39
+1.5ul(1umol/L)man-40+1.5ul(1umol/L)man-41
+1.5ul(1umol/L)man-42+1.5ul(1umol/L)man-43
第三次PCR扩增，用前两次得到的PCR产物做模板，man-1、man-44为引物，得到几乎全长的甘露聚糖酶基因，命名为man片段3。扩增条件为98℃10s，55℃30s，72℃2min，共30个循环，最后72℃7min。
反应体系为：
1ul(10umol/L)man-1+1ul(10umol/L)man-44
+2ul man-片段1+2ul man-片段2
第四次PCR扩增，用第三次得到的PCR产物man片段3做模板，man-1、man-45为引物，得到全长的甘露聚糖酶基因，扩增条件为98℃10s，55℃30s，72℃2min，共30个循环，最后72℃7min。
反应体系为：
1ul(10umol/L)man-1+1ul(10umol/L)man-45+2ulman片段3
PCR产物回收，该重组β-甘露聚糖酶基因备用，命名该全长基因为Man。
二、含有重组β-甘露聚糖酶基因的表达载体的构建
本发明在现行商品化的毕赤酵母表达载体pPIC9k基础上，构建成利于外源蛋白表达的新载体pHBM905BDM。
其具体步骤为：
(1)、首先，将载体pPIC9k上的“Ampr+Ori”元件插入到HIS4基因序列中，使得外源基因整合入宿主基因组时缺乏抗性基因。这样操作是因为抗氨苄青霉素的表达盒式元件“Ampr”和在大肠杆菌中用于复制起始的元件“Ori”会随着目的基因表达盒一起整合到酵母基因组上去，如果抗性基因不慎泄露到环境中，可能会给环境的生物安全性带来一定的风险。而且由于“Ampr+Ori”元件随着目的基因表达盒一起整合到酵母基因组上去，线性片段太大，转化效率就大大降低。因为pPIC9K载体含有细菌来源的抗卡那抗生素的表达盒单元“kan”，赋予毕赤酵母G418抗性，所以现在一般用的都是用不同的G418抗性水平来筛选高拷贝转化子，但是这种筛选方法有缺陷：一是会造成假阴性，因为新转化的细胞需要时间表达足够量的抗G418的代谢产物，由于酵母生长比细菌慢得多，大部分重组酵母在积累足够多的抗G418的代谢产物以抵抗平板上抗生素之前就已经被杀死了；二是由于随着拷贝数的增加，酵母基因组上整合的“kan”的拷贝数也增加，如果“kan”泄露到环境中，可能会给环境的生物安全性带来一定的风险。所以我们将Kanr抗性基因作为填充片段插入到多克隆位点，并且在Kanr基因3’和5’端引入限制酶Not I和Cpo I识别位点，Kanr抗性基因在构建的重组载体中被切除。
(2)、其次，将d1+2×201AOX1启动子突变体(d1+2×201AOX1启动子突变体是将野生型AOX1启动子序列的-777到-712的序列缺失，并重复序列-203到-190的序列而得到的)替换(1)中已改造的载体上的AOX1启动子。
(3)、再次，根据酿酒酵母MFα-SS信号肽的氨基酸序列，利用DNAWorks在线软件，对其按照毕赤酵母密码子偏爱性进行序列优化，然后人工合成该信号肽的编码序列(MF4I-SS)。
MF4I-SS编码基因的合成引物：
MF4I-15’ATAATTGCGACTGGTTCCAATTGACAAGTTGTTGATCTTGACTACTT3’
MF4I-25’CTTAGATCTTCTCAAGTTATCGTTAAAAGTAGTCAAGATCAACAACTT3’
MF4I-35’ACGATAACTTGAGAAGATCTAACAACAACtaaCTGTTTGAAACTATGGCTA3’
MF4I-45’CTATAAAGATAGATGGAAATCTTGGAATAGCCATAGTTTCAAACAGTTAG3’
MF4I-55’CAAGATTTCCATCTATCTTTATAGCTGTCTTGTTTGCTGCATCTTCTG3’
MF4I-65’AGTAGTAGTGTTAACTGGAGCAGCCAAAGCAGAAGATGCAGCAAACAA3’
MF4I-75’GCTCCAGTTAACACTACTACTGAAGATGAAACTGCTCAAATTCCAGCT3’
MF4I-85’TTCCAAATCAGAGTAACCAATAACAGCCTCAGCTGGAATTTGAGCAGT3’
MF4I-95’ATTGGTTACTCTGATTTGGAAGGTGATTTTGATGTTGCTGTTTTGCCA3’
MF4I-105’TAACAAACCGTTGTTAGTAGAGTTAGAAAATGGCAAAACAGCAACATC3’
MF4I-115’CTCTACTAACAACGGTTTGTTAGAGGAAGCCGAGGCTGAAGCTGAACC3’
MF4I-125’AATAGAGGCAATAGTAGTATTAATGAACTTTGGTTCAGCTTCAGCCTC3’
MF4I-135’CATTAATACTACTATTGCCTCTATTGCTGCTAAGGAAGAAGGTGTTTC3’
MF4I-145’GCGCCGGACCGGGATCTTAATTCTACTTCCAAAGAAACACCTTCTTCCTTAGC3’
用软件DNAman对优化前后的核苷酸序列进行比对，结果如图，结果显示有54个核苷酸进行了突变，同源性为84.87％。
MFα-SS信号肽与MF4I-SS信号肽的编码序列比对结果见图4
改造的具体过程为，利用overlapping PCR方法，以14条引物相互为模板进行退火、延伸，经过25循环后，反应体系中会出现少量全长的目的片段。以该PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增，以得到更多350bp的目的片段。PCR产物经过V-gene凝胶回收试剂盒回收纯化后备用。
用MF4I-SS信号肽编码序列替换(2)中已改造的载体上的MFα-SS信号肽编码序列。
(4)最后，再将(3)中以改造的载体上的Xba I识别位点突变，然后在外源基因表达盒式结构的5’和3’端分别加上EcoR I+Xba I和Spe I+BamH I识别位点。构建成可用于人工体外串联重复表达盒式结构多拷贝的新重组载体pHBM905BDM。
将步骤一PCR回收的重组β-甘露聚糖酶基因Man用T4DNA聚合酶处理，然后定向插入到毕赤酵母重组表达载体pHBM905BDM上，获得重组质粒，命名为pHBM905BDM-Man。(见图1)
三、表达重组β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌的筛选
将pHBM905BDM-Man线性化，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，即可得到单拷贝数的重组菌株。
将获得的单拷贝数的重组菌株接种在含有0.5％魔芋粉的曲利本兰平板上，从中筛选出水解圈最大的菌株，提取转化子基因组，通过PCR的方法鉴定已经正确插入重组甘露聚糖酶基因的阳性克隆。
基于Biobrick方法，将载体pHBM905BDM经过反复的酶切和连接，即可得到多个拷贝表达盒式结构串联重复的重组质粒。随后，将其线性化，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，即可得到含有可控拷贝数的重组菌株。拷贝数n=2、3、4……，n为自然数。
经检测验证，d1+2×201AOX1启动子和MF4I-SS信号肽具有协同效应，两者联合作用，在提高外源蛋白表达量方面，比单独作用有更强的效果。同时，在一定范围内，随着拷贝数的提高，外源蛋白的表达水平也随着提高。
目前发现，两拷贝的重组甘露聚糖酶水解效果更好，酶活达5000U/ml。
将上述效果较好的两拷贝重组菌株，命名为毕赤酵母GS115/MAN78，简称MAN78。
将该基因工程菌于2012年12月27日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo：2012554，名称为毕赤酵母GS115/MAN78，(Pichia sp GS115/MAN78，)。保藏地址：中国.武汉.武汉大学。以下简称MAN78。
MAN78菌株的菌学特性形态特征：毕赤酵母属菌种细胞呈球形、椭圆形、拉长形，偶尔呈锥形，但不形成尖顶。菌落颜色为乳白色或奶油色，无性繁殖方式为多变芽殖。
生理生化特征：毕赤酵母能利用甲醇，石油，铵盐等特殊物质生长，最适生长温度为28℃-30℃.菌株MAN78除了具有毕赤酵母的生理生化特征外，其染色体上整合有重组β-甘露聚糖酶基因，能高效分泌表达β-甘露聚糖酶。
四、利用摇瓶发酵β-甘露聚糖酶
将菌株MAN78置于50mLBMGY(2％Tryptone，1％Yeast extract，0.34％YNB，1％(NH4)2SO4，100mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.0，1％甘油)培养基中，25℃-30℃150-250r/min培养40-50h，至OD600为6-10，于室温离心3000-6000r/min，5min，收集菌体；将菌体转移至50mL BMMY(2％Tryptone，1％Yeast extract，0.34％YNB，1％(NH4)2SO4，100mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.0)培养基中，25℃-30℃，150-250r/min培养，每隔12h补加一次甲醇(加量为培养基体积的0.5％)；表达时间24h-96h。取表达上清液分析表达水平，其中表达时间为72h时表达水平为最佳，所得上清液即为表达粗酶液。于500mL摇瓶发酵84h，用DNS法测甘露聚糖酶酶活高达5000U/mL。
五、利用该方法得到的高表达的重组甘露聚糖酶水解甘露聚糖制备甘露寡糖的方法：
设定水解底物浓度15％-40％，加入温度为50-55℃的100ml自来水作溶剂，一边少量添加底物，逐步递增底物的量达到预定的量，同时一边少量逐步添加酶液200ul-400ul(添加底物和酶量比例为1g∶20ul)，均匀搅拌，无需调节PH。
保持温度稳定(50-55℃)，直至水解浓度达40％即每100ml含40g瓜尔豆胶。水解率随酶 解时间的延长而逐渐提高，且加酶量和酶解时间对水解率的影响是相互关联的。为达到一定的水解率，加酶量越大，酶解时间越短：加酶量越少，酶解时间越长。本试验为了控制水解率在90％范围内，在100ml反应体系中，底物浓度30％，加酶量分别取200ul、400ul和600ul条件下，对应的酶解时间控制在2-1h，1.5h-1h，1h之内。水解完成后，将反应液进行离心去残渣，取上清过滤，超滤，进行真空喷雾干燥，即得甘露低聚糖成品，降解物纯度达90％。
本发明通过对基因的密码子优化，获得了极高表达的重组甘露聚糖酶(酶活达5000U/ml)且在酶系中占绝对优势地位，当底物为瓜尔豆胶时，水解底物浓度达40％，对其他底物，水解底物浓度达30％以上，无需调节PH。因此，其酶解产物纯度可高达90％以上，生产成本低，是功能低聚糖中的佳品。
本发明水解的底物：含有甘露聚糖的瓜尔豆胶，魔芋胶，刺槐豆胶，香豆胶，田菁胶等。
附图说明：
图1为毕赤酵母重组表达载体构建过程。首先，通过引物设计使用高保真酶扩增目的基因片段man后(见图中①)，回收，然后在dTTP存在的条件下，用T4 DNA聚合酶于12℃处理该片段20min（见图中②），生成粘性末端，同时将pHBM905BDM载体经限制性内切酶CopⅠ和NotⅠ依次酶切，产生两个带有固定碱基的单链粘性末端（见图中③），琼脂糖胶回收目的片段。最后，将双酶切后的pHBM905BDM载体和T4 DNA聚合酶处理后片段经SolutionⅠ连接酶16℃连接2h后，转化大肠杆菌DH10β菌株，氨苄青霉素抗性LB平板筛选转化子，经质粒大小比对、PCR鉴定以及酶切鉴定获得完整的重组质粒pHBM905BDM-Man（见图中④）。
图2为pHBM905BDM载体经过反复的酶切和连接，即可得到多个拷贝表达盒式结构串联重复的重组质粒的过程。
用质粒抽提试剂盒大量抽提 pHBM905BDM-Man质粒，然后用 EcoR I和 BamH I进行双酶切，37°C，90min，胶回收纯化约 6.5kb 大小的片段作为载体 b 备用(见图中①)。同时将 pHBM905BDM-Man质粒用 EcoR I和 Spe I双酶切，胶回收纯化约 2.5kb 的小片段，得到片段 1（见图中②）；再将 pHBM905BDM--Man质粒用 Xba I和 BamH I双酶切，胶回收纯化约 2.5kb的小片段，得到片段 2（见图中③）。随后，将线性化的载体 b与片段 1、片段 2按 3:1:1混合均匀，然后转化大肠杆菌 DH10β 感受态细胞，过夜培养，待平板上长出明显单菌落时，挑选转化菌落，小量提取质粒，以该质粒进行电泳检测和双酶切验证获得完整的2拷贝重组质粒（见图中④），构建更多拷贝的方法，依次类推。
图3为毕赤酵母表达甘露聚糖酶的SDS-PAGE检测。泳道M为蛋白质分子量标记，泳道1为GS-pHBM905BDM空载体诱导后样品，泳道2-4分别为酵母重组菌株GS-M78单拷贝诱导24 h、48 h、72 h的样品，5为毕赤酵母表达甘露聚糖酶用EndH处理后的样品。泳道6-8为酵母重组菌株GS-M78-两拷贝诱导24 h、48 h、72 h的样品。
图4为MFα-SS信号肽与 MF4I-SS信号肽的编码序列比对结果。
具体实施方式
下面以实例对本发明进一步说明：
实施例1：
1、按本发明方法的第一步构建重组β-甘露聚糖酶基因备用；
2、按本发明方法的第二步构建重组表达载体pHBM905BDM；
3、将pHBM905BDM质粒经限制性内切酶Cop I和Not I依次酶切，产生带有两个固定碱基单链粘性末端的载体，琼脂糖胶回收该载体；其次，根据已知man基因序列，采用GeneTool软件设计man-1：5’GTCA ATGTTGCCAAAGGCTTCTCCAGCCCCATCCACTTCTTCTAG3’和man-45：5‘GGCCATTAATGGTGATGGTGATGGTGAGCAGAACCGATAGCTGCAACAT3’两条引物，使用primerstarDNA聚合酶进行PCR扩增，得到man(1.1kb)基因片段，将该片段琼脂糖胶回收后，在dTTP存在的条件下，用T4DNA聚合酶12℃处理20min，生成与pHBM905BDM载体相配对的粘性末端，回收片段。然后将载体和片段经Solution I酶16℃连接2个小时后，转化至大肠杆菌DH10β感受态细胞，氨苄青霉素LB平板筛选转化子，经质粒大小比对、PCR鉴定及酶切鉴定获得重组质粒。随机挑选重组质粒送上海英俊生物技术有限公司测序，将测序结果正确的重组质粒命名为pHBM905BDM-Man。
接着，将重组质粒pHBM905BDM-Man用Sal I酶切线性化，回收后的酶切产物电击转化至Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，然后涂布组氨酸缺陷培养基MD平板，28℃培养3天，获得重组转化子。随机提取转化子基因组，以其为模板，以man-1和man-45为引物进行PCR鉴定，故扩增得到1.1kb产物的转化子即为阳性克隆。
4、将重组质粒pHBM905BDM-Man经过反复的酶切和连接，即可得到多个拷贝表达盒式结构串联重复的重组质粒。将不同拷贝数的重组质粒用Sal I酶切线性化，回收后的酶切产物电击转化至Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，然后涂布组氨酸缺陷培养基MD平板，28℃培养3天，获得不同拷贝数的重组转化子。拷贝数n=2、3、4……，n为自然数。
将验证正确的两拷贝重组克隆命名为毕赤酵母GS115/MAN78(Pichia sp GS115/MAN78，)，送保藏得保藏号为CCTCCNo：2012554。该重组质粒的构建流程(如图2)。
实施例2：
将构建的单拷贝和两拷贝的甘露聚糖酶重组菌株分别接种于50mL BMGY培养基中，28℃、200r/min培养48h，至OD600为6-9，于室温离心5000r/min，5min，收集菌体，随后，将菌体转移至50mL BMMY培养基中，28℃、200r/min培养，每隔12h补加一次甲醇(加量为培养基体积的0.5％)，经诱导表达后，分别取24h，48h，72h表达上清液进行SDS-PAGE电泳，分析不同时段的蛋白质表达水平。(见图3)。
实施例3：
利用实例2中摇瓶得到的重组甘露聚糖酶粗酶液，水解不同浓度甘露聚糖制备甘露寡糖。
原料：瓜尔豆胶
1)分别配制水解底物的浓度为10％，25％，30％，40％；
以温度为50-55℃的自来水作溶剂，加入适量瓜尔豆胶，搅拌，配制成底物浓度分别为10％，25％，30％，40％的反应液100ml，再按底物和酶液比例1g∶20ul，分别加入200ul、500ul、600ul、800ul的粗酶液。无需调节PH。
水解时间分别为约10、30、45、60分钟。
将反应液进行离心去残渣，取上清过滤，超滤，进行真空喷雾干燥，即得甘露低聚糖成品。
将反应液进行离心去残渣，取上清过滤，超滤，进行真空喷雾干燥，即得甘露低聚糖成品。
计算得率为90％左右。取少许干燥产物溶解于适量蒸馏水中，进行薄层或质谱鉴定，表明3到8糖的甘露低聚糖含量大于90％。
本发明表达的重组甘露聚糖酶水解底物特异性高，尤其对瓜尔豆胶水解浓度高达40％。本发明表达的重组甘露聚糖酶水解底物浓度明显高于其他方法。
本发明表达的重组甘露聚糖酶，在一定范围内，随着拷贝数的提高，外源蛋白的表达水平也随着提高。目前发现，两拷贝的重组甘露聚糖酶有较高活性，酶活达5000U/ml。
Claims (3)
1.一种重组甘露聚糖酶基因，其特征在于：
优化后的序列为：
atgttgccaa aggcttctcc agccccatcc acttcttcta gtgccgcctc tacatctttt 60
gcatctactt ctggcttgca gtttactatt gatggtgaaa ctggttattt tgctggtact 120
aactcttact ggattggttt tttgactgat aacgctgatg ttgatttggt catgggtcat 180
ttgaagtctt caggattgaa gattttgaga gtttggggtt ttaacgatgt cacttctcaa 240
ccatctagtg gtactgtttg gtatcaacta catcaggatg gcaagtctac tattaacaca 300
ggtgctgacg gtttgcagag attggattac gttgtcagtt cagccgaaca gcacgatatc 360
aaacttatca taaacttcgt gaattattgg acagactacg gcggcatgtc tgcatacgtt 420
tctgcttacg gtggatctgg tgagactgat ttttacactt ctgacactat gcaaagtgct 480
taccagacct acattaagac agttgtcgag cgttactcta attcctctgc tgtttttgct 540
tgggaattgg ctaacgaacc aagatgtcct tcttgcgata cttcagtcct atataactgg 600
atcgagaaga cctctaagtt catcaagggc ttggacgccg atagaatggt ttgtattggt 660
gacgaaggtt ttggtttgaa tattgactcc gatggttctt acccatacca attctctgaa 720
ggtctgaact ttaccatgaa cctaggcata gatactatcg actttggaac tctgcacttg 780
tatccagatt catggggtac gtctgatgat tggggtaatg gctggatcac cgctcatgga 840
gccgcctgca aggcagctgg taaaccttgt ttgttggagg aatacggtgt aacatctaat 900
cactgttctg tggaaggttc ttggcagaag actgctttgt ctaccactgg tgtgggagct 960
gatttgtttt ggcagtacgg agacgatttg agtactggaa agtctcccga tgatggtaac 1020
acaatttact acggtacttc cgactatcag tgcttggtta cagatcatgt tgcagctatc 1080
ggttctgct 1089
设计的引物序列为：
man-1GTCAATGTTGCCAAAGGCTTCTCCAGCCCCATCCACTTCTTCTAG
man-2TAGATGCAAAAGATGTAGAGGCGGCACTAGAAGAAGTGGATGGGGC 46
man-3GCCTCTACATCTTTTGCATCTACTTCTGGCTTGCAGTTTACTATTG 46
man-4CAGCAAAATAACCAGTTTCACCATCAATAGTAAACTGCAAGCCAGA 46
man-5GGTGAAACTGGTTATTTTGCTGGTACTAACTCTTACTGGATTGGTT 46
man-6ACATCAGCGTTATCAGTCAAAAAACCAATCCAGTAAGAGTTAGTAC 46
man-7TTTTGACTGATAACGCTGATGTTGATTTGGTCATGGGTCATTTGAA 46
man-8TCTCAAAATCTTCAATCCTGAAGACTTCAAATGACCCATGACCAAA 46
man-9TCTTCAGGATTGAAGATTTTGAGAGTTTGGGGTTTTAACGATGTCA 46
man-10ACAGTACCACTAGATGGTTGAGAAGTGACATCGTTAAAACCCCAAA 46
man-11TCAACCATCTAGTGGTACTGTTTGGTATCAACTACATCAGGATGGC 46
man-12AGCACCTGTGTTAATAGTAGACTTGCCATCCTGATGTAGTTGATAC 46
man-13AGTCTACTATTAACACAGGTGCTGACGGTTTGCAGAGATTGGATTA 46
man-14GTGCTGTTCGGCTGAACTGACAACGTAATCCAATCTCTGCAAACCG 46
man-15ACTTCAGCCCAACAGCACCATATCAAACTTATCATAAACTTCCTGA 46
man-16CGCCCTAGTCTCTCCAATAATTCACGAAGTTTATCATAAGTTTGAT 46
man-17TATTCGACAGACTACGGCGGCATGTCTGCATACGTTTCTGCTTACG 46
man-18TAAAAATCAGTCTCACCAGATCCACCGTAAGCAGAAACGTATGCAG 46
man-19GGATCTGGTGAGACTGATTTTTACACTTCTGACACTATGCAAAGTG 46
man-20CTGTCTTAATGTACGTCTGCTAAGCACTTTGCATAGTGTCAGAAGT 46
man-21CTTACCAGACCTACATTAAGACAGTTGTCGAGCGTTACTCTAATTC 46
man-22AATTCCCAAGCAAAAACAGCAGAGGAATTAGAGTAACGCTCGACAA 46
man-23TGCTGTTTTTGCTTGGGAATTGGCTAACGAACCAAGATGTCCTTCT 46
man-24AGTTATATAGGACTGAAGTATCGCAAGAAGGACATCTTGGTTCGTT 46
man-25CCCATACTTCACTCCTATATAACTGCATCGAGAAGACCTCTAAGTT 46
man-26CTATCCGCGTCCAAGCCCTTGATGAACTTAGACGTCTTCTCGATCC 46
man-27GGCTTCGACGCCGATAGAATGGTTTGTATTGGTGACGAAGGTTTTG 46
man-28AACCATCGGAGTCAATATTCAAACCAAAACCTTCGTCACCAATACA 46
man-29TTTGAATATTGACTCCGATGGTTCTTACCCATACCAATTCTCTGAA 46
man-30ACGTTCATGCTAAAGTTCACACCTTCAGAGAATTCGTATGCGTAAG 46
man-31GTCTGAACTTTACCATGAACCTAGGCATAGATACTATCGACTTTGG 46
man-32AATCTCGATACAAGTGCAGAGTTCCAAAGTCGATAGTATCTATGCC 46
man-33ACTCTGCACTTGTATCCAGATTCATGGGGTACGTCTGATGATTGGG 46
man-34TCCATGAGCGGTGATCCAGCCATTACCCCAATCATCAGACGTACCC 46
man-35TCCATCACCCCTCATGGAGCCGCCTCCAACGCAGCTCGTAAACCTT 46
man-36ATGTTACACCGTATTCCTCCAACAAACAAGGTTTACCAGCTGCCTT 46
man-37TGGAGGAATACGGTGTAACATCTAATCACTGTTCTGTGGAAGGTTC 46
man-38TGGTAGACAAAGCAGTCTTCTGCCAAGAACCTTCCACAGAACAGTG 46
man-39AGAAGACTGCTTTGTCTACCACTGGTGTGGGAGCTGATTTGTTTTG 46
man-40AGTACTCAAATCGTCTCCGTACTGCCAAAACAAATCAGCTCCCACA 46
man-41TACGGAGACGATTTGAGTACTGGAAAGTCTCCCGATGATGGTAACA 46
man-42ATAGTCGGAAGTACCGTAGTAAATTGTGTTACCATCATCGGGAGAC 46
man-43TTTACTACGGTACTTCCGACTATCAGTGCTTGGTTACAGATCATGT 46
man-44AGCAGAACCGATAGCTGCAACATGATCTGTAACCAAGCAC
man-45GGCCATTAATGGTGATGGTGATGGTGAGCAGAACCGATAGCTGCAACAT
利用套叠PCR的方法合成该重组β-甘露聚糖酶基因，设计的引物长度为40-50bp，相邻两引物之间有20bp左右重叠序列，Tm值为55-60℃。
2.一种表达重组甘露聚糖酶的基因工程菌GS115/MAN78(Pichia sp GS115/MAN78，)，保藏号CCTCCNo：2012554。
3.一种重组甘露聚糖酶水解制备甘露寡糖的方法，其特征在于步骤为：
底物为含有甘露聚糖的瓜尔豆胶，或魔芋胶，或刺槐豆胶，或香豆胶，或田菁胶；
底物配制时，在温度为50-55℃的自来水中一边少量添加底物，同时一边少量逐步添加重组甘露聚糖酶酶液，底物和酶量比例为1g∶20ul，逐步递增底物的量达到预定的浓度，均匀搅拌，无需调节PH；
水解底物浓度15％40％质量体积百分比，温度为50-55℃，时间0.5-2h，水解完成后，将反应液进行离心去残渣，取上清过滤，超滤，进行真空喷雾干燥，即得甘露低聚糖成品，降解物纯度达90％；
所加的重组甘露聚糖酶是利用权利要求2所述的保藏号CCTCCNo：2012554的基因工程菌GS115/MAN78表达制备的粗酶液。
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|---|---|
| CN (1) | CN103146724B (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103468766A (zh) * | 2013-09-18 | 2013-12-25 | 恩施天天佳生物科技有限公司 | 一种高纯度甘露低聚糖的制备方法 |
| CN103725621A (zh) * | 2013-11-27 | 2014-04-16 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种重组表达甘露聚糖酶的工程菌株 |
| CN103789282A (zh) * | 2014-01-22 | 2014-05-14 | 武汉新华扬生物股份有限公司 | 一种高温甘露聚糖酶ManAHr的制备方法及其基因和应用 |
| CN103789289A (zh) * | 2014-01-22 | 2014-05-14 | 湖北汇龙食品有限责任公司 | 一种耐碱高温甘露聚糖酶ManB的制备方法及其基因和应用 |
| CN104004735A (zh) * | 2014-06-18 | 2014-08-27 | 南京林业大学 | 一种耐高温重组β-甘露聚糖酶及其应用 |
| CN104877979A (zh) * | 2014-02-28 | 2015-09-02 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种元基因组来源的β-甘露聚糖酶、其编码基因及其表达 |
| CN107760700A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-03-06 | 武汉轻工大学 | β‑甘露聚糖酶基因、重组表达载体、菌株、β‑甘露聚糖酶及其制备方法及应用 |
| CN113122565A (zh) * | 2021-04-22 | 2021-07-16 | 湖北省生物农药工程研究中心 | 新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体、构建方法及试剂盒 |
| CN113957063A (zh) * | 2021-11-26 | 2022-01-21 | 五峰杰成魔芋食品有限责任公司 | 甘露聚糖酶混合物的制备方法及其在魔芋饮品中的应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101886087A (zh) * | 2010-07-13 | 2010-11-17 | 湖北大学 | 一种利用毕赤酵母高效表达dna聚合酶的方法 |
| CN102433267A (zh) * | 2010-09-29 | 2012-05-02 | 中国科学院微生物研究所 | 一种制备β-甘露聚糖酶的方法及专用菌株 |
| CN102676477A (zh) * | 2011-08-19 | 2012-09-19 | 济南诺能生物工程有限公司 | 酸性β-甘露聚糖酶基因改造及其工程菌的构建 |
-
2012
- 2012-12-29 CN CN201210591856.1A patent/CN103146724B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101886087A (zh) * | 2010-07-13 | 2010-11-17 | 湖北大学 | 一种利用毕赤酵母高效表达dna聚合酶的方法 |
| CN102433267A (zh) * | 2010-09-29 | 2012-05-02 | 中国科学院微生物研究所 | 一种制备β-甘露聚糖酶的方法及专用菌株 |
| CN102676477A (zh) * | 2011-08-19 | 2012-09-19 | 济南诺能生物工程有限公司 | 酸性β-甘露聚糖酶基因改造及其工程菌的构建 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| 《生物技术通讯》 20110331 张娟 等 耐酸性黑曲霉beta-甘露聚糖酶的克隆及其在毕赤酵母中的表达分析 182-187 1-3 第22卷, 第2期 * |
| A.-S. XIONG ET AL: "High level expression of a recombinant acid phytase gene in Pichia pastoris", 《JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY》, vol. 98, 31 December 2005 (2005-12-31), pages 418 - 428 * |
| SLEIGHT SC ET AL: "In-Fusion BioBrick assembly and re-engineering", 《NUCLEIC ACIDS RES》, 31 December 2010 (2010-12-31), pages 1 * |
| XM_001390670: "Aspergillus niger CBS 513.88 mannan endo-1,4-beta-mannosidase", 《NCBI GENBANK》, 3 March 2011 (2011-03-03) * |
| 付林 等: "来源于枯草芽孢杆菌HB002的内切-β-1,4-甘露糖苷酶编码基因在毕赤酵母中的克隆和蛋白表达--2012年11月19日", 《中国科技论文在线》, 19 November 2012 (2012-11-19), pages 1 * |
| 张娟 等: "耐酸性黑曲霉β-甘露聚糖酶的克隆及其在毕赤酵母中的表达分析", 《生物技术通讯》, vol. 22, no. 2, 31 March 2011 (2011-03-31), pages 182 - 187 * |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103468766B (zh) * | 2013-09-18 | 2015-07-01 | 恩施天天佳生物科技有限公司 | 一种高纯度甘露低聚糖的制备方法 |
| CN103468766A (zh) * | 2013-09-18 | 2013-12-25 | 恩施天天佳生物科技有限公司 | 一种高纯度甘露低聚糖的制备方法 |
| CN103725621A (zh) * | 2013-11-27 | 2014-04-16 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种重组表达甘露聚糖酶的工程菌株 |
| CN103725621B (zh) * | 2013-11-27 | 2016-02-03 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种重组表达甘露聚糖酶的工程菌株 |
| CN103789289A (zh) * | 2014-01-22 | 2014-05-14 | 湖北汇龙食品有限责任公司 | 一种耐碱高温甘露聚糖酶ManB的制备方法及其基因和应用 |
| CN103789282B (zh) * | 2014-01-22 | 2015-12-09 | 武汉新华扬生物股份有限公司 | 一种高温甘露聚糖酶ManAHr的制备方法及其基因和应用 |
| CN103789289B (zh) * | 2014-01-22 | 2016-01-20 | 湖北汇龙食品有限责任公司 | 一种耐碱高温甘露聚糖酶ManB的制备方法及其基因和应用 |
| CN103789282A (zh) * | 2014-01-22 | 2014-05-14 | 武汉新华扬生物股份有限公司 | 一种高温甘露聚糖酶ManAHr的制备方法及其基因和应用 |
| CN104877979A (zh) * | 2014-02-28 | 2015-09-02 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种元基因组来源的β-甘露聚糖酶、其编码基因及其表达 |
| CN104004735A (zh) * | 2014-06-18 | 2014-08-27 | 南京林业大学 | 一种耐高温重组β-甘露聚糖酶及其应用 |
| CN104004735B (zh) * | 2014-06-18 | 2016-08-31 | 南京林业大学 | 一种耐高温重组β-甘露聚糖酶及其应用 |
| CN107760700A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-03-06 | 武汉轻工大学 | β‑甘露聚糖酶基因、重组表达载体、菌株、β‑甘露聚糖酶及其制备方法及应用 |
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