CN102676477A - 酸性β-甘露聚糖酶基因改造及其工程菌的构建 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酸性耐热β-甘露聚糖酶基因的改造、合成、拼接及含有此基因的工程菌构建，编码基因具有如SEQIDNO.3或4所示的核苷酸序列，编码获得的酸性β-甘露聚糖酶具有如SEQIDNO.1或2所示的氨基酸序列。工程菌的构建是将含有该酸性β-甘露聚糖酶编码基因序列的毕赤酵母组成型表达载体（pGAPZα-man）导入毕赤酵母中得到的。本发明的酸性β-甘露聚糖酶具有以下性质：最适作用pH5.0，最适作用温度40℃。在pH3.0～7.0范围内结构良好性质稳定，酶液90℃高温处理5分钟残留酶活70%以上，同时具有高比活和较好的蛋白酶抗性；该工程菌实现了酸性β-甘露聚糖酶的高效表达，发酵工艺简单，提取成本低廉，适于大规模工业化生产，应用前景广阔。

Description

酸性β-甘露聚糖酶基因改造及其工程菌的构建

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及β-甘露聚糖酶基因改造、合成、拼接及含有此基因的工程菌构建，特别是一种真菌酸性β-甘露聚糖酶全基因及其高效表达工程菌的构建。 

背景技术

β-甘露聚糖酶已从不同来源的生物中分离，有植物（如西红柿的种子和果实）、低等动物（如蓝贻贝 Mytilus deulis）和微生物（Millward-Sadler, et al. Microbiol. Lett. 141,183-188）。其中微生物是产β-甘露聚糖酶的重要来源，已报道的有芽孢杆菌、气单孢菌、黄单孢菌、梭孢菌、青霉、木霉和链霉等（Braithwaite, et al., Biochem. J, 305:1005-1010, 1995; Duffaud, et al., Appl Environ Microbiol, 63(1): 169-177,1997; Reese and Shibata, Can J Microbiol, 11 :167-183,1965 ; Akino, et al., Appl. Microbial Biotech, 26:323-327,1987）。 

目前，国内外对于β-甘露聚糖酶的研究和开发集中在细菌产生的碱性和中性β-甘露聚糖酶方面，JP-A-03047076公开了由一种芽孢杆菌得到的β-甘露聚糖酶，具有分子量37±3 kDa，最适pH 8-10，pI 5.3-5.4；JP-A-08051975公开了来自嗜碱性芽孢杆菌AM-001的几种碱性β-甘露聚糖酶，其具有分子量43±3 kDa和57±3 kDa，最适pH 8-10；W097/11164公开了一种可用于漂白纸浆和纸张，来自解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的纯化甘露聚糖酶及其制备方法；ZL200510103125.8公开了一种来自于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的β-甘露聚糖酶基因序列及其工程菌的构建，可用于甘露寡糖的制备；ZL01128868.x公开了一种中性甘露聚糖酶，该酶在摇瓶水平上表达酶活性为307 IU/mL。 

不同微生物所产的甘露聚糖酶在分子量、最适催化温度、最适pH、底物特异性等方面都存在很大差异。真菌产甘露聚糖酶作用偏酸性，而细菌和放线菌产甘露聚糖酶作用的pH近中性或偏碱性，但稳定性较好。目前甘露聚糖酶的生产主要采用细菌或芽孢杆菌的液体发酵法，主要缺点是需要底物诱导，且发酵工艺复杂，成本高，产率低，酶活性低且所产中性酶不适于酸性作用环境。而在饲料中应用的甘露聚糖酶，需要在酸性条件下具有高活性（表1），因此酸性β-甘露聚糖酶的研究与开发在饲料工业应用中具有重要意义。 

表1    β -甘露聚糖酶在动物体内的作用位点 

pH值	嗉囊	肌胃（胃）	小肠
				禽	4.67	2.94	5.8～6.20
猪	---	3.0	6.0～6.4

发明内容

本发明的目的是提供一种酸性耐热β-甘露聚糖酶。 

本发明再一目的是提供酸性耐热β-甘露聚糖酶的全基因。 

本发明再一目的是提供一种产酸性耐热β-甘露聚糖酶的工程菌株。 

本发明再一目的是提供一种酸性耐热β-甘露聚糖酶的表达方法。 

本发明的目的是通过以下方式实现的。 

本发明的酸性β-甘露聚糖酶，来源于黑曲霉和刺孢曲霉，是具有下述氨基酸序列之一的蛋白质： 

序列表中的SEQ ID No.1 ；

将序列表中的SEQ ID No.1的氨基酸残基序列经过二十七个氨基酸残基的替换、缺失或重复所获得的具有对甘露聚糖降解活性的蛋白质。

序列表中的SEQ ID No.2所示。 

将序列表中经过改造的SEQ ID No.1序列与SEQ ID No.2的氨基酸序列通过片段切割、重组所获得的具有对甘露聚糖降解活性的蛋白质。 

    本发明的酸性β-甘露聚糖酶的基因manAsp，满足下列要求的核苷酸序列之一： 

编码具有序列SEQ ID No.1或 SEQ ID No.2的酸性β-甘露聚糖酶；

编码序列SEQ ID No.1或 SEQ ID No.2的酸性β-甘露聚糖酶，其碱基序列如SEQ ID No.3 所示；

编码序列SEQ ID No.1或 SEQ ID No.2的酸性β-甘露聚糖酶，其碱基序列如SEQ ID No.4 所示；

在高严谨条件下可与SEQ ID No.3 或SEQ ID No.4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

本发明的酸性β-甘露聚糖酶工程菌为包含上述酸性β-甘露聚糖酶基因manAsp的重组载体的酸性β-甘露聚糖酶工程菌。 

本发明的酸性β-甘露聚糖酶工程菌的构建方法，是将含有酸性β-甘露聚糖酶基因manAsp的重组载体pGAPZα-man或pPICZα-man导入毕赤酵母中获得。 

上述重组载体（即毕赤酵母重组表达载体）的构建参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克书中所述具体方法进行。 

将重组载体转化毕赤酵母的方法为电击转化法或氯化锂转化法。 

下表2为目前研究中几种具有代表性的微生物所产的β-甘露聚糖酶特性。由表2可知，同里氏木酶、硫色曲霉和枯草芽孢杆菌来源的β-甘露聚糖酶相比，    本发明的β-甘露聚糖酶有如下优点： 

（1）最适pH为5.0，在3.0-7.0间稳定性较好，更易在猪或者是其它家禽的胃（3.0左右）和肠道（6.0左右）中发挥作用；

（2）该酶同硫色曲霉和枯草芽孢杆菌来源的β-甘露聚糖酶相比，具有更好的耐热性，适宜于饲料添加剂制备过程中的热处理；本发明的β-甘露聚糖酶可以在90℃湿热条件下耐受10分钟，残留70%以上酶活，而以硫色曲霉和枯草芽孢杆菌为来源的β-甘露聚糖酶的最高耐热温度为80℃。  

（3）同里氏木酶、硫色曲霉来源的β-甘露聚糖酶相比，该酶为family 26糖苷水解酶家族，对β-半乳甘露聚糖（即豆粕-玉米等种子饲料中甘露聚糖的主要存在形式）具有更好的特异性。

表2 几种微生物所产的β-甘露聚糖酶特性比较 

附图说明

    图1为本发明毕赤酵母重组表达质粒构建图谱； 

   图2为本发明酸性β-甘露聚糖酶全基因合成片断拼接鉴定结果；

1-4泳道为分为4段基因片段的第一次PCR连接产物；5-8泳道为以各分段第一次PCR连接产物做模板的PCR产物；10、11泳道为4段基因片段连接成全基因片段；12泳道为空白对照；

   图3为本发明毕赤酵母重组质粒酶切鉴定图谱；

泳道1为pPICZα-man酶切鉴定图谱，泳道2为pGAPZα-man酶切图谱。

   图4为本发明重组毕赤酵母X-33/pGAPZα-man中酸性β-甘露聚糖酶基因遗传稳定性的PCR鉴定结果； 

1、2、3、4、5泳道分别为重组毕赤酵母X-33/pGAPZ-man传代5、10、15、20、25次后提取酵母基因组作模板扩增β-甘露聚糖酶基因的PCR产物，M为marker，6泳道为阴性对照。

   图5 为本发明重组菌株X-33/pGAPZα-man表达产物的SDS-PAGE检测结果； 

   图6为本发明表达的黑曲霉β-甘露聚糖酶的最适pH检测结果；

   图7为本发明表达的黑曲霉β-甘露聚糖酶的最适温度检测结果；

图8为本发明表达的黑曲霉β-甘露聚糖酶的温度稳定性检测结果;

图9为本发明表达的黑曲霉β-甘露聚糖酶的pH稳定性检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。 

下述实施例中所用方法如无特殊说明均为本领域内的国际标准方法，参考《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克书中所述具体方法进行。 

实施例1  来自于黑曲霉CBS 513.88的β-甘露聚糖酶全基因的获得

基因片断的截取

在NCBI数据库获得黑曲霉Aspergillus niger CBS 513.88菌株的β-甘露聚糖酶基因 An15g07760，分析其序列并根据毕赤酵母密码子偏爱性和mRNA结构优化该基因序列, 采用SignalP 3.0 Server在线分析软件分析该基因所编码蛋白的信号肽并将编码信号肽的基因序列切除，在5’端添加XhoI酶切位点（C^TCGAG）和CG保护碱基、3’端添加XbaI(T^CTAGA)酶切位点和保护碱基GC，获得优化的β-甘露聚糖酶基因。设计三条引物：

Fn-Man：GACCGCTCGAGAAGAGAGCTTCTAATC；

Rn-Man1：GCTCTAGAGCAGCACCTTCCCAATTC；

Rn-Man2：GCTCTAGAGCTTAAGCACCTTCCCAATTC。

基因片断的合成 

将优化后的β-甘露聚糖酶基因用在线分析软件Gene2Oligo进行在线分析切割成54个片段，并交予南京金斯瑞生物科技有限公司合成短基因片段。

基因片段的拼接 

采用Assembly-PCR、DA-PCR和LCR技术拼接合成的短基因片段，获得优化后的β-甘露聚糖酶基因。

Assembly PCR和DA-PCR 

将54个片段分成14、14、14和12个片段进行PCR连接扩增。反应体系为：1×Buffer；MgSO4,2.5mM；dNTPs，200μM；VentR DNA polymerase 0.5U；两端引物，0.4μM；内部基因片段，0.05μM；补灭菌双蒸水至总体系20μL。PCR扩增程序：94℃，2min；35个循环（94℃，30s；48℃,40s,每个循环降0.3℃；65℃，30s，每个循环降0.6℃，时间增加4s）；94℃，2min；20个循环（94℃，30s；65℃，30s；72℃，90s）；72℃，10min；4℃，hold。

以第一次PCR产物稀释作模板、以每段基因的两端片段作引物进行第二次PCR，体系同上。反应程序：94℃，5min；94℃，40s；60℃，40s；72℃，1min，共30个循环；72℃，10min；4℃，保存。 

取四段基因第二次PCR产物等倍稀释、取等量混合作模板，反应体系同上。反应程序：94℃，5min；94℃，40s；38℃，40s；55℃，2min 30s，共30个循环；72℃，10min；4℃，保存。PCR产物即为完整的β-甘露聚糖酶基因。 

LCR 

将54个片断分别磷酸化。反应体系为：1×Buffer；T4 DNA kinase; 基因片断 10M（反应前先将片断75℃水浴5分钟后，冰浴冷却，能提高磷酸化的效果）；补灭菌双蒸水至10μL。37℃，水浴30min，然后65℃，水浴20min灭活。

再将磷酸化后的片断分成20、20、20个片断进行过夜连接。反应体系为：1×Buffer；T4 DNA ligase；模板片断0.4 M；补灭菌双蒸水至25μL。22℃，低温水浴过夜。 

以过夜连接产物为模板，以每段基因的连段片段作引物进行PCR，反应体系为：1×Buffer；MgSO4,2.5mM；dNTPs，200μM；VentR DNA polymerase 0.5U；两端引物，0.4μM；内部基因片段，0.05μM；补灭菌双蒸水至总体系20μL。反应程序：94℃，5min；94℃，40s；60℃，40s；72℃，1min，共30个循环；72℃，10min；4℃，保存。 

取三段基因PCR产物等倍稀释、取等量混合作模板，反应体系同上。反应程序：94℃，5min；94℃，40s；38℃，40s；55℃，2min30s，共30个循环；72℃，10min；4℃，hold。PCR产物即为完整的β-甘露聚糖酶基因。 

全长基因的获得、鉴定与测序 

用加酶切位点的上下游引物、Assembly PCR产物做模板进行PCR，反应体系和PCR运行程序同上。

将上述PCR产物跑电泳进行切胶回收纯化，将纯化产物用Taq DNA  polymerase 处理，在两端加腺苷酸。将处理后产物进行电泳切胶回收纯化。 

纯化产物连接到pGEM-T载体中，连接体系：2×Buffer，5μL；pGEM-T，1μL；PCR纯化产物，3μL；T4连接酶，1μL；16℃水浴16h。重组质粒命名为pGEM-Man。 

转化：取连接到pGEM-T的连接产物3μL，采用化学法转化到DH5α感受态细胞中。利用蓝白斑筛选到阳性克隆的克隆子。 

菌落PCR鉴定阳性克隆：挑取白斑进行菌落PCR，PCR得到1000bp左右的条带的克隆为阳性克隆。 

测序鉴定：挑取5个阳性克隆子送去上海桑尼生物科技有限公司，测序结果显示各克隆子均存在突变位点。 

无突变全长基因的获得 

采用重组PCR将上述无突变位点的基因片段连接起来。然后进行连接、转化，获得DH5α阳性克隆，方法同上。

蓝白斑筛选到阳性克隆经菌落PCR鉴定后送上海桑尼生物科技有限公司测序。将测序结果无突变的克隆保存备用。 

实施例2  黑曲霉β-甘露聚糖酶表达工程菌的构建

β-甘露聚糖酶基因扩增载体的构建与基因扩增

将经Assembly PCR和LCR获得的完整β-甘露聚糖酶基因，连接到pGEM-T载体中，然后转入DH5α感受态细胞中，方法同上。挑取白斑经菌落PCR鉴定为阳性克隆后，送去上海桑尼生物科技有限公司测序。测序鉴定无突变的β-甘露聚糖酶基因重组质粒克隆保藏备用。

β-甘露聚糖酶基因毕赤酵母表达载体的构建 

甲醇诱导型表达载体pPICZα-man

培养重组β-甘露聚糖酶基因的DH5α克隆子，采用碱裂解法提取pGEM-man（采用《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克书中所述具体方法进行）。采用同样方法提取pPICZαA质粒。

用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切pGEM-man和pPICZαA质粒，酶切体系：10×Buffer Tango，2μL；pGEM-man/pPICZαA，1μL；XhoⅠ，1μL； XhoⅠ，1μL；37℃温浴8h。酶切产物跑电泳后切胶纯化回收。 

将酶切后的β-甘露聚糖酶基因和pPICZαA进行连接，连接方法同上。 

组成型表达载体pGAPZα-man 

用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切pGEM-man和pGAPZαA质粒，酶切体系和方法同上，酶切产物跑电泳后切胶纯化回收。

将酶切后的β-甘露聚糖酶基因和pGAPZαA进行连接，连接方法同上。 

黑曲霉β-甘露聚糖酶工程菌的获得 

线形化含有黑曲霉β-甘露聚糖酶基因的重组质粒

pPICZαA-man/pPICZαA和pGAPZαA/pGAPZαA-man质粒的线性化。反应体系：10×Tango Buffer，10μL；重组质粒pPICZαA-man/pPICZαA /pGAPZαA/pGAPZαA-man，20μL；Bgl Ⅱ，5μL；补灭菌双篜水至总体积100μL。混匀上述反应体系，37℃酶切4-5 h。以0.8%琼脂搪凝胶电泳检测是否酶切完全，切胶回收纯化线性化质粒。

毕赤酵母X-33感受态细胞的制备 

挑取酵母单菌落，接种至含有5 mL YPD培养基的50mL摇瓶中，28-30℃, 250-300 rpm培养过夜。

  取50 μL的培养物接种至含有50 mL新鲜培养基的500 mL三角瓶中，28-30℃, 250-300 rpm培养过夜，至OD600值达到1.3-1.5。将细胞培养物于4℃, 1500g离心5 min，用500 mL冰预冷灭菌水将菌体沉淀重悬。4℃, 1500g离心5 min，用250 mL冰预冷的灭菌水将菌体沉淀重悬。4℃, 1500 g离心5 min，用20 mL冰预冷的3 moL/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。4℃, 1500g离心5 min，用1 mL冰预冷的3 moL/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5 mL。每管80 μL分装，-70℃保存。 

电击转化 

将浸泡在70%乙醇中的电转化杯取出，用无水乙醇冲洗三遍，在灭过菌的超净台中晾干残余乙醇，将电转化杯转至冰中预冷10 min。将5-20 μg的线性化DNA溶解在5-10 μL灭菌双蒸水中，与80μL的感受态细胞混匀，转至0.2 cm冰预冷的电转化杯中，将电转化杯冰浴5 min后进行电击。电击完毕后，加入1 mL冰预冷的1 mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，转至50 mL离心管中，28℃温育3 h将菌体悬液涂布于YPDS平板上(含 Zeocin浓度为100μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL)，每100-200μL涂布一块平板，于30℃培养2-3 d。

稳定重组菌的鉴定、筛选 

提取重组酵母基因组DNA，按照酵母基因组DNA提取试剂盒提供的方法进行。

 以基因组DNA为模板，Rn-Man1和Fn-Man为引物，对重组子进行PCR鉴定。反应体系如下：1×Buffer；MgCl2, 2.5mM；dNTPs，200μM；pfu Taq DNA polymerase 0.5U；基因组DNA，2μL；Rn-Man1和Fn-Man，0.5μM；补灭菌双蒸水至总体系20μL。 

按以上体系混匀后进行PCR反应，反应条件为：94℃， 3 min； 35个循环(94℃，30 s；55℃，45s；72℃，1min)，最后72℃延伸10 min。反应结束后以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。 

切胶回收纯化PCR产物，送上海桑尼生物科技公司测序，确定序列正确无突变。培养收集稳定重组菌株保存于-70℃备用。 

实施例3   黑曲霉β-甘露聚糖酶的诱导型表达

挑取稳定重组单克隆菌株，接种至含25mL BMGY的250mL摇瓶中，28-30℃、250-300rpm培养至OD600=2-6 (约16-18小时)。将25mL培养基接种至含1L BMGY的3L摇瓶中，28-30度剧烈振荡(250-300rpm)，至对数生长期(OD600=2-6)。用灭菌离心管，室温1500-3000g离心5min收集细胞。去除上清，用BMMY重悬细胞至OD600=1.0(2-6)。分装培养基至3个3L隔板摇瓶，用2层灭菌纱布或干酪包布盖住，放入摇床28-30℃继续培养。每24小时，加甲醇至0.5%浓度，直至到达最佳诱导时间。按时间点分别取菌液样品((24 h, 48 h, 60 h, 72h、96 h )，取样量为1 mL,置于1.5 mL离心管中，常温，12000 rpm离心5 min，收集上清，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。用12% SDS-PAGE电泳和活性检测重组蛋白的表达和酶活力。

实施例4  黑曲霉β-甘露聚糖酶的组成型表达

挑取稳定重组的单克隆菌株至1mL含100μg/mL Zeocin的YPD中34℃振荡培养至对数生长期，-70℃冻存保藏备用，同时作对照试验，方法同上。

电转后的单克隆冻存菌经过夜活化后，以1:100接种于100mLYPD培养液中，30℃振荡培养，每隔24h取菌液，取样量为1 mL,置于1.5 mL离心管中，常温，12000 rpm离心5 min，收集上清，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。用12% SDS-PAGE电泳和活性检测重组蛋白的表达和酶活力。 

实施例5   黑曲霉β-甘露聚糖酶酶学性质分析

最适pH与pH稳定性分析

最适pH值的确定：将稀释好的纯酶液置于不同pH值的磷酸氢二钠-柠檬酸(2.2-8.0)中测定酶的活力。

pH值稳定性的确定：纯酶样品置于不同pH值的磷酸氢二钠一柠檬酸(2.2-8.0)缓冲液中处理24h后，测定残留的酶活力。 

结果见图6与图9。 

结果显示该酶在pH 3-7范围内能正常工作，在pH 3.5-6.5范围内保留有50%以上最高酶活。同时pH耐受性实验结果显示该酶在pH 2-8 范围内耐受12小时可以残留65%以上酶活。 

 最适温度与温度稳定性分析 

最适温度的确定：纯酶样品经适当稀释后，分别在10℃、15 ℃、20℃、25℃、 30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃和100℃测定酶的活力。

温度稳定性的确定：纯酶样品置于80℃和90℃下保温30min，测定残留的酶活力。 

结果见图7和8。 

结果显示该酶在0-60℃范围内皆能正常工作，保留有30%以上最高酶活。同时在80℃湿热处理10分钟和90℃湿热处理10分钟后仍能残留60%以上 

最高酶活。

 实施例6  甘露聚糖酶在饲料中的应用 

我国猪鸡的主要日粮是玉米－豆粕型日粮，其主要的抗消化粘性多糖是甘露聚糖。玉米和豆粕中甘露聚糖占非淀粉多糖的比例分别为11.7%和22.7%。β-甘露聚糖酶是对玉米－豆粕型日粮非常有效的饲用酶制剂，它可以降解其含有的抗消化粘性多糖，促生长提高饲料利用效率的效果非常显著（表3）。

表3 β-甘露聚糖酶对玉米－豆粕型日粮的应用效果 

动物种类	增重，%	饲料转化效率，%
			猪	+4.2～18	+4～9
肉鸡	+2.2～3.6	+4.3～5.6

Claims (7)

1.一种酸性β-甘露聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列通过点突变和随机重组后的序列如SEQ ID No.1 所示。

2.如权利要求1所述的一种酸性β-甘露聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列通过点突变和随机重组后的序列如SEQ ID No.2 所示。

3.如权利要求1或2所述的酸性β-甘露聚糖酶，其特征在于，所述的酸性β-甘露聚糖酶最适作用pH 5.0，最适作用温度40℃，在pH3.0～7.0范围内保留酶活比例达到50%以上，酶液在90℃高温处理5分钟残留酶活70%以上，比活达到1256 U/mg。

4.一种酸性β-甘露聚糖酶基因manAsp，其特征在于满足下列要求的核苷酸序列之一：

编码权利要求1或2所述的酸性β-甘露聚糖酶；

编码权利要求1或2所述的酸性β-甘露聚糖酶，其碱基序列如SEQ ID No.3 所示；

编码权利要求1或2所述的酸性β-甘露聚糖酶，其碱基序列如SEQ ID No.4 所示；

在高严谨条件下可与SEQ ID No.3 或SEQ ID No.4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5.包含如权利要求4所述酸性β-甘露聚糖酶基因manAsp的重组载体pGAPZα-man或pPICZα-man。

6.包含如权利要求5所述酸性β-甘露聚糖酶基因manAsp的重组载体的酸性β-甘露聚糖酶工程菌。

7.权利要求1或2 所述的酸性β-甘露聚糖酶在动物饲料添加剂中的应用。

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