CN102732493B - 耐热β-甘露聚糖酶、其编码基因、重组菌和应用 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种耐热β-甘露聚糖酶、其编码基因、重组菌和应用。本发明提供的蛋白质，是一种耐热性β-甘露聚糖酶，为如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-甘露聚糖酶活性的由序列1衍生的蛋白质。本发明还提供了所述蛋白的编码基因以及含有所述编码基因的工程菌(重组巴斯德毕赤酵母)。本发明提供的β-甘露聚糖酶具有比活性高、酸稳定性好、催化pH值范围广等优点，适于用作猪、鸡等单胃动物的添加剂。

Description

耐热β-甘露聚糖酶、其编码基因、重组菌和应用

技术领域

本发明涉及一种耐热β-甘露聚糖酶、其编码基因、重组菌和应用。

背景技术

甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，是由β-1，4-D吡喃甘露糖连接而成的线状多糖。甘露聚糖具有高亲水性，在单胃动物的消化道内大量吸水，增加了消化道内容物的粘度，抵抗胃肠的蠕动，直接影响动物对营养物质的消化和吸收。豆粕中甘露聚糖的含量在1.2％以上。近年来，随着豆类产品(豆粕等)在动物饲粮中的广泛应用，甘露聚糖的抗营养作用也越来越受到重视。目前，我国大豆进口量为3000万吨以上，其中80％以上用于饲料。

甘露聚糖的完全酶解需要β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶和脱乙酰酶的协同作用，其中β-甘露聚糖酶在饲料中的应用比较广泛。β-甘露聚糖酶是一类能水解甘露聚糖的半纤维素酶类，广泛存在于动植物和微生物中。有报道，在大猪饲料中添加β-甘露聚糖酶可以提高平均日增重10％以上；在肉鸡饲料中添加β-甘露聚糖酶可以提高饲料的转化率4％-6％，提高鸡的抗病力，改善肉用鸡的健康状况。

目前已知的β-甘露聚糖酶耐热性很差，无法抵抗饲料制粒温度，限制了β-甘露聚糖酶在饲料中的使用。因此，研制耐热性的β-甘露聚糖酶具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐热β-甘露聚糖酶、其编码基因、重组菌和应用。

本发明提供的耐热β-甘露聚糖酶(MANN-cx1蛋白)，获自硫色曲霉β-甘露聚糖酶随机突变后筛选得到的一株突变体，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-甘露聚糖酶活性的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a)中的MANN-cx1蛋白便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基数	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH

FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tagII	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的MANN-cx1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的MANN-cx1蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述蛋白的基因(MANN-cx1基因)也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有β-甘露聚糖酶活性蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有β-甘露聚糖酶活性蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有以上任一所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体具体可为在载体pPICZαA的多克隆位点插入序列表的序列2所示的DNA得到的重组质粒。

所述重组菌具体可为将所述重组质粒导入毕赤酵母X-33得到的重组菌。

所述重组菌具体可为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)x-33/PIC-MANNcx1。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)x-33/PIC-MANNcx1已于2011年03月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCC No.4626。巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)x-33/PIC-MANNcx1 CGMCC No.4626简称巴斯德毕赤酵母x-33/PIC-MANNcx1(也称工程菌x-33/PIC-MANNcx1)。

本发明还保护一种生产β-甘露聚糖酶的方法，是发酵所述重组菌，得到β-甘露聚糖酶。

所述蛋白可用于制备饲料添加剂。

本发明还保护一种饲料添加剂，它的活性成分为所述蛋白。

本发明提供的蛋白是一种耐热性β-甘露聚糖酶，具有比活性高、酸稳定性好、催化pH值范围广等优点，适于用作猪、鸡等单胃动物的添加剂，具有重大经济价值

附图说明

图1为工程菌发酵过程中样品的12％SDS-PAGE电泳分析结果。

图2为MANN-cx1蛋白最适pH的检测结果。

图3为MANN-cx1蛋白最适反应温度的检测结果。

图4为MANN-cx1蛋白和对照蛋白的温度稳定性检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。载体pPICZαA：购自Invitrogen公司，产品目录号为V195-20。毕赤酵母X-33：购自Invitrogen公司，产品目录号为C18000。甘露聚糖：购自sigma公司，货号为G-0753。甘露糖(标准品)：购自sigma公司，货号为112585。

用甘露糖(标准品)制作标准曲线：y＝1.078x+0.088，R²＝0.996；x代表光吸收值OD₅₄₀，y代表甘露糖的量，单位为μmol。

DNS试剂：称取酒石酸钾钠91.0g，溶于500mL水中，一次加入3，5-二硝基水杨酸3.15g、NaOH 20.0g，低于50℃水浴溶解；再加入苯酚2.5g、无水亚硫酸钠2.5g，搅拌溶解，冷却后定容至1000mL；储存于棕色瓶中，放置一周后使用。

β-甘露聚糖酶酶活的测定(DNS法)：取待测溶液2mL，加入2mL 0.8％(质量百分含量)甘露聚糖溶液，恒温水浴中反应30min，然后加入5mL DNS试剂(终止反应)。沸水浴煮5min，然后冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL，测OD₅₄₀。

在pH3.8和65℃条件下，每分钟从底物半乳甘露聚糖(Sigma公司，货号：G0753)中水解产生1μmol/L的甘露糖的所需的酶量定义为1个酶活单位，用U表示。

实施例1、耐热β-甘露聚糖酶(MANN-cx1蛋白)及其编码基因的发现

一、β-甘露聚糖酶基因的易错PCR扩增

以优化的野生型甘露聚糖酶基因为模板，易错PCR反应体系含有：dNTP(2.5mM)、dCTP(10mM)、dTTP(10mM)、Mg²⁺(25mM)、Mn²⁺(10mM)、Taq DNA聚合酶(5U)。引物分别为E：5′-CCG GAA TTC TTG CCA AAG GC-3′(下划线为限制性内切酶EcoR I位点)，X：5′-GCT CTA GAT TAA GCA GAA TC-3′(下划线为限制性内切酶XbaI酶切位点)。PCR反应条件为：94℃变性1min，52℃退火30S，72℃延伸1min，经过30次循环。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

二、突变体表达文库的构建与筛选

用限制性内切酶EcoR I和Xba I对易错PCR产物酶切后，连接于自主复制表达载体pBGP1上构建重组质粒。构建好的重组质粒转化入大肠杆菌Top 10感受态细胞中，在含有0.025％抗生素Zeocin的LB液体培养基中摇菌12h，提取扩增得到的重组质粒。重组质粒电转化入毕赤酵母X-33感受态细胞中，28℃孵育3h后菌液涂布于含有0.1％抗生素Zeocin的YPDS培养基平板上28℃孵育3d。挑取单克隆划线编号留种。

初筛阶段，用灭菌牙签挑取单克隆接菌于含有0.6％甘露聚糖底物的YPD培养基平板上，28℃孵育2d，将平板置于50℃培养箱中孵育2h使菌体分泌表达的甘露聚糖酶充分与底物结合，促进甘露聚糖的分解。用0.1％的刚果红染色1h，以1M/L NaCl溶液脱色，筛选得到表现出甘露聚糖酶活性的单克隆菌体。

复筛阶段，初筛得到的表现出甘露聚糖酶活性的单克隆菌体接菌至96孔深板(每孔添加800μL YPD液体培养基)28℃恒温摇床250rpm摇菌3d，3000rpm离心10min取上清测试单克隆菌体所分泌表达的甘露聚糖酶活性，与野生型甘露聚糖酶活性相比较，筛选获得表达量及活性较高的单克隆菌株，并测定突变体的序列。

三、耐热β-甘露聚糖酶及其编码基因的发现

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为MANN-cx1蛋白，将MANN-cx1蛋白的编码基因命名为MANN-cx1基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。

实施例2、重组菌的构建和耐热β-甘露聚糖酶(MANN-cx1蛋白)的表达

一、工程菌的构建

1、合成序列表的序列2所示的DNA(MANN-cx1基因)。

2、以步骤1合成的MANN-cx1基因为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-CCG GAA TTC TTG CCA AAG GC-3’(下划线标记EcoR I酶切识别序列)；

R1：5’-GCT CTA GAT TAA GCA GAA TC-3’(下划线标记Xba I酶切识别序列)。

3、用限制性内切酶EcoR I和Xba I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶EcoR I和Xba I双酶切载体pPICZαA，回收载体骨架(约3600bp)。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pPICZαA-MANN-cx1。将重组质粒pPICZαA-MANN-cx1测序并根据测序结果描述如下：在载体pPICZαA的EcoR I和Xba I酶切位点插入了序列表的序列2所示DNA。

6、将重组质粒pPICZ αA-MANN-cx1用SacI内切酶进行线性化后电击法导入毕赤酵母X-33，菌液涂布于YPDS培养基平板(含有质量百分含量为0.1％的抗生素Zeocin)上，28℃孵育3d，获得工程菌(在毕赤酵母X-33的基因组中导入了MANN-cx1基因)。

将工程菌中的一株命名为x-33/PIC-MANNcx1，已于2011年03月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4626。

二、对照菌甲的构建

将载体pPICZαA用SacI内切酶进行线性化后电击法导入毕赤酵母X-33，得到对照菌甲。

三、对照菌乙的构建

1、合成序列表的序列4所示的DNA(即现有基因，作为对照基因)，该DNA编码序列表的序列3所示的蛋白质(即现有蛋白，作为对照蛋白)。

2、以步骤1合成的DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-CCG GAA TTC TTG CCA AAG GC-3’(下划线标记EcoR I酶切识别序列)；

R1：5’-GCT CTA GAT TAA GCA GAA TC-3’(下划线标记Xba I酶切识别序列)。

3、用限制性内切酶EcoR I和Xba I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶EcoR I和Xba I双酶切载体pPICZαA，回收载体骨架(约3600bp)。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到对照质粒。将对照质粒测序并根据测序结果描述如下：在载体pPICZαA的EcoR I和Xba I酶切位点插入了序列表的序列4所示DNA。

6、将对照质粒用SacI内切酶进行线性化后电击法导入毕赤酵母X-33，菌液涂布于YPDS培养基平板(含有质量百分含量为0.1％的抗生素Zeocin)上，28℃孵育3d，获得对照菌乙(在毕赤酵母X-33的基因组中导入了对照基因)。

四、工程菌和对照菌的发酵

BMGY培养基由溶质和溶剂组成；溶剂为100mM pH6.0磷酸盐缓冲液；溶质及其浓度如下：1g/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，1.34g/100ml YNB，4×10^-5g/100ml生物素，1％(体积百分含量)甘油。

1、制备种子液

分别将工程菌x-33/PIC-MANNcx1、对照菌甲和对照菌乙的单菌落接入BMGY培养基，摇瓶培养，得到OD600＝5.0的各个种子液(工程菌种子液、对照菌甲种子液和对照菌乙种子液)。

2、发酵

分别将各个种子液(工程菌种子液、对照菌甲种子液和对照菌乙种子液)进行如下发酵(发酵温度为28.0℃)：

(1)配制3L BMGY培养基，在10L自动控制发酵罐中灭菌后，冷却至28.5℃。

(2)按10ml/100ml接种量将种子液加入到装3L发酵培养基BMGY的10L发酵罐中，进行阶段培养；用氨水和磷酸调pH至5.0，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于30％。

(3)甘油消耗完全(溶氧标记为100％)后(接入种子液后约24h)，进入流加25％甘油阶段(即加入甘油和水的混合液，甘油和水的体积比为1∶3)，流速为60mL/h，流加5h后停止流加。

(4)甘油消耗完全(溶氧标记为100％)且湿菌重达到200g/L时进入甘油与甲醇(诱导剂)混合流加阶段；

从加入甲醇(诱导剂)开始，第一个12个小时流加甘油和甲醇的混合液(甘油和甲醇的体积比为9∶1)；第二个12个小时流加甘油和甲醇的混合液(甘油和甲醇的体积比为8∶1)；然后流加甘油和甲醇的混合液(甘油和甲醇的体积比为6∶1)；

通过调节转速、空气流量和甲醇控制溶氧为30％以上，如不能保持在30％以上则停止甲醇添加，直至溶氧回升。

在发酵的不同时间取样测定菌体量、β-甘露聚糖酶酶活(采用65℃水浴温度；甘露聚糖溶液的溶剂为pH3.8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，磷酸氢二钠0.2M，柠檬酸0.1M)和蛋白含量(蛋白含量采用BCA蛋白分析试剂盒(美国Pierce公司)进行)，并对表达蛋白进行12％SDS-PAGE电泳分析。

工程菌发酵过程中样品的12％SDS-PAGE电泳分析结果见图1。图1中M：蛋白质分子量标准；后续5个泳道分别为工程从加入甲醇(诱导剂)开始诱导计时，24h、48h、72h、96h和120h后的表达产物。

工程菌从加入甲醇(诱导剂)开始诱导计时，0h、24h、48h、72h、96h和120h后的表达产物的酶活分别为0U/mL、1200U/mL、2300U/mL、4700U/mL、6500U/mL、8000U/mL。对照菌甲从加入甲醇(诱导剂)开始诱导计时，0h、24h、48h、72h、96h和120h后的表达产物的酶活分别为0U/mL、0U/mL、0U/mL、0U/mL、0U/mL、0U/mL。对照菌乙从加入甲醇(诱导剂)开始诱导计时，0h、24h、48h、72h、96h和120h后的表达产物的酶活分别为0U/mL、280U/mL、550U/mL、730U/mL、900U/mL、1200U/mL。对照菌甲因为没有插入外源的β-甘露聚糖酶编码基因，不能表达β-甘露聚糖酶。对照菌乙插入了现有的β-甘露聚糖酶，该β-甘露聚糖酶的酶活远低于本发明提供的耐热β-甘露聚糖酶(MANN-cx1蛋白)。

实施例3、耐热β-甘露聚糖酶(MANN-cx1蛋白)的酶学性质分析

一、最适pH值的测定

检测MANN-cx1蛋白作为耐热β-甘露聚糖酶的最适pH值。将工程菌实施例3的步骤四的2中从加入甲醇(诱导剂)开始诱导计时诱导120小时后的发酵液作为待测溶液；分别用pH值为2.2、3.2、3.8、4.2、5.2、6.2、7.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(磷酸氢二钠0.2M，柠檬酸0.1M)作为甘露聚糖溶液的溶剂，甘露聚糖的浓度为0.8％(g/100mL)；水浴温度为65℃。

pH3.8时，待测溶液的酶活最高(8000U/mL)。以最高酶活为100％，其他pH时待测溶液的相对活性见图2。MANN-cx1蛋白的最适pH值为3.8。

二、最适温度的测定

检测MANN-cx1蛋白作为耐热β-甘露聚糖酶的最适温度。将工程菌实施例3的步骤四的2中从加入甲醇(诱导剂)开始诱导计时诱导120小时后的发酵液作为待测溶液；用pH3.8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(磷酸氢二钠0.2M，柠檬酸0.1M)作为甘露聚糖溶液的溶剂，浓度为0.8％(g/100mL)；分别采用40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、80℃的水浴温度。

65℃时，待测溶液的酶活最高(8000U/mL)。以最高酶活为100％，其他温度时待测溶液的相对活性见图3。MANN-cx1蛋白的最适反应温度为65℃。

三、温度稳定性的检测

分别检测MANN-cx1蛋白和对照蛋白作为耐热β-甘露聚糖酶的温度稳定性。分别将工程菌和对照菌乙实施例3的步骤四的2中从加入甲醇(诱导剂)开始诱导计时诱导120小时后的发酵液70℃条件下保温0-30min(时间间隔为5min)，作为待测溶液；用pH3.8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(磷酸氢二钠0.2M，柠檬酸0.1M)作为甘露聚糖溶液的溶剂，浓度为0.8％(g/100mL)；水浴温度为65℃。

处理时间为0min时，工程菌得到的待测溶液的酶活最高(8000U/mL)；以最高酶活为100％，其他处理时间时待测溶液的相对活性见图4。处理时间为0min时，对照菌乙得到的待测溶液的酶活最高(1200U/mL)；以最高酶活为100％，其他处理时间时待测溶液的相对活性见图4。结果表明，本发明提供MANN-cx1蛋白与对照蛋白比较具有很好的热稳定性，70℃保温30分钟酶活性不下降反倒上升。

Claims (10)

1.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是序列表中序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在载体pPICZαA的多克隆位点插入序列表的序列2所示的DNA得到的重组质粒。

6.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将权利要求5所述重组质粒导入毕赤酵母X-33得到的重组菌。

7.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris，命名为x-33/PIC-MANNcx1，并已于2011年3月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4626。

8.一种生产β-甘露聚糖酶的方法，是发酵权利要求4或6或7所述的重组菌，得到β-甘露聚糖酶。

9.权利要求1所述蛋白在制备饲料添加剂中的应用。

10.一种饲料添加剂，它的活性成分为权利要求1所述蛋白。

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