CN101684475A - 重组毕赤酵母工程菌的构建及其应用 - Google Patents

Abstract

重组毕赤酵母工程菌的构建及其应用，涉及一种微生物重组构建方法及应用。将杂合β－1，3－1，4－葡聚糖酶插入pPIC9K，构建出重组载体pPIC9K－bgl，然后将重组载体pPIC9K－bgl线性化导入巴斯德毕赤酵母，经筛选得一株最优重组菌株，命名为GS115/pPIC9K－bgl。所构建的毕赤酵母工程菌表达杂合β－1，3－1，4－葡聚糖酶活力为1125IU/mL，蛋白表达量为1.22g/L。该酶具有酸碱稳定性、热稳定性好及催化pH范围广等优点，在酸性环境中的热稳定性大大高于单一的野生型β－葡聚糖酶，其最适反应pH为6.0，最适反应温度为50℃，具有较好的工业应用前景。

Description

重组毕赤酵母工程菌的构建及其应用

技术领域

本发明涉及一种微生物重组构建方法及其应用。

背景技术

β-葡聚糖是禾本科植物细胞壁多糖成分，它富含在大麦、黑麦、高粱、稻和小麦等作物的胚乳细胞壁中，不同物种其含量、比例也不相同。早期研究认为大麦β-葡聚糖中含有连续的β-1，3键；但越来越多的试验证明，大麦β-葡聚糖分子中不存在连续的β-1，3键，且β-1，3键和β-1，4键的分布不是随机的。不同来源β-葡聚糖中β-1，3键和β-1，4键所占的比例也不尽相同，其中β-1，3键约占25％～30％(Stone，B.A.，Clarke，A.E.，(1992).Chemistry and Biology of1，3-β-Glucans.La Trobe Univesity Press.Strandberg，L.，Enfors，S.O.，(1991).Factors influencinginclusion body formation in the production of a fused protein in Escherichia coli.Appl.Environ.Microbiol.57，1669-1674)。β-葡聚糖具有高粘度，分为水溶性和水不溶性两种。水溶性β-葡聚糖所占比例较大，与蛋白质结合的β-葡聚糖大都不溶于水，其中β-1，3键的含量和糖的聚合度是影响水溶性的主要素。β-葡聚糖在水中溶解成为粘性溶液，其浓度愈高，粘度愈大。高浓度β-葡聚糖会形成网结构，能够吸收其周围的水分子，从而降低周围环境的物理特性。β-葡聚糖表层带负电荷，在溶液中极易与带正电荷的物质结合。此外，β-葡聚糖还能吸附钙、锌、钠等金属离子以及有机质。

β-葡聚糖在实际应用中存在一些负面影响。在制造麦芽汁过程中，由于大量高分子β-葡聚糖存在，致使麦芽汁粘度增大，过滤困难；在发酵过程中过量的β-葡聚糖还会与蛋白质结合，使酵母早期沉淀。在动物饲养中，存在于饲料中的β-葡聚糖由于自身的种种限制因素(高粘性、高亲水性、高吸水活性及吸附性等)影响营养物质在动物体内的代谢，从而降低动物对营养物质的吸收效率。因此研究能降解葡聚糖的葡聚糖酶具有非常重要的理论和现实意义。β-1，3-1，4-葡聚糖酶作为一类重要的β-葡聚糖酶，主要来源于微生物，目前报道了60种不同种类的真菌能产生降解非淀粉多糖的酶类。在杆菌、梭菌、纤维菌、真菌中都发现了β-1，3-1，4-葡聚糖酶，β-1，3-1，4-葡聚糖酶也存在于植物中，但人和动物体内却是缺乏的(Wen T.N.，et al.Atruncated Fibrobacter succingenes 1，3-1，4-β-D-glucanase with improved enzymatic activity andthermotolerance.Biochemistry，2005，44：9197-9205)。同时由于天然来源的β-葡聚糖酶产量小，稳定性低，而且天然野生菌株培养困难，无法实现大规模的工业应用；因此通过基因工程手段构建高表达量重组工程菌越来越受到国内外的关注。

β-1，3-1，4-葡聚糖酶应用于啤酒工业，它可分解大麦及麦芽中的β-葡聚糖凝胶，降低麦汁粘度，提高麦汁的过滤速度、麦汁浸出率，减少胶状沉淀物，改善啤酒的混浊度，从而提高产品质量。β-葡聚糖酶在啤酒工业中的应用主要通过两个途径：一是添加外源β-葡聚糖酶，刘妙莲等(刘妙莲，林宇野，王洁，王薇青.β-葡聚糖酶(EC.3.2.1.73)的研究II.β-葡聚糖酶的性质及应用[J]，食品与发酵工业，1989)将来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的β-葡聚糖酶制剂添加于麦芽汁中，降低了麦芽汁粘度，改善了啤酒质量；二是改良酿酒酵母，黄兴奇等(黄兴奇，郑伟军，陈永青，宋大新.β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因亚克隆研究，西南农业学报，1990)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中分离得到的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因克隆到酿酒酵母(S.cerevisiae)中，表达良好。Courtois等(Courtois，J.E.，(1987).[Use of a filtrationenzyme with dominant beta-glucanase activity produced by Disporotrichum dimorphosporum，inbeer brewing].Bull.Acad.Natl.Med.171，693-694)克隆真菌的β-葡聚糖酶基因获得了一株酶分解能力较高的改良酵母菌株，能使麦芽汁粘度降低，加速过滤，提高麦芽汁收率，啤酒质量得到明显改善。

在饲料添加剂方面，经研究发现，反刍动物能够借助肠胃中的瘤胃微生物产生的β-葡聚糖酶消化利用β-葡聚糖，而单胃动物由于自身不具备合成β-葡聚糖酶的微生物以及分解β-葡聚糖的酶系，使食糜在肠道中具有较高的粘度，阻止肠道消化液与食糜的充分混合，从而阻止营养物质的吸收，降低了饲料的转化率，成为一种抗营养因子，限制了大麦等作物在饲料中的应用(Brenes，A.，Smith，M.，Guenter，W.，Marquardt，R.R.Effect of enzyme supplementationon the performance and digestive tract size of broiler chickens fed wheat-and barley-based diets[J].Poult.Sci.，1993，(72)：1731-1739.)。自20世纪90年代起，人们对葡聚糖酶作为饲料添加剂做了大量的研究。一般地，在饲料中添加酶制剂是为了了提高饲料的饲用价值，减小营养成分质量的差异，减小粪便的粘度等。在饲养中添加酶制剂后发现，消化性能好的和差的谷物之间饲养效果差异减小，在存在酶的情况下，谷物中的营养含量高于没有酶存在的情况。Ji等(Ji，F.，Casper，D.P.，Brown，P.K.，Spangler，D.A.，Haydon，K.D.，Pettigrew，J.E.Effects ofdietary supplementation of an enzyme blend on the ileal and fecal digestibility of nutrients ingrowing pigs[J].J.Anim.Sci.，2008，(86)：1533-1543)用大豆和大麦的混和饲料饲养猪仔，在饲料中添加β-葡聚糖酶后，干物质、粗蛋白和能量的消化率都直线增长。当添加葡聚糖酶含量为0.2％时，粗蛋白的消化率从81.6％上升至88.5％，能量的消化率从85.2％升至89.5％。Fang等(Fang，Z.F.，Liu，Z.L.，Dai，J.J.，Qian，H.Y.，Qi，Z.L.，Ma，L.B.，Peng，J.Effects ofenzyme addition on the nutritive value of broiler diets containing hulled or dehulled Chinesedouble-low rapeseed meals[J].J.Anim.Physiol.Anim.，2008，Nutr.(Berl))改变饲料中的大麦和玉米的比例，并在添加和不添加β-葡聚糖酶两个水平下进行实验研究β-葡聚糖酶对火鸡生长的影响。实验发现在不添加β-葡聚糖酶的情况下，当大麦的含量在250g/kg以上时，火鸡的日增重减少。在大麦含量为250g/kg的饲料中添加β-葡聚糖酶可以提高小鸡日增重。在糊浆饲料(其中大麦50％，玉米20％)添加β-葡聚糖酶可使小鸡的体重增加了4.5％，而且粘性粪便次数也明显地降低，既提高了生长速率也提高了饲料的转化率。

本申请人在公开号为CN101235366的发明专利申请中提供一种具有较高活性，适于工业化生产的从重组大肠杆菌XM-LU制备内切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶的方法。重组大肠杆菌XM-LU(已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2246)是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

发明内容

本发明的目的旨在提供重组毕赤酵母工程菌的构建方法。

本发明的另一目的旨在应用重组巴斯德毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-bgl发酵获得β-1，3-1，4-葡聚糖酶。

本发明所述重组毕赤酵母工程菌的构建方法包括以下步骤：

1)杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的获取

从重组大肠杆菌XM-LU中提取质粒pXMLu，以质粒pXMLu为模板，设计引物如下：

上游引物BGL1：5’--CG GAATTC ATG AAA CGA GTG TTG CT--3’，

下游引物BGL2：5’--AT GCGGCCGC ACC ATG AAA CGA GTG TTG CT--3’，

在杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因两端分别引入EcoR I和Not I两个酶切位点，PCR扩增得大小为717bp的杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因；

2)巴斯德毕赤酵母表达载体的构建

将获得的杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因用EcoR I和Not I双酶切，将双酶切后的杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因与经过EcoR I和Not I双酶切的载体pPIC9K连接，连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，得构建好的重组载体pPIC9K-bgl；

3)杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶重组毕赤酵母的构建及筛选

将重组载体pPIC9K-bgl线性化导入巴斯德毕赤酵母，经筛选得一株重组菌株，即重组毕赤酵母工程菌，将重组毕赤酵母工程菌命名为GS115/pPIC9K-bgl。

所述杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因来源于枯草芽孢杆菌，杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因214个氨基酸由Bacillus amyloliquefaciens的β-1，3-1，4-葡聚糖酶氨基端的107个氨基酸残基和107个来自于Bacillus macerans中β-葡聚糖酶碳端氨基酸残基组成，这个重组的基因通过Bacillusamyloliquefaciens中β-葡聚糖酶的自然启动子表达。

所述巴斯德毕赤酵母可采用巴斯德毕赤酵母GS115等。

所述重组毕赤酵母工程菌的应用为以重组巴斯德毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-bgl发酵获得β-1，3-1，4-葡聚糖酶。

本发明利用基因工程构建一种可高效表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶的重组巴斯德毕赤酵母工程菌，其表达杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力为1125 IU/mL，蛋白表达量为1.22g/L。β-1，3-1，4-葡聚糖酶具有酸碱稳定性、热稳定性好及催化pH范围广等优点，在酸性环境中的热稳定性大大高于单一的野生型β-葡聚糖酶，具有较好的工业应用前景。

附图说明

图1为实施例1中杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因bgl的PCR产物电泳。其中1号样品为DNA marker；2，3，4，5号样品为bgl的PCR产物；标记的基因大小从上至下分别为1.0Kb，700bp，500bp。

图2为实施例1中酵母重组子拷贝数筛选图。其中筛选得到11株重组菌。

图3为实施例1中酵母重组子基因组PCR验证；1号样品为DNA marker，2号样品为野生GS115基因组为模板，3～6样品分别为以AOX1/AOX2，BGL1/BGL2，AOX1/BGL2，BGL1/AOX2为引物。标记的基因大小从上至下分别为2.0Kb，1.5Kb，1.0Kb，750bp。

图4为实施例2中毕赤酵母重组子GS115/pPIC9K-bgl发酵过程中干重(正方形表示)，酶活力(圆形表示)及蛋白表达量(三角形)示意图，图中横座标为发酵时间Cultivation time/h，纵座标分别为酵母细胞生物量(干重)Dry cell weight/g·L^-1(■)、酶活力Enzymeactivity/U·mL^-1(●)和蛋白表达量Protein concentration/g·L^-1(▲)。

图5为实施例2中毕赤酵母重组子GS115/pPIC9K-bgl发酵过程中发酵液中β-1，3-1，4-葡聚糖酶的表达量的SDS-PAGE图。其中，样品1为蛋白质标记，样品2～8分别为诱导24、36、48、60、72、84、96小时的蛋白表达量；标记的蛋白大小为35kDa；箭头表示重组蛋白recombinantprotein。

图6为实施例3中β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最适反应pH(正方形表示)和pH稳定性(圆形表示)测定结果示意图。在图6中，横座标为pH值，纵座标为相对酶活力Relative enzymeactivity/％；■为pH optimum，●为stability。

图7为实施例3中β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最适反应温度(圆形表示)和热稳定性正方形测定结果示意图。在图7中，横座标为温度Temperature/℃，纵座标为相对酶活力Relative enzymeactivity/％；■为temperature optimum，●为stability。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例中使用的酶和试剂：限制性内切酶(Not I、EcoR I、Sac I)，DNA和蛋白分子量标准，E.coli JM109均购自大连宝生物公司；载体pPIC9K，菌株毕赤酵母GS115均购自Invitrogen公司；G418，地衣多糖购于Sigma公司。

实施例中使用的主要培养基：YPD，MD，有机培养基(BMGY/BMMY)，无机培养基BSM，可参见毕赤酵母操作手册。

实施例1：巴斯德毕赤酵母重组工程菌GS115/pPIC9K-bgl的制备

1)杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的获取

杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因来源于枯草芽孢杆菌。杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因214个氨基酸由两部分组成，即由Bacillus amyloliquefaciens的β-1，3-1，4-葡聚糖酶氨基端的107个氨基酸残基和107个来自于Bacillus macerans中β-葡聚糖酶碳端氨基酸残基组成。这个重组的基因通过Bacillus amyloliquefaciens中β-葡聚糖酶的自然启动子表达。表达的杂合β-葡聚糖酶在酸性环境中的热稳定性大大高于单一的野生型β-葡聚糖酶。

从重组大肠杆菌XM-LU(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2246)中提取质粒pXMLu，以该质粒为模板，设计引物如下：

上游引物BGL1：5’--CG GAATTC ATG AAA CGA GTG TTG CT--3’

下游引物BGL2：5’--AT GCGGCCGC ACC ATG AAA CGA GTG TTG CT--3’

在杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因两端分别引入EcoR I和Not I两个酶切位点，扩增条件为：95℃ 4min；(94℃ 1min；55℃ 1min；72℃ 1min；30个循环)，72℃ 10min，扩增得到的杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因大小约为717bp(见图1)。

2)巴斯德毕赤酵母表达载体的构建

将获得的杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因用EcoR I和Not I进行双酶切，并与同样经过EcoRI和Not I双切的载体pPIC9K进行过夜连接，连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，过夜培养后，得到的转化子经氨苄抗性和卡那霉素选择筛选出阳性克隆。提取质粒进行测序验证，测序结果表明序列完全正确；将构建好的重组表达载体命名为pPIC9K-bgl。

3)杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶重组毕赤酵母的构建及筛选

取构建好的重组表达载体pPIC9K-bgl 20μl，经限制性内切酶Sac I，在37℃下酶切24h，然后将酶切产物用无水乙醇沉淀，溶于10μl无菌水，加入80μl毕赤酵母GS115感受态细胞，冰浴5min，在1500伏电压(25μF)条件下电击，迅速加入1ml mol/L的山梨醇，于30℃倒置培养2h，然后将培养物涂布于含抗生素G418(0.25mg/ml)的MD平板上，30℃倒置培养2～5天，直至MD上长出清晰菌落。

重组菌拷贝数筛选：将MD上长出的菌落分别点接于含不同浓度G418(0.25、0.5、1.0、1.5、1.75、2.0、2.25、3.0mg/mL)的YPD培养基上，30℃培养三天，筛选出了11株高抗性(可在含2.0mg/ml G418的YPD培养基上生长)的重组毕赤酵母，此11株重组酵母均为8个拷贝数的重组菌(见图2)。

将筛选得到的8个拷贝数的重组菌在YPD上过夜培养，提取重组菌总基因组，以AOX1：5’--GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC--3’、AOX2：5’--GGC AAA TGG CAT TCT GACATCC--3’及BGL1和BGL2为引物，鉴定β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因是否整合进酵母染色体，结果(如图3)显示，泳道2为以野生的GS115的基因组为模板，以AOX1/AOX2为引物得到的条带；泳道3-6均以重组菌的总基因组为模板，其中泳道3为以AOX1/AOX2为引物得到的条带，泳道4为以BGL1/BGL2为引物同样得到的条带，而泳道5为以AOX1/BGL2得到的条带，泳道6为以BGL1/AOX2得到的条带，以上2-6泳道所得到的条带都与预期大小一致，由此说明β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因已成功导入毕赤酵母，获得了重组酵母工程菌。

挑取筛选出的11株重组菌，分别转接于含25mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，30℃，200转/分钟下，培养24小时OD＝4，收集菌体重悬于10mL的BMMY中，以1％的甲醇作为碳源，进行诱导表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶，以地衣多糖为专一性底物，测定其酶活力，最终从11株重组菌中筛选出了一株最优重组菌株，将这株最优重组菌株命名为巴斯德毕赤酵母GS115/pPIC9K-bgl。

实施例2：利用巴斯德毕赤酵母GS115/pPIC9K-bgl发酵生产β-1，3-1，4-葡聚糖酶

以巴斯德毕赤酵母GS115/pPIC9K-bgl为出发菌株，接种于4瓶分别装有50mL BMGY培养基的300mL摇瓶中，30℃，200转/分钟下，培养24小时OD＝4；将此200mL菌液接种于已灭菌的3.6L(含2L BSM无机培养基)自动控制发酵罐中，用氨水和磷酸调节pH至5.0，启动发酵罐，开始进行发酵，此时转速恒定在800转/分钟；25小时后，初始BSM中的甘油耗尽，开始进入甘油补加阶段，以50％的甘油，18mL/h继续流加4小时，待甘油耗尽，溶氧回升到接近100％；接着开始流加甲醇，将pH调至6.0，进入β-1，3-1，4-葡聚糖酶的分泌表达阶段；转速仍恒定在800转/分钟，溶氧设定为与甲醇流加相关联，以甲醇的流加调控溶氧，使溶氧维持在35％。发酵结束后，测定酶活。整个过程的最高酶活力高达1125U/mL、蛋白表达量为1.22g/L，酵母细胞生物量(干重)为88.5g/L(见图4)。

SDS-PAGE蛋白检测：在甲醇开始诱导表达后的，12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h的发酵液，用TCA方法沉淀蛋白，然后进行SDS-PAGE，蛋白电泳结果(如图5)显示，蛋白大小为34kDa。

实施例3：β-1，3-1，4-葡聚糖酶的酶学性质分析

一.最适反应pH和pH稳定性测定

最适反应pH：取稀释100倍的酶液25ul，加入0.05mol/L，用不同pH(pH3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，8.0)的醋酸钠缓冲液配制的0.5％地衣多糖500ul，测定在不同pH条件下β-1，3-1，4-葡聚糖酶的活力。以pH6.0时的相对酶活力定为100％，于50℃下测定酶活，其结果见图6，由图可知，β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最合适反应pH为6.0。

pH稳定性：将粗酶液置于不同pH(3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，8.0)的缓冲液(柠檬酸钠缓冲液)中，50℃放置60min，然后将pH调回6.0，在50℃下进行酶学反应，测定剩余酶活力，以相对酶活力最高的定为100％。由图6可知，pH4.0～8.0之间经酸处理60min后，酶活力仍达到80％以上，说明β-1，3-1，4-葡聚糖酶具有相当好的酸碱稳定性。

二.最适反应温度和热稳定性测定

最适反应温度：取稀释100倍的粗酶液25ul，加入500ul 0.5％地衣多糖(用0.04mol/L，pH6.0醋酸缓冲液配制)，在不同温度(30℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃)条件下进行酶学反应，测定β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力，其结果如图7，以相对酶活力最高者为100％，β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力在50℃时，其酶活力达到最高，因此其最适反应温度为50℃。

热稳定性：将酶液分别在30℃，40℃，50℃，60℃，70℃条件下保温150min，然后在50℃，pH 6.0条件下进行酶学反应，测定残余酶活力以相对酶活力最高者为100％，结果如图7所示，酶液在30～65℃之间保温150min，仍具有60％以上的酶活力，说明β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力具有较好的热稳定性。

酶学性质分析表明杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因表达的杂合β-葡聚糖酶在酸性环境中的热稳定性大大高于单一的野生型β-葡聚糖酶。

SEQUENCE LISTING

<110>厦门大学

<120>杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶重组毕赤酵母工程菌的构建

<130>09N118

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>引物1-BGL1

<400>1

cggaattcat gaaacgagtg ttgct                25

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>引物2-BGL2

<400>2

atgcggccgc accatgaaac gagtgttgct           30

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>质粒片断1-AOX1

<400>3

gactggttcc aattgacaag c                    21

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>质粒片断2-AOX2

<400>4

ggcaaatggc attctgacat cc                        22

Claims (5)

1.重组毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1)杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的获取

从重组大肠杆菌XM-LU中提取质粒pXMLu，以质粒pXMLu为模板，设计引物如下：

上游引物BGL1：5’--CG GAATTC ATG AAA CGA GTG TTG CT--3’，

下游引物BGL2：5’--AT GCGGCCGC ACC ATG AAA CGA GTG TTG CT--3’，在杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因两端分别引入EcoR I和Not I两个酶切位点，PCR扩增得大小为717bp的杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因；

2)巴斯德毕赤酵母表达载体的构建

将获得的杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因用EcoR I和Not I双酶切，将双酶切后的杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因与经过EcoR I和Not I双酶切的载体pPIC9K连接，连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，得构建好的重组载体pPIC9K-bgl；

3)杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶重组毕赤酵母的构建及筛选

将重组载体pPIC9K-bgl线性化导入巴斯德毕赤酵母，经筛选得一株重组菌株，即重组毕赤酵母工程菌。

2.如权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于所述杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因来源于枯草芽孢杆菌。

3.如权利要求1或2所述的重组毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于所述杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因214个氨基酸由Bacillus amyloliquefaciens的β-1，3-1，4-葡聚糖酶氨基端的107个氨基酸残基和107个来自于Bacillus macerans中β-葡聚糖酶碳端氨基酸残基组成，重组的基因通过Bacillus amyloliquefaciens中β-葡聚糖酶的自然启动子表达。

4.如权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于所述巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。

5.以权利要求1所述的重组巴斯德毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-bgl发酵获得β-1，3-1，4-葡聚糖酶。

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