CN102757947B - 一种热稳定性改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种热稳定性提高的木聚糖酶xyn-CDBFV-m及其基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。为了提高瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶xyn-CDBFV的热稳定性，使其能够抵御饲料制粒时的高温，以便于在饲料中得到应用。本发明利用蛋白质工程的手段，在木聚糖酶xyn-CDBFV的N端引入二硫键；消除了两个B-factor比较高的区域；和在分子表面引入盐键的方法，最终得到了一个热稳定性明显提高的木聚糖酶xyn-CDBFV-m。本发明获得木聚糖酶xyn-CDBFV-m，在80℃处理4min还能保留56.7％的酶活性，使其可以抵御饲料在制粒时短暂的高温处理，显示出巨大的应用潜力。

Description

一种热稳定性改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种热稳定性改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m及其基因、包含该基因的重组载体和应用。

背景技术

木聚糖是一种五碳糖，是植物细胞中重要的结构多聚糖，在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，约占细胞干重的35％。木聚糖是半纤维素的重要组分，它是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一。木聚糖也广泛存在于饲料原料中，如玉米、麦麸、米糠、秸秆、豆粕等。富含于饲料中的非淀粉多糖(Non-starch Polysaccharides，NSPs)是重要的抗营养因子，其中含量较高的木聚糖的抗营养作用主要表现为：木聚糖本身难以被单胃动物消化，同时结合大量的水，使采食动物消化道中食糜的体积增大、粘度增加、养分与消化道内源酶的作用降低，从而阻碍营养物质，尤其是脂肪和蛋白质的消化吸收，降低饲料的利用率。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖或木糖的一类酶的总称，一般指内切β-1，4木聚糖酶。木聚糖酶可以有效地从木聚糖的主链内部作用于木糖苷键，将高分子量的木聚糖，降解为低分子量的低聚糖。研究结果表明，饲料中如果添加木聚糖酶，就可显著降低阿拉伯木聚糖分子大小，将其分解成较小聚合度的低聚木糖，从而改善饲料性能，消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用总而言之木聚糖酶可以破坏植物细胞壁结构，提高各种类型饲料的利用率；降解可溶性多糖，降低其粘性；减少畜禽肠道疾病；增进畜禽健康，提高成活率；减少粘粪，降低空气中氨气和硫化物浓度；减少粪便排出和脏蛋；使畜禽体重均匀；减少环境污染。因此，木聚糖酶在饲料资源开发和提高廉价副产品的利用率方面，具有广阔的应用前景。

和其他的酶制剂不同，用于饲料上的酶制剂，需要经历一个高温制粒的过程，因为在饲料制粒时的高温处理，可以将饲料转化率提高10％，料肉比提高；避免畜禽挑食，达到均衡营养；增大密度，仓储运输费用降低；流动性好，饲养方便；减少喂养过程、畜禽食料过程及自然环境造成的饲料损失；有效杀灭饲料中的沙门氏菌达到绿色饲料要求等优点。因此饲料用酶需要较好的热稳定性，能够抵御在制粒过程中的高温处理。虽然目前发现的木聚糖酶比较多，但能够直接应用于饲料的天然木聚糖酶却很少，在饲料行业的木聚糖酶需要具备一些特殊的性质，如好的热稳定性。大多数木聚糖酶在饲料制粒的过程中都会大幅度失活，因此耐高温的酶有更好的应用前景。来源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶催化结构域xyn-CDBFV是一种性质优良的木聚糖酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，基因序列如SEQ ID NO.4所示)，其表达量及pH活性特征都比较适合在单位动物体内发挥水解木聚糖的作用。但该酶不能抵御在制粒过程中的高温，在高温制粒的过程中有大量的酶失活，因此提高该木聚糖酶的热稳定性，使其能够有效地在饲料工业上应用。

目前通过蛋白质工程的手段在酶分子改造方面已经有很多成功的例子，特别是在提高酶的热稳定性。定点突变即理性设计是在已知酶的结构与功能的基础上有目的、有针对性地改变酶的某一活性基团或模块，最终获得特定氨基酸残基的具有性质得到预期改变的蛋白质，该技术已被广泛用于酶分子的改造。

发明内容

本发明的目的是通过对来源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶的改造，使改造后的木聚糖酶xyn-CDBFV-m在高温时稳定性提高，能够抵御饲料高温制粒时由于温度过高造成酶蛋白的变性，使其能够更好的在饲料中内发挥水解木聚糖的作用。

本发明的目的是提供一种优化改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m及其基因。

本发明的再一目的是提供包含上述的木聚糖酶基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述的木聚糖酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供上述木聚糖酶xyn-CDBFV-m的应用。

本发明的木聚糖酶xyn-CDBFV-m和原有木聚糖酶xyn-CDBFV相比，有16个氨基酸发生了突变或删除，突变位点分别是A33C，Y58C，N88P，P122T，D124T，W125S，V126L，D176E，以及第90，91和92位点删除，和第128到132位点删除。突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

QSFCSSASHSGQSVKVTGNKVGTIGGVGYELWCDSGNNSATFYSDGSFSCTFQNAGDCLCRSGLSFDSTKTPSQIGRMKADFKLVKQPSGYSYVGVYGWTRSPLVEYYIVDNWLSPFPTGTSLGSFTIDGAQYTVYENTRTGPSIDGDTTFNQYFSIRQQARDCGTIEISAHFDQWEKLGMTMGKLHEAKVLGEAGNVNGGASGTADFPYAKVYIGD

本发明还提供了上述改良的耐高温木聚糖酶xyn-CDBFV-m的基因序列，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示：

CAATCCTTCTGTTCCAGCGCTTCTCACTCTGGACAATCCGTCAAGGTCACCGGCAACAAGGTTGGAACTATCGGTGGTGTTGGTTACGAGCTGTGGTGTGATAGTGGTAATAACTCCGCTACCTTCTACTCTGACGGATCCTTCTCGTGCACTTTCCAGAACGCTGGCGACTGTTTGTGTAGATCCGGTTTGTCTTTCGACTCCACTAAGACCCCATCTCAAATCGGTCGTATGAAGGCTGACTTCAAACTTGTCAAACAACCTTCCGGTTACTCCTACGTTGGTGTTTACGGTTGGACTAGATCCCCTTTGGTCGAGTACTACATTGTCGACAACTGGCTTTCTCCATTCCCAACTGGTACTTCTCTTGGATCTTTCACTATCGACGGTGCCCAATACACTGTCTACGAGAACACTAGAACTGGTCCATCTATTGACGGTGACACCACCTTCAATCAGTACTTTTCCATTAGACAACAAGCTAGAGACTGTGGTACCATTGAAATCTCTGCTCACTTTGACCAATGGGAGAAGTTGGGAATGACCATGGGTAAGTTGCATGAAGCCAAGGTTTTGGGTGAAGCCGGTAACGTCAACGGTGGTGCCTCTGGTACCGCTGATTTCCCTTACGCAAAGGTTTACATCGGTGACTAA

本发明还提供了包含上述优化改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m的重组载体，将本发明的优化改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木聚糖酶xyn-CDBFV-m插入到质粒pPIC9上的EcoRI和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-xyn-CDBFV-m。

本发明还提供了包含上述木聚糖酶xyn-CDBFV-m的重组菌株，所述重组菌株为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选重组菌株是毕赤酵母菌株GS115。

本发明还提供了上述木聚糖酶xyn-CDBFV-m在饲料添加剂中的应用，主要涉及所述木聚糖酶在制备饲料添加剂中的用途，以及相应的饲料添加剂，所述饲料添加剂的有效成分可以是所述木聚糖酶多肽、表达木聚糖酶多肽的宿主细胞。

本发明优选采用理性设计的方法，其一、在木聚糖酶的N端引入二硫键，即33位的丙氨酸和58位的苯丙氨酸分别替换为半胱氨酸；其二、消除了两个B-factor因子比较高的区域，即分别将88位到93位的NSSNVG突变为PSG；121位到131位的PPGDWVGNKKH突变为PTGTSL；其三、在分子表面增加盐键，将xyn-CDBFV中的第176位的天冬氨酸突变为谷氨酸后，可以明显的与第77位的精氨酸形成盐键，该盐键可以稳定相邻的两个beta折叠片。

本发明通过理性设计，在木聚糖酶的催化结构域xyn-CDBFV的N端引入二硫键，消除B-Factor值高的区域，以及在分子表面增加盐键的手段，对木聚糖酶xyn-CDBFV进行改良，最终得到了一个热稳定性提高的木聚糖酶xyn-CDBFV-m。与木聚糖酶xyn-CDBFV相比，突变后的酶的热稳定性得到了明显的提高，在80℃高温处理30分钟仍然能够保留80％左右的酶活性。木聚糖酶xyn-CDBFV-m具有比较好的性质，可以弥补目前饲料行业使用的木聚糖酶，在饲料高温制粒时酶活性损失过多的缺陷，同时xyn-CDBFV-m能在毕赤酵母中得到高水平的表达，因此该木聚糖酶xyn-CDBFV-m可以更适合用于饲料行业。

本发明利用基因工程手段对来源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum木聚糖酶xyn-CDBFV的进行改良，以解决该木聚糖酶在饲料高温制粒时酶活性损失过多的缺陷，经过优化改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m在80℃条件下的热稳定性得到了很大的提高，进一步满足了饲料用酶的要求，因此，本发明的优化改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m可在饲料工业中显示出巨大的应用潜力。

附图说明

图1木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m的最适pH。

图2木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m的pH稳定性。

图3木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m的最适温度。

图4木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m的热稳定性。

具体实施方式

实验条件：

1、菌株与载体

大肠杆菌菌株ToplO、Escherichia coli BL21(DE3)、表达载体pET-22b(+)(购自Novagen公司)。毕赤酵母GS115、载体pPIC9(购自Invitrogen公司)。

2、酶类及其他生化试剂

Fast pfu购自全式金公司，内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。X-Gal、IPTG、植酸钠等底物购自Sigma公司，其它都为国产试剂。

3、培养基

大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母筛选培养基为MD(葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，生物素4×10^-4g/L，YNB 13.4g/L)。

酵母诱导培养基BMGY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))和BMMY(除以1％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。

本发明中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版.2001)；Kriegler，GeneTranfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和James M.Cregg，PichiaProtocols(第一版，1998)。

实施例1、与木聚糖酶xyn-CDBFV热稳定相关突变的理性设计

(1)同源建模

将来自于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶催化结构域xyn-CDBFV，同源建模是以Bacillus subtillis B230木聚糖酶的晶体结构(PDB：1IGO)为模板，通过SWISS-MODEL服务器中的Model模块进行同源比较建模方式来完成，并将其命名为xyn-NP.pdb，利用Deepview/Swiss-PdbViewer软件进行三维立体模型浏览分析。

(2)二硫键设计及选择

本发明利用二硫键设计软件Disulfide by Design(version 1.20)对xyn-NP.pdb进行二硫键的预测分析。经分析在xyn-NP.pdb的三维结构中存在24个可以形成二硫键的潜在位点。它们分别是：33位和58位；43位和47位；46位和62位；51位和209位；61位和198位；61位和200位；70位和74位；83位和214位；88位和93位；88位和95位；90位和206位；92位和118位；93位和117位；93位和206位；94位和204位；98位和113位；102位和195位；115位和169位；130位和142位；134位和183位；141位和164位；144位和163位；176位和179位；184位和189位。但进一步通过二硫键的形成部位及预测的能量分析，基本确定N端的33位和58位形成的二硫键更有利于提高木聚糖酶xyn-CDBFV的热稳定性。因此分别将33位的丙氨酸和58位的苯丙氨酸分别替换为半胱氨酸，以用于该位点形成二硫键。

(3)B-factor分析

现在有许多理论和研究用来研究影响蛋白质热稳定性的因素，例如热稳定的蛋白质的结果比中温蛋白质包装的紧密。蛋白质的B-factor主要用来反应蛋白质中特定氨基酸的稳定性的一个指标，如果某个氨基的B-Factor的值比较大，则表示该氨基酸或该区段结构不够稳定，在自然条件下可能变化比较大。

利用Deepview/Swiss-PdbViewer软件，我们发现在木聚糖酶xyn-CDBFV中存在两个B-factor值非常高的区域，这两个区域分别为：88位到93位的氨基酸；以及121位到131位的氨基酸。该两个区域在木聚糖酶xyn-CDBFV中都比较松散，与周围的氨基酸结合不够紧密。蛋白质这种表面突起的无规则转曲不利于蛋白自身的稳定，通过其他热稳定较好的木聚糖酶比较分析，将这两个区域进行了改良。分别将88位到93位的NSSNVG突变为PSG；121位到131位的PPGDWVGNKKH突变为PTGTSL。

(4)盐键分析

蛋白的酸性或碱性氨基酸侧链在生理环境中是带正电或负电的，随着蛋白的卷曲折叠，当正负基团相互接近时，则通过静电吸引而形成盐键，通常盐键也被成为盐桥。盐桥可以使蛋白质保持紧密和牢固的构像，并且使其热稳定性提高。盐桥结构对木聚糖酶的热稳定性有一定的作用。本发明通过分析将xyn-CDBFV中的第176位的天冬氨酸突变为谷氨酸后，可以明显的与第77位的精氨酸形成盐键，该盐键可以稳定相邻的两个beta折叠片。

将以上理性设计的突变位点都汇总到一个新的木聚糖酶基因上，并将其命名为xyn-CDBFV-m。

实施例2、木聚糖酶催化结构域基因xyn-CDBFV及xyn-CDBFV-m的合成

将来自于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶催化结构域基因xyn-CDBFV及xyn-CDBFV-m，按照毕赤酵母密码子的偏爱性(赵翔，2000)，在不改变其氨基酸序列的前提下进行序列改造。改造中避免GT......AG这一形式的位点，尽量避免富含AT(如ATTTA、AATAA、AATTAA等)序列的出现，该些序列与mRNA的稳定性有关。将改造设计好的基因序列送南京金瑞斯公司进行全基因合成。

实施例3、重组表达载体pET-22b(+)-xyn-CDBFV及pET-22b(+)-xyn-CDBFV-m的构建

根据合成基因的序列设计PCR引物5’端含有Nco I内切酶位点，3’端含EcoR I内切酶位点，引物序列如下：

5’端引物pET-xyn-F：GCACCCATGGGACAATCCTTCTGTTCCAGCGC；3’端引物pET-xyn-R：GCACGAATTCTTAGTCACCGATGTAAACCTTTG；以合成基因为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增得到的片段克隆到载体pET-22b(+)上，得到重组载体pET-22b(+)-xyn-CDBFV。

pET-22b(+)-xyn-CDBFV-m的构建和以上载体一样，其引物分别为5’端引物pET-xyn-m-F：GCACCCATGGGACAATCCTTCTGTTCCAGCG；3’端引物pET-xyn-m-R：GCACGAATTCTTAGTCACCGATGTAAACCTT。

实施例4木聚糖酶xyn-CDBFV及xyn-CDBFV-m在大肠杆菌中的表达

实施例3中所述两种表达载体pET-22b(+)-xyn-CDBFV和pET-22b(+)-xyn-CDBFV-m转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，分别获得重组菌株pET-22b(+)-xyn-CDBFV(DE3)，和pET-22b(+)-xyn-CDBFV-m(DE3)。

取含有重组质粒的BL21(DE3)菌株和含有pET-22b(+)空质粒的BL21(DE3)菌株(作为对照)，分别接种于3mLLB(含100μg/mLAmp)培养液中，37℃快速振荡培养过夜。分别取100μL过夜培养液加入含Amp的10mL LB培养液(1％接种量)中，快速振荡培养约2～3h(OD₆₀₀达到0.6～0.8)，后加入终浓度0.6～0.8mmol/L的诱导剂IPTG，37℃继续振荡培养约4h，或30℃振荡培养约6h，12,000rpm离心5min，分别收集培养基上清和沉淀，细胞沉淀用pH6.0的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液重悬，超声波破碎后12,000rpm离心10min。分别检测培养基上清和细胞破碎液中木聚糖酶的活性。木聚糖酶的酶活力测定采用DNS法。具体方法如下：向试管中加入900μL 1％燕麦木聚糖底物，置于60℃水浴预先保温5min，加入100μL适当稀释的酶液，于60℃水浴准确保温10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却到室温后540nm测定OD值。经过计算木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m在大肠杆菌中诱导表达，表达上清液的木聚糖酶活性分别为18.9和22.3U/mL。同时各种提取液取出20μL加入5×电泳上样缓冲液，沸水煮5min，与同样处置的含有空质粒pET-22b(+)-lic的菌体BL21进行SDS-PAGE电泳检测。酶活测定结果及SDS-PAGE结果都表明，两个木聚糖酶基因在大肠杆菌中得到了明显的活性表达。

实施例5、木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m的纯化

木聚糖酶xyn-CDBFV纯化的具体过程是，将pET-22b(+)-xyn-CDBFV(DE3)摇瓶表达的上清液用中空纤维进行浓缩。然后在每100mL的浓缩液中缓慢加入36.1g的硫酸铵(相当于60％的硫酸铵饱和度)，并不断搅拌3h。然后12,000rpm离心10min，收集沉淀。沉淀用少量pH 8.0的20mM Tris-HCl缓冲液溶解，并在大量该缓冲液中透析过夜。透析后的溶液过阴离子柱(HiTrap Q Sepharose XL 5mL)进行纯化。阴离子柱事先用pH 8.0的20mM Tris-HCl缓冲液平衡，上样后用0～1.0mol/L线性梯度的NaCl溶液洗脱，收集有木聚糖酶活性的洗脱管。收集液再用PEG8000处理，使其浓缩，浓缩液过分子筛(Superdex 75 10/300 GL column)进一步纯化。分子筛事先用磷酸盐缓冲液(50mmol/L，pH 7.0)平衡，上样后以同样缓冲液0.5mL/min的速度洗脱。收集有木聚糖酶活性的洗脱管，经SDS-PAGE确认后用于酶学性质的分析。木聚糖酶xyn-CDBFV-m的纯化方法和木聚糖酶xyn-CDBFV基本一样。

实施例6、对木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m的部分性质分析

(1)木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m的最适pH和pH稳定性经纯化的木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m，在60℃下，不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH3.0～8.0的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液，pH8.0～9.0的0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液，以及pH9.0～10.0的Gly-NaOH缓冲液。其结果如图1所示，这两个木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m的最适pH曲线稍有改变，xyn-CDBFV-m最适pH比xyn-CDBFV有所降低，由原先的6.0，降低到了5.5。同时xyn-CDBFV-m在酸性条件下的相对酶活性有一定的提高。

将纯化好的木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m，稀释到一定浓度，在pH 3-10的缓冲液中，37℃放置1h。然后再在60℃，pH 6.0的条件下测定酶活，通过计算相对酶活来分析木聚糖酶在不同pH条件下的稳定性，结果如图2所示。从图2可见，这两个木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m的pH稳定性曲线基本没有改变，只是在碱性条件下xyn-CDBFV-m更稳定点。

(2)木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m的最适温度和热稳定性

将纯化好的木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m稀释到所需浓度，取50μL分别在40、50、55、60、65、70、80、90℃温度下测定酶活，计算相对酶活，以确定该酶的最适温度。其结果如图3所示，xyn-CDBFV-m的最适温度有了明显的提高，从60℃提高到了70℃，并且在80℃时的相对酶活仍然能够维持在50％以上。由此可见，通过理性设计xyn-CDBFV-m最适温度得到了明显的提高。

将纯化好的木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-CDBFV-m稀稀释到所需浓度，取2mL在80℃保温。接着分别在2、4、6、8、10、15、20min取出100μL酶液稀释到所示浓度。在60℃，pH 6.0的条件下测定酶活，以未处理的原酶液作为100％的对照。其测定结果如图4所示，xyn-CDBFV-m在80℃的热稳定性有了明显的提高，在80℃处理4min还能保留56.7％的酶活性，处理10min后还有22.8％的剩余酶活性。而xyn-CDBFV在80℃处理2min酶活性就损失了75％，10min酶活性完全损失。xyn-CDBFV-m在80℃的稳定性实验结果表明，该木聚糖酶能够抵御饲料高温(80℃左右)制粒时短暂的高温处理。因此，本发明的优化改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m可在饲料工业中显示出巨大的应用潜力。

实施例7、木聚糖酶xyn-CDBFV-m在毕赤酵母中的高效表达

(1)表达载体的构建及在酵母的表达

以合成的木聚糖酶xyn-CDBFV-m为模板，设计合成了带有EcoR I和Not I限制性酶切位点的引物pIC9-xyn-F和pIC9-xyn-R，对xyn-CDBFV-m的成熟蛋白的编码区进行扩增。并利用EcoR I和Not I酶切PCR产物，连接进入表达载体pPIC9(Invitrogen，San Diego)，使木聚糖酶xyn-CDBFV-m插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体pPIC9-xyn-CDBFV-m，转化大肠杆菌感受态细胞JM109。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。约8微克的用限制性内切酶BglII进行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GS115感受态细胞，涂布于组氨酸缺陷性的RDB平板，30℃培养2-3天，挑取在RDB平板上生长的转化子进行进一步的表达实验。

酵母表达引物序列如下：

pPIC9-xyn-m-F：GCACGAATTCCAATCCTTCTGTTCCAGCGC

pPIC9-xyn-m-R：GCACGCGGCCGCTTAGTCACCGATGTAAACCTTTG

(2)高木聚糖酶活性转化子的筛选

用灭过菌的牙签从长有转化子的RDB板上挑取单菌落，按照编号先点到MM上，再点到相应编号的MD平板上，每个平板上点100个单菌落，共计500个转化子；将点有转化子的MM、MD平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从MD平板上挑取转化子接种于装有3mL BMGY培养基的离心管中，30℃、260rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液3,000×g离心15min，去上清，离心管中再加入1mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，在30℃、260rpm诱导培养；诱导培养48h后，3,000×g离心5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出高木聚糖酶活性的转化子。

(3)高木聚糖酶活性转化子在发酵罐水平的小试表达

高细胞密度发酵用3.7-L发酵罐进行实验，按照Invirogen公司的毕赤发酵过程指导(Pichia Fermentation Process Guidelines)操作。将上述获得的高木聚糖酶活性的转化子进行发酵罐水平高密度发酵试验。随着甲醇诱导时间的延长，发酵上清液中木聚糖酶酶活力显著增加。诱导156h后木聚糖酶活性可达57,364U/mL，菌体湿重达353g/L。

Claims (9)

1.一种热稳定性改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种热稳定性改良的木聚糖酶基因xyn-CDBFV-m，其特征在于，其编码权利要求1所述的木聚糖酶xyn-CDBFV-m。

3.根据权利要求2所述的木聚糖酶基因xyn-CDBFV-m，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2所述的木聚糖酶基因xyn-CDBFV-m的表达载体。

5.包含权利要求2所述的木聚糖酶基因xyn-CDBFV-m的表达载体pPIC9-xyn-CDBFV-m，将木聚糖酶基因xyn-CDBFV-m插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组表达载体pPIC9-xyn-CDBFV-m。

6.包含权利要求2所述的木聚糖酶基因xyn-CDBFV-m的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞。

8.包含权利要求1所述的木聚糖酶xyn-CDBFV-m的饲料添加剂。

9.权利要求1所述的木聚糖酶xyn-CDBFV-m用于水解木聚糖的应用。

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