CN102994479B - 一种甘露聚糖酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型的甘露聚糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。并将该酶分别转化入里氏木霉和毕赤酵母中，构建重组表达工程菌株。本发明提供了一个新型甘露聚糖酶基因，并分别构建了重组表达该基因的毕赤酵母工程菌和里氏木霉工程菌。所述毕赤酵母工程菌和里氏木霉工程菌所产甘露聚糖酶的最适作用pH为4.5，最适作用温度为60℃。本发明的甘露聚糖酶耐酸，耐高温，可广泛用作饲料添加剂，能有效提高饲料的利用率，从而减少养殖中饲料的使用量，节约粮食资源和养殖成本，增加生产效益。

Description

一种甘露聚糖酶

技术领域

本发明属于微生物工程生物技术领域，具体涉及一种新型的甘露聚糖酶，及用于表达该酶的重组表达工程菌。 

背景技术

甘露聚糖酶包括外切酶、内切酶和甘露糖苷酶，三种酶的协同作用才能将甘露聚糖彻底降解。其中，β-1, 4-D-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）又称为甘露聚糖酶，属于内切酶；它能水解含有β-1, 4-D-甘露糖苷键，生成甘露寡糖或甘露多糖，属于半纤维素酶类。甘露聚糖是以β-1, 4-D-吡喃甘露糖苷键连接的线状多糖, 如果主链某些残基被葡萄糖取代, 或半乳糖通过α-1, 6-糖苷键与甘露糖残基相连形成分支, 则称为异甘露聚糖, 主要有半乳糖甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖（齐军茹等，2002，中国食品添加剂；许牡丹等，2006，动物医学进展）。 

甘露聚糖酶在饲料、食品、造纸、石油开采及生物研究技术等多方面具有广泛的应用前景；因此，甘露聚糖酶的研究和开发越来越多。甘露聚糖是仅次于木聚糖的第二大的半纤维素成分。饲料的主要原料如豆粕、小麦和麸皮等的细胞壁主要成分是甘露聚糖；一方面它是非淀粉多糖的抗营养因子；另一方面，低聚甘露糖具有的保健功能（陈小兵等，2005，生物工程杂志；Chesson A, etc., 1987, In Recentt Advance in Animal Nutrition）。因此，甘露聚糖酶业已是饲料酶制剂使用量最大的单酶之一。 

产甘露聚糖酶的微生物很多，包括芽孢杆菌和丝状真菌等。而工业化生产甘露聚糖酶的菌株主要来自诱变选育的高产菌株或高效表达的基因工程菌，如通过诱变选育芽抱杆菌AM-001的甘露聚糖酶的酶活力由36 U/ml提高到了430U/ml 耐。美国ChamGen公司选育的迟缓芽孢杆菌产甘露聚糖酶活力达到了400U/ml。但是，随着分子生物学技术的发展，利用工程菌异源高效表达生产甘露聚糖酶是当前的主要手段。利用毕赤酵母表达生产来自Bacillus subtilis的甘露聚糖酶其酶活达到约40000U/ml；同样，毕赤酵母表达生产来自曲霉的甘露聚糖酶其酶活达到约343U/ml（李松瑜等，2009，生物技术通讯）。 

目前已商业化的甘露聚糖酶主要来自芽孢杆菌、木霉和青霉。芽孢杆菌所产甘露聚糖酶属于中性甘露聚糖酶，最适pH为6.5，不耐胃酸和胃蛋白酶。木霉和青霉所产甘露聚糖酶虽具有耐酸性特点，但是不耐受胃蛋白酶。而甘露聚糖酶在单胃动物体内的作用位点决定了饲料中使用的甘露聚糖酶必须是酸性的。 

因此，为了更好的提高单胃动物对含甘露聚糖饲料的利用率，就需要获得能够在低pH条件下具有高活性的甘露聚糖酶。 

发明内容

本发明的目的是提供一种新型甘露聚糖酶及其重组表达工程菌。本发明通过将来源于斜卧青霉（Penicillum decumbens）的甘露聚糖酶基因分别转化入里氏木霉和毕赤酵母中，构建重组表达工程菌株。本发明的甘露聚糖酶可广泛用作饲料添加剂，提高养殖动物的饲料利用率。 

本发明一个方面提供一种新型的甘露聚糖酶，其特征在于： 

1）其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的甘露聚糖酶； 

2）其氨基酸序列与SEQ ID NO: 1同源性高于75%的甘露聚糖酶； 

3）在1）或2）中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有甘露聚糖酶活性的酶。 

本发明另一方面提供了编码上述甘露聚糖酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。 

本发明的甘露聚糖酶，去掉信号肽后的氨基酸序列为SEQ ID NO: 3。其核苷酸的序列为SEQ ID NO: 4。 

本发明提供了一种表达载体，其包含上述编码基酸序列为SEQ ID NO: 3的甘露聚糖酶的核苷酸。 

本发明另一方面提供了一种表达宿主细胞，其携带有表达上述去掉信号肽的甘露聚糖酶基因的表达载体。 

上述表达宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。 

上述表达宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。 

本发明的甘露聚糖酶用于制备饲料添加剂。 

本发明提供了一个新型甘露聚糖酶基因，并分别构建了重组表达该基因的毕赤酵母工程菌和里氏木霉工程菌。所述毕赤酵母工程菌和里氏木霉工程菌所产甘露聚糖酶的最适作用pH为4.5，最适作用温度为60℃。本发明的甘露聚糖酶耐酸，耐高温，可广泛用作饲料添加剂，能有效提高饲料的利用率，从而减少养殖中饲料的使用量，节约粮食资源和养殖成本，增加生产效益。 

附图说明

图1 ：毕赤酵母工程菌发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图，其中箭头所指处即为重组表达的甘露聚糖酶。 

图2 ：里氏木霉工程菌发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图，箭头所指 处即为重组表达的甘露聚糖酶。 

图3： 重组表达的甘露聚糖酶最适作用pH分析图。 

图4： 重组表达的甘露聚糖酶最适作用温度分析图。 

具体实施方式

以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。 

实施例1 斜卧青霉甘露聚糖酶基因的克隆 

1.1  总DNA的提取 

将斜卧青霉（P. decumbens）过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS); 然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl 10M NH₄AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000 rpm离心10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。 

1.2  总RNA的制备 

OMEGA公司的E.Z.N.A. Fungal RNA Kit制备斜卧青霉的mRNA，其制备过程参照试剂盒的操作手册。 

1.3 基因克隆 

以1.1中提取的基因组总DNA为模板，分别利用引物对（ATGTTGTACT CATCGGCG和TCAGATCGCAGCGACATG）进行PCR扩增。PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 40S；58℃ 35S，72℃ 1.2min 25个循环；72℃ 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。 

以1.2中提取的基因组总RNA为模板，扩增其cDNA序列。采用TaKaRa公司的PrimeScript RT-PCR Kit扩增cDNA基因序列。 

1.4测序分析 

将1.2中回收的扩增产物分别连接到pMD18 T-载体，相应的克隆载体分别命名为pMDT-Man1和pMDT-Man2；最后把阳性克隆送至北京华大基因研究中心进行测序分析。测序经比对发现DNA序列和cDNA序列间完全同源，这说明该基因序列没有内含子序列。该甘露聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。 

经NCBI的BLAST比对分析显示，SEQ ID NO: 2与Neosartorya fischeri 菌的甘露聚糖酶基因（序列号： XM_001262743.1）核苷酸序列同源性最高，同源性为73%；而蛋白序列分析显示，该酶属于糖水解酶第2家族，SEQ ID NO: 1与Penicillium chrysogenum菌的甘露聚糖酶序列同源性最高，二者的同源性为72%。 

经SignalP4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测分析显示，前16aa残基为信号肽序列，去掉信号肽的甘露聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 3，其编码基因序列为SEQ ID NO: 4。 

实施例2 表达序列为SEQ ID NO: 3甘露聚糖酶基因的工程菌的构建

2.1 毕赤酵母工程菌的构建 

以质粒pT-Man2为模板，利用引物（agtgaattcCAGGTGGCGGAATATGGCC和agtgcggccgcTCAGATCGCAGCGACATG进行PCR扩增，PCR扩增条件是95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1.2min 30个循环；72℃ 7min。扩增产物凝胶回收后，先进行Eco RI和Not I双酶切。同样，对表达质粒pPIC9K也进行Eco RI和Not I双酶切。用T4连接酶把双酶切产物即克隆基因和表达载体4℃连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌BL21。相应的阳性克隆表达质粒命名为pPIC-Man，测序结果表明插入了序列为SEQ ID NO: 4的片段。 

表达质粒pPIC-Man用Bgl II酶切电泳鉴定后，经乙醇沉淀浓缩，测定DNA浓度，以3μg/μL浓度稀释质粒片段保存备用。制备毕赤酵母GS115电转化感受态细胞，最后重悬于1 mL预冷的电泳缓冲液中(含1mM MgCl₂，10mM HEPES, 250mM 蔗糖, pH 7.8)。在80μL感受态细胞中加入5μL线性化重组质粒；电转化（条件为1500V、200Ω、25μF）；最后涂布于MM平板（MM培养基组分：1.34%YNB，4×10^-5%生物素，0.5%甲醇），挑选重组菌株。所获得工程菌株命名为Pichia pastoris CSD-2。 

2.2 里氏木霉工程菌的构建 

（1）表达载体构建 

以质粒pT-Man2为模板，利用引物（agtaatgccATGTTGTACTCATCGGCG和agtggtaccTCAGATCGCAGCGACATG）进行PCR扩增，PCR扩增条件是95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1.2min 30个循环；72℃ 7min。扩增产物凝胶回收后，先进行Nco I和Kpn I双酶切。同样，对木霉表达质粒pKDN-EG也进行Nco I和Kpn I双酶切。用T4连接酶把双酶切产物即克隆基因和表达载体4℃连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌BL21。相应的阳性克隆表达质粒命名为pKDN-Man。 

（2）原生质体制备 

接种里氏木霉菌丝于PDA平板上生长4 天；切取直径约3cm的菌落置于约60ml YEG（0.5%酵母粉、1%葡萄糖）的液体培养基中，30℃，200 rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有10-20 ml裂解酶液（Sigma L1412）酶解2-3小时；取出酶解液，加入0.7 M NaCl溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rpm，离心10 min；弃上清，加10-20 ml STC液（20%蔗糖，50mM Tris-Cl，50mM CaCl₂）悬浮，然后3000 rpm，离心10 min；加适量STC悬浮分装（150 μl/管，10⁸个/ml）。 

（3）转化与验证 

取2μg pKDN-Man DNA加入到150μl原生质体中，接着加入500μl 25%PEG轻轻混匀，室温静置25 min；然后分2-3次再加1ml 25%PEG，轻轻混匀，室温静置25min，把原生质体加到50 ml左右熔化后冷却至45-55℃的上层半固体培养基（0.1%MgSO₄, 1%KH₂PO4, 0.6%(NH₄)₂SO₄, 1%葡萄糖, 18.3%山梨醇, 0.35%琼脂糖），轻轻混匀后倒入含100μg/ml潮霉素下层基础培养基平板（2%葡萄糖，0.5%(NH4)₂SO₄, 1.5%KH₂PO₄, 0.06%MgSO₄, 0.06%CaCl₂，1.5%琼脂），28℃黑暗培养数天至转化子长出。 

按照实施例1中的方法提取转化子基因组DNA为模板，利用引物扩增目的验证转化子。利用实施例2中引物进行PCR扩增目的基因。PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃ 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析，即经过上述两个PCR反应选育和验证阳性转化子。所获得的工程菌命名为Trichoderma reesei CSD-3。 

实施例3 发酵和酶学性质测定 

3.1毕赤酵母工程菌摇瓶发酵 

将毕赤酵母工程菌CSD-2接种于5ml BMGY ( 1％酵母提取物， 2％蛋白陈， 1. 34 % YNB, 4×10^-5%生物素，l％甘油）, 30℃ 培养过夜，离心收集菌体，把菌体加入50ml BMMY诱导培养基（1％酵母提取物，2％蛋白陈，1.34 %YNB, 4×10^-5%生物素，0.5％甲醇），每12小时补加50μL甲醇，诱导培养5天，取上清液（命名为PP-Man）进行SDS-PAGE电泳检测分析，结果如图1所示。图1中箭头所指处即为重组表达的甘露聚糖酶，说明本发明的序列为SEQ ID NO:3的甘露聚糖酶在构建的毕赤酵母工程菌CSD-2中得到表达。 

3.2 里氏木霉工程菌摇瓶发酵 

将里氏木霉工程菌CSD-3接种于MM发酵培养基（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖， 2.5%玉米浆，0.44%(NH₄)₂SO₄，0.09%MgSO₄，2%KH₂PO₄，0.04%CaCl₂，0.018%吐温-80，0.018%微量元素，0.018%聚丙二醇-2000），28℃培养48小时，然后25℃诱导培养48小时，取上清液（命名为TR-Man）进行SDS-PAGE电泳检测分析，结果如图2所示。图2中箭头所指处即为重组表达的甘露聚糖酶，说明本发明的甘露聚糖酶在构建的里氏木霉工程菌CSD-3中得到表达。 

3.3 酶活测定 

本发明还提供了一种甘露聚糖酶的测定方法，该方法包括： 

以0.6%槐豆胶甘露聚糖（Sigma公司, Batch#125K0091）为底物，以0.1M 醋酸-醋酸钠（pH5.5）为缓冲液，将甘露聚糖底物37℃平衡20min，将待测酶液37℃平衡10min。取4支试管，分别加入酶液2ml，其中3支作为测定管，分别加入2ml 底物溶液，另一支作为空白管，加入5ml DNS溶液，在37℃±0.5℃水浴30分钟。然后三支测定管分别加入5ml DNS溶液，空白管加入2ml 底物溶液，在沸水浴中反应5分钟，冷却后定容至25ml。以空白管调零，在分光光度计540nn 处测吸光度。 

甘露聚糖酶酶活定义：在37℃、pH5.5的条件下，每分钟水解底物产生1μmol甘露糖所需酶液的量为一个甘露聚糖活性单位。蛋白含量测定参照Bradford法。 

按照该方法进行酶活测定，上述毕赤酵母工程菌CSD-2的摇瓶发酵上清液PP-Man的酶活为260U/mL，上述里氏木霉工程菌CSD-3的摇瓶发酵上清液TR-Man的酶活为626U/mL，说明本发明构建的两种工程菌都能高效表达甘露聚糖酶。 

下面就对本发明重组表达的序列为SEQ ID NO:3的甘露聚糖酶的理化性质进行描述。 

3.3 酶学性质分析 

（1）最适pH分析 

用pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5的缓冲液进行稀释测定，在温度55℃条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线（图3）。如图3所示：PP-Man和TR-Man的pH曲线基本一致，它们的最适pH为4.0。其中PP-Man在pH2.8-5.3的范围内，能保持60%以上的酶活；而TR-Man在pH2.7-5.8的范围内，能保持60%以上的酶活。 

（2）最适温度分析 

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，pH4.0 的条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线（图4）。如图4所示：PP-Man和TR-Man的温度曲线基本一致，它们的最适温度为60℃，且在30℃-68℃范围内能保持60%以上的酶活。 

上述结果表明，本发明构建的毕赤酵母工程菌和里氏木霉工程菌重组表达的甘露聚糖酶的最适作用pH为4.0，最适作用温度为60℃，耐酸，耐高温。 

实施例四 低能日粮中添加本发明甘露聚糖酶对肉鸡生产性能影响 

本实验在肉鸡商品日粮基础上降低150kcal/kg的代谢能，然后在日粮中添加里氏木霉工程菌重组表达的甘露聚糖酶（上述发酵上清液的冻干粉）。通过对肉鸡生产性能的评价，探讨甘露聚糖酶对低能日粮能量利用率的改善幅度。 

试验选用432只1日龄罗斯308肉用公雏，分为6个处理组，每个处理设4个重复，每个重复18只肉公鸡，采用3层笼养，饲养在人工控温的肉鸡舍。 

实验分为3组，饲喂21天。正对照组：正常商品日粮处理组；负对照组：在正对照日粮基础上降低150kcal/kg代谢能；试验组：在负对照日粮基础上添加80-120克/吨本发明的甘露聚糖酶（400000U/g）。正负对照组日粮组成如下表所示。 

基础日粮组成及营养水平 

实验结果如下： 

（1）与正对照组和负对照组相比，试验组7日龄个体重分别提高2.6%（P=0.22）、2.0%（P=0.30）；日增重比正对照组和负对照组分别高3.4%（P=0.22）、2.7%（P=0.33）；料重比在负对照日粮基础上降低了3.1%（P=0.23），育肥指数在负对照日粮基础上提高5.9%（P=0.19），并与正对照组育肥指数一致。 

（2）与正对照组和负对照组相比，试验组14日龄个体重在负对照组基础上提高2.5%（P=0.14），8～14d日增重分别比正对照和负对照组提高3.6%（P=0.12）、4.2%（P=0.07）；育肥指数在负对照日粮基础上提高5.7%（P=0.21），与正对照组育肥指数基本一致。 

（3）试验组21日龄个体重、日增重、育肥指数在负对照组基础上分别提高4.4%（P＜0.05）、6.5%（P＜0.05）、8.2%（P＜0.05）。 

实验结果显示，在减少日粮能量值的条件下，通过在日粮中添加甘露聚糖酶，仍能提高1～21日龄期肉鸡的个体重、日增重和育肥指数，降低料重比。说明本发明的甘露聚糖酶能有效提高饲料的利用率，从而减少养殖中饲料的使用量，节约粮食资源和养殖成本，增加生产效益。 

Claims (9)

1.一种甘露聚糖酶，其特征在于：所述的甘露聚糖酶的氨基酸序列为SEQID NO:1。

2.编码权利要求1所述的甘露聚糖酶的核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸的序列为SEQ ID NO:2。

3.一种甘露聚糖酶，是权利要求1所述的酶去掉信号肽后形成的，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

4.编码权利要求3所述的甘露聚糖酶的核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸的序列为SEQ ID NO:4。

5.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体包含权利要求4所述的核苷酸。

6.一种宿主细胞，所述的宿主细胞携带有权利要求5所述的重组表达载体。

7.权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。

8.权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。

9.权利要求3所述的甘露聚糖酶在制备饲料添加剂中的应用。

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