CN103289975B - 一种突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及一种突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA及其编码基因和应用。本发明对聚半乳糖醛酸酶8fnA进行定点突变，精氨酸取代8fn113位点的氨基酸序列（即113位由Thr突变为Arg）。改造后聚半乳糖醛酸酶8fnA的比活比原来提高58%，而改造后的最适温度方面也有5℃的提高。

Description

一种突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及一种突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA及其编码基因和应用。

背景技术

目前在NCBI注册的多聚半乳糖醛酸酶蛋白序列已达10760条，主要来源于植物（3485）、真菌（2604）和细菌（4179），其余来自其他物种。真菌多聚半乳糖醛酸酶主要来源于青霉属、曲霉属、根霉属、毛霉属、酵母属、克鲁维酵母属及毕赤酵母属等。与细菌及植物的多聚半乳糖醛酸酶基因进行系统进化分析，结果显示三种来源的多聚半乳糖醛酸酶明显的聚为三大类，很好的反映了它们的起源进化关系。真菌来源的多聚半乳糖醛酸酶处于完全独立的分支中，总体相似性介于11.3%～100%之间。内切聚半乳糖醛酸酶的最适pH介于3.5-5.5，最适温度介于30-50°C，已经报道的内切多聚半乳糖醛酸酶都是酸性。不同真菌来源的多聚半乳糖醛酸酶序列表现了很大的差异，但都含有4个保守性极强的结构域(175NTD、197DD、218GHG和250RIK)。其中结构域Ⅰ(NTD)和Ⅱ(DD)中的3个天冬酰氨(D)残基和结构域III(GHG)中的组氨酸(H)残基被认为与催化反应有关。目前有7个PG晶体结构报道，其中6个都来源于真菌Aspergillusniger,Fusariummoniliforme,Aspergillusaculeatus，Stereumpurpureum和Colletotrichumlupini，一个来源于细菌Erwiniacarotovora。来源于Aspergillusniger的endo-PG晶体解析显示了这类酶典型的三维结构：10个完整的转角组成一个右手螺旋，此螺旋含有4个平行的β折叠，一个小的α螺旋在N端覆盖了酶内部的疏水中心，无规卷曲loop在螺旋外部形成了一个口袋，口袋通道中的Asp(180),Asp(201)、Asp(202)与酶的催化活性相关，而His(223)、Arg(256)和Lys(258)则与底物结合有关。

果胶内切聚半乳糖醛酸酶在多个领域都有广泛的应用，当前应用最广的是在果蔬汁加工中。同样，内切聚半乳糖醛酸酶在饲料生产中也有很大的应用前景。饲料中的菜粕、豆粕、麸皮等原料都含有大量的果胶质，由于动物体内缺乏降解果胶的酶类，因而果胶被认为是动物饲料中的抗营养因子。已有实验证明将内切聚半乳糖醛酸酶添加到饲料中作用于果胶质能随机地从多聚半乳糖醛酸链内部消解α-1,4-糖苷键，产生聚合度为10～14的寡聚半乳糖醛酸，或从寡聚半乳糖醛酸链的非还原末端消除单个半乳糖醛酸，产生聚合度逐步降低的寡聚半乳糖醛酸链和半乳糖醛酸单体，从而降低食糜的粘度，提高营养物质的利用率。

目前国内饲料产业中果胶酶的应用还未得到推广，主要原因之一是缺乏性质优良适合饲用的酶种。与果蔬汁应用的酸性聚半乳糖醛酸酶不同，理想的饲用聚半乳糖醛酸酶应是高比活、pH中酸性。已有研究报道的大部分真菌来源聚半乳糖醛酸酶多为酸性，目前市场上性质优良的果胶酶产品多来自于国外酶制剂企业如诺维信等并且主要用于果蔬汁生产，饲用果胶酶产品则相对缺乏。因此研发pH中酸性具有高比活优良性质的饲用果胶酶将有力促进这一新兴酶种在饲料产业中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA。

本发明的再一目的是提供编码上述突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA的应用。

本发明对聚半乳糖醛酸酶8fnA（其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示）进行定点突变，精氨酸取代8fn113位点的氨基酸序列（即113位由Thr突变为Arg）。

因此突变后的聚半乳糖醛酸酶8fnA氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：

MIPSVLILSLGALAAANPLPAKRASCTFTDAASAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLD

LTKLNDGTKVIFSGKTSFGYKEWAGPLISVSGNNIHVEGAPGHVIDGNGAKWWD

RKGSNGGKKKPKFFYAHSMKNSNIKGLNVKNTPVQAFSINGAENLGVYDVHLDN

SAGDSQGGHNTDAFDVGSSNGVYISGAVVKNQDDCLAINSGTNITFTGGSCSGGH

GLSIGSVGGRKDNTVKTVRILNSSISNSQNGVRIKTVYGAKGSVSDVEYSGITLSNI

SKYGIVIEQDYENGSPTGKPTNGVPITDLTVKGVTGTVKSGATDVYILCAKGACSN

WKWSGVSVTGGKKSSKCSNVPSPASC

本发明提供了编码上述突变后的聚半乳糖醛酸酶8fnA的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：

atgattccgt cggtcctcat tctttccctc ggcgccctgg cggcggccaa cccgctcccc60

gccaagcgcg cgagctgcac ctttaccgat gctgcctctg ccatcagcgg caagaagagc120

tgcagcacca tcaccctcaa ggacatcacc gtccccgccg gcaccacgtt ggacctcaca180

aagctcaacg acggcaccaa ggtcatcttc tccggcaaga cctccttcgg ctacaaggaa240

tgggccgggc ctctcatctc cgtctccggc aacaacatcc acgtcgaggg cgcccccggc300

catgtcatcg acggcaacgg tgccaagtgg tgggacagta agggtagcaa tggcggcaag360

aagaagccca agttcttcta cgcccatagc atgaagaact ccaacatcaa gggactcaac420

gtgaagaaca cgcccgtcca ggccttcagc atcaacggcg ctgaaaacct cggagtgtac480

gacgtccacc tcgacaactc ggccggcgac tcccagggcg gccacaacac cgacgcgttc540

gacgtcggtt cgtccaacgg cgtctacatc tcgggtgccg tggtcaagaa ccaggacgac600

tgcctggcca tcaactccgg caccaacatc accttcaccg gcggctcgtg cagcggcggc660

cacggcctgt ccatcggctc ggtcggcggg cgcaaggaca acacggtcaa gacggtgcgc720

atcctcaact cgtccatcag caactcgcag aacggcgtgc gcatcaagac cgtctacggc780

gccaagggct ccgtgtcgga cgtcgagtact cgggcatcac actgtccaac atcagcaagt840

acggcatcgt catcgagcag gactacgaga acggctcgcc caccggcaag cccaccaacg900

gcgtgcccat caccgacctg accgtcaagg gcgtcaccgg caccgtcaag tcgggcgcca960

ccgacgtcta catcctctgc gccaagggcg cctgctccaa ctggaagtgg tctggcgtca1020

gcgtcaccgg cggcaagaag tcgtccaagt gtccaacgtt cccagccctg cctcttgc1080

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本发明通过过Overlap PCR的方式引入突变，获得聚半乳糖醛酸酶8fnA以及编码基因。本发明还提供了包含上述聚半乳糖醛酸酶8fnA基因的重组载体，命名为pPIC9γ-8fnA。将本发明的聚半乳糖醛酸酶8fnA基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的纤维素酶基因插入到质粒pPIC9上的SnaBI和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9γ-8fnA。

本发明还提供了包含上述pPIC9γ-8fnA基因的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株GS115/8fnA。

本发明还提供了一种制备聚半乳糖醛酸酶8fnA的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；

3)回收并纯化所表达的聚半乳糖醛酸酶8fnA。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/celH61。

本发明还提供了上述聚半乳糖醛酸酶8fnA的应用。

饲料中的菜粕、豆粕、麸皮等原料都含有大量的果胶质，而动物体内缺乏降解果胶的酶类。聚半乳糖醛酸酶8fnA具有最适温度为中低温，最适pH为5.0，高比活等特性，这些性质使其在中酸性的肠道内能有效发挥作用，对肠道内饲料中的果胶质进行讲解，从而提高饲料营养转化率。因此，8fnA具有较强的饲料酶制剂的应用潜力。

针对8fnA应用潜力的评价，我们进行了8fnA对玉米粉、麸皮、豆粕、棉籽粕、菜粕原料的应用试验。试验结果表明，8fnA在模拟肠道条件下作用2h，对两种果胶质含量高的饲料原料菜粕和麸皮效果明显，分别比对照组的还原糖量增加10.08%和5.15%，而对其他原料作用不明显。

附图说明

图1半乳糖醛酸酶突变PCR示意图。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

（1）Phialophora sp.培养基为马铃薯培养基：1000mL200g土豆煮汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH5.0。

（2）大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。

（3）BMGY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，0.00004%Biotin，1%甘油(V/V)。

（4）BMMY培养基：除以0.5%甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1

1、突变基因的获得：

以来源于Chaetomiaceae sp.SZ8的内切聚半乳糖醛酸酶8fn的基因序列进行改造，通过Overlap PCR的方式引入突变，并对其进行测序，获得突变基因。

突变包括四条PCR引物：：8fn F、8fn R、R F、R R

引物序列如下：

8fn F5'-CTGCCTACGTAAACCCGCTCCCCGCCA-3'

8fn R5'-TTAGCGGCCGCCTAGCAAGAGGCAGGG-3'

R F5'-CAAGTGGTGGGACAGTAAGGGTAGCAATG-3'

R R5'-CCATTGCTACCCTTACTGTCCCACCACTTG-3'

重叠延伸PCR法是通过3个PCR反应来完成的。

PCR反应体系：

PCR1

PCR1程序设定：

95°C，5min；94°C30sec,60°C30sec,72°C，1min,30个循环；72°C，8min；10°C，hold。

PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA回收试剂盒进行胶回收，溶于20ulddH₂O，命名为R R。

PCR2：

PCR2程序设定：

95°C，5min；94°C30sec,60°C30sec,72°C，1min,30个循环；72°C，8min；10°C，hold。

PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA回收试剂盒进行胶回收，溶于20ulddH₂O,命名为R F。

PCR3

PCR程序设定：

95°C，5min；94°C30sec,60°C30sec,72°C，1min30s,30个循环；72°C，8min；10°C，hold。

PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，切去1kb作用的条带，用DNA回收试剂盒进行胶回收，溶于20ulddH₂O。

将PCR产物连接pEasy-T3载体，转入TransI感受态细胞，挑取单克隆，送去测序，筛选出突变基因。

2、8fnA表达载体的构建

用PCR扩增全长：

PCR体系：

PCR程序设定：

95°C，5min；94°C30sec,60°C30sec,72°C，1min30s,30个循环；72°C，8min；10°C，hold。

PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，切去1kb作用的条带，用DNA回收试剂盒进行胶回收，溶于20ul ddH2O。

将8fn与克隆载体pPIC9γ分别进行限制性内切酶SnaB I/Not I双酶切，酶切条件如下：

37℃酶切2h，电泳后分别回收两个目的片段，用T4DNA连接酶连接，连接体系如下：

16℃过夜，电泳检测结果显示有大约9kb的片段，说明连接成功，构建得到p8fnA载体（8fnA为单点突变改造后的聚半乳糖醛酸酶基因的代号）pPIC9γ-8fnA。

3、8fnA克隆载体转化毕赤酵母GS115及工程菌的筛选

3.1受体感受态细胞的制备：将毕赤酵母GS115菌株在YPD平板上划线，30°C培养48h，挑取生长茁壮的单菌落于20mL YPD液体培养基中，30°C、200rpm摇床培养48h；将活化的新鲜GS115菌液按0.1%的比例接种于100mL的YPD中，200rpm，30°C培养至OD₆₀₀约1.3，放置冰上预冷；将菌液转移至预冷的离心管中，4°C、2000g离心5min，弃上清，用500mL预冷的无菌水重悬菌体；将重悬菌体在4°C，2000g离心5min，沉淀再用250mL预冷的无菌水重悬；将重悬菌体在4°C，2000g离心5min，用20mL预冷的1mol/L山梨醇溶液重悬沉淀；将重悬的菌体沉淀在4°C，2000g离心5min，用1mL预冷的1mol/L的山梨醇溶液重悬；对重悬细胞悬浮液分别以80μL分装到1.5mL的EP管中，并保存在-70°C，备用。

3.2电击转化：将线性化的质粒溶于10μL无菌水，取80μL已制备好的GS115感受态细胞与之混匀，后将其转至预冷的电转杯中；调整基因导入仪的参数为电压2kV，电击；电击完成后立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，在室温静置30min后，涂布于MD平板上，倒置于30°C培养箱中培养2天；

3.3酵母转化子的筛选：用灭菌牙签从MD板上挑取单克隆，按先后次序标号，先点到MM上，再点到相应编号的MD平板上；将两平板置于30°C培养箱中培养2天。按编号挑取正常生长的转化子接种于3mL BMGY培养基中，装有BMGY培养基的离心管需要严格无菌且包有八层纱布，将其置于30°C、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液置于3000g离心10min，去上清，向离心管中加入1mL含有0.5%甲醇的BMMY培养基，在30°C、260rpm诱导培养。诱导培养48h后，将菌液置于12000rpm离心3min，取上清检测活性，从中筛选出具有多聚半乳糖醛酸酶活性的转化子；

3.4目的基因在毕赤酵母中摇瓶水平的表达：将含有较高的多聚半乳糖醛酸酶酶活菌株接种于300mL BMGY培养基的1L三角瓶中，置于30°C，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100mL含有0.5%甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30°C，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5%，同时取上清用于酶活性检测。

4、本发明所述的突变聚半乳糖醛酸酶活力的测定

4.11个多聚半乳糖醛酸酶的活性单位(U)定义：在给定的条件下，每分钟分解多聚半乳糖醛酸生成1μmolD-(+)-半乳糖醛酸所需的酶量。

4.2重组酶反应最适pH和pH稳定性的测定：

将纯化好的重组突变聚半乳糖醛酸酶在39°C下，不同pH的底物中进行酶学反应，以测定其最适pH。所用缓冲液为：pH2.0–7.0的McIlvaine缓冲液(0.2M磷酸氢二钠/0.1M柠檬酸)，pH8.0–9.0的0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液，以及pH10.0–12.0的Gly-NaOH缓冲液。

pH稳定性测定：将浓缩后的纯酶液在不同pH值的缓冲液中置于37°C下处理1h，用最适pH的缓冲液作适当稀释，在最适pH和最适温度的条件下测定剩余酶活性。

重组酶反应最适温度的测定：在最适pH的缓冲液中及不同温度下(0–80°C)测定活性以确定最适温度。

4.3重组酶比活、Km值及Vmax的测定重组酶

参照李宁的方法(李宁,2009)，测定反应的一级反应时间。确定测定Km及Vmax的反应时间为3min。用不同浓度的多聚半乳糖醛酸(0.5，0.4，0.25，0.2，0.2，0.175，0.15、0.1、0.05%)为底物，在最适条件下测定酶活性，计算出相应的反应速度，利用GraphPad Prism5软件计算Km值及Vmax。

按照Bio-Rad试剂盒的方法，绘制标准曲线。测定方法：首先通过标准曲线计算目的蛋白的含量，其次是在最适条件下测得重组酶的酶活，用酶活数除以蛋白的浓度可得酶的比活。比活力的定义为：每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数。

5．应用实验的测定

5.1原料的处理：5g干物质、20ml的缓冲液，总体积25ml，含水量80%，沸水浴处理5min；

5.2体外环境消化：40℃，pH6.5；

5.3实验设计酶的添加量为500U/g底物

5.4实验操作步骤：

称取2g待测原料置于三角瓶中，添加8ml pH6.5缓冲液，至40℃恒温震荡2h，检测其还原糖指标。即将反应完后的样品10000rpm离心5min，取上清1ml，加入1.5ml DNS，充分混匀，沸水浴反应5min，测定其540nm下的吸光值。

实验结果：

对改造前后的聚半乳糖醛酸酶的性质测定，结果如下：

改造前的比活20387.82U/mg，改造后的比活比原来提高58%，而改造后的最适温度方面也有5℃的提高。

Claims (9)

1.一种突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA基因，其特征在于，编码权利要求1所述的突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA。

3.如权利要求2所述的突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

4.包含权利要求2所述突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为载体pPIC9γ-8fnA，将权利要求2所述突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA基因插入到质粒pPIC9上的SnaB I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9γ-8fnA。

6.包含权利要求2所述突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA基因的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

8.一种制备权利要求1所述突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；

3)回收并纯化所表达的聚半乳糖醛酸酶8fnA。

9.权利要求1所述聚半乳糖醛酸酶8fnA在饲料工业中的应用。