CN105176948B - 一种突变的多聚半乳糖醛酸酶pg63t108y及其编码基因和应用 - Google Patents

一种突变的多聚半乳糖醛酸酶pg63t108y及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63T108Y及其编码基因，涉及基因工程和遗传工程领域。本发明以来源于Penicillium sp.CGMCC 1669的多聚半乳糖醛酸酶PG63作为母本，经理性设计和分子生物学技术而获得的催化效率提高的多聚半乳糖醛酸酶突变体PG63T108Y。涉及到的氨基酸突变点为Thr108Tyr。改造后的多聚半乳糖醛酸酶PG63T108Y催化效率较原酶提高了9倍。

Description

一种突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63T108Y及其编码基因和 应用
技术领域
本发明涉及一种突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63T108Y及其编码基因和应用，具体地，本发明涉及利用理性设计和分子生物学技术而获得的催化效率提高的多聚半乳糖醛酸酶突变体，属于基因工程和遗传工程领域。
背景技术
我国果蔬汁生产规模逐年扩大，目前在商品化的果胶酶主要有黑曲霉等真菌来源的复合果胶酶酶系，也有单一的果胶水解酶、果胶裂解酶和果胶酯酶酶种。从质量上看，国内自主研发的果胶酶还普遍存在酶活力不高，稳定性较差的问题。相对而言，进口果胶酶如诺维信、杰能科品牌的产品系列则在酶学性质上更为优良和稳定。目前国内果蔬汁生产企业对进口果胶酶的依赖程度很大，导致生产成本提高。而国内果胶酶酶制剂研发生产也存在来源单一，竞争力不够的局面。各生产企业缺乏自主创新的果胶酶是目前生产中突出的问题，因此研发具有优良性质的食品工业用果胶酶将有力促进我国果蔬汁饮料产业发展，同时显著提高国产果汁产品的质量。造成以上局面的一个主要原因是果蔬汁生产条件对应用的果胶酶的酸碱性质有着特定的要求。很多不同来源的果胶酶已被报道发表，但其性质均不能满足实际生产条件的需求。比如，苹果汁自然pH值范围为3.5-4.5，这就需要所使用的酶具有适酸性质，在pH2至pH5的范围内都保持较高的活性。同时，为防止污染和果汁褐化，果汁榨取温度一般控制在30—50℃，因此在最适温度在40℃以及在20—50℃中低温范围内能保持高活性的低温果胶酶才能高效地发挥作用。在酸性pH环境和中低温范围内保持稳定并具有高酶活的果胶酶被认为是果蔬汁生产行业中性质优良的工业用酶。
果胶酶的来源广泛，存在于多种微生物中，如真菌、放线菌和细菌等。由于真菌中的黑曲霉属于公认安全级，市售食品级的果胶酶仍主要来源于黑曲霉，其最适pH值一般在酸性范围，在实际生产条件下能表现出稳定的活性。虽然目前市场上已存在多种曲霉来源的果胶酶复合酶系或是单独应用的酶种，但商业酸性果胶酶的研发主要还是以大量筛选为主，针对果蔬汁用果胶酶适酸性机制的研究以及对酶学性质进行改良的研究报道从90年代至今国内外几乎都是空白。因此，获取具有高催化效率的果胶酶是当前的研发趋势。
发明内容
本发明的目的是提供一种突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63T108Y。
本发明的再一目的是提供编码上述突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63T108Y的编码基因。
本发明的另一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供一种制备上述突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63T108Y的基因工程方法。
所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(对多聚半乳糖醛酸酶PG63的108位氨基酸进行定点突变，Thr108Tyr)。
MLLSTHSIVLGLLGSTSLALASPAAEPAEGNRLIPRGSACTYSGVNGAAAAIAGKAGCSSITLNNVAVPAGTTLDLTGLAAGTKVIFEGTTTFGHKQWVGPLISISGYNIAVSGAAGHVIDGQGARWWDGKGSNTKTNIKPKFFLAHNLKGASTITGLNIKDTPVQVFSIDSSSGLTISGVTIDNRNGDKGSLGHNTDGFDIGDSDHITITGATVYNQDDCLAINSGTNIIFSGGYCSGGHGLSIGSVGGRSNNVVDTVHISSTQVVNSQNGVRVKAVAGATGSIKGVTYQDITLSGITSQGVTIRQDYTNSGYTGNPTTQVPITGLTLNNVHGTVTSSGTDITVECGSAASCSGWTWTKVAVSGGKADLCKNAPANTC
所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
ATGTTGTTATCGACACACAGTATTGTTCTGGGCTTGCTAGGCTCAACGTCCTTGGCCCTCGCTTCTCCAGCTGCCGAACCGGCTGAAGGGAACAGACTCATCCCTCGTGGATCTGCTTGCACCTATTCAGGAGTCAATGGTGCAGCTGCAGCGATAGCCGGAAAGGCAGGTTGCTCCAGTATTACTCTCAATAACGTTGCAGTGCCTGCCGGGACTACGCTGGATTTGACTGGTCTGGCCGCGGGTACCAAGGTGATATTTGAGGGAACCACTACTTTCGGCCATAAGCAGTGGGTGGGCCCTCTGATCTCCATCTCTGGGTACAACATCGCAGTTTCTGGGGCTGCCGGTCACGTCATTGATGGCCAAGGTGCCCGCTGGTGGGATGGAAAGGGTTCCAACACCAAGACCAATATCAAACCTAAGTTCTTCCTCGCCCACAATCTCAAGGGAGCCTCCACTATTACGGGGTTGAACATCAAGGATACTCCCGTTCAGGTCTTCAGCATCGATAGCTCGTCGGGTCTGACGATCAGTGGTGTCACAATTGACAACAGAAATGGTGATAAGGGTTCTCTCGGTCACAACACCGACGGGTTCGATATCGGCGACAGTGATCACATTACCATCACTGGTGCTACAGTTTATAACCAAGACGACTGCCTGGCCATCAATTCTGGGACGAACATTATTTTCTCCGGCGGTTACTGCTCTGGTGGGCACGGATTGTCTATCGGCTCAGTCGGTGGCCGTTCCAATAATGTGGTAGACACCGTCCATATCAGCAGCACCCAGGTCGTCAACTCTCAGAATGGTGTCCGTGTCAAAGCTGTCGCTGGCGCCACCGGTAGTATCAAAGGCGTGACTTACCAGGATATTACCCTCTCCGGCATTACGAGCCAGGGAGTCACCATCCGCCAAGACTACACCAATTCTGGCTACACTGGAAACCCCACGACCCAGGTTCCAATCACTGGACTCACCTTGAATAATGTGCACGGCACGGTCACATCCAGTGGCACCGATATCACCGTCGAGTGTGGAAGTGCTGCCAGTTGTTCAGGCTGGACTTGGACTAAAGTTGCAGTCAGTGGCGGCAAGGCGGATTTGTGCAAGAATGCACCTGCCAACACTTGCTAA
本发明还是提供一种制备所述多聚半乳糖醛酸酶突变体的方法，其技术方案如下：
1)采用over-lap PCR的方法扩增所述突变体序列片段；
2)将上述突变体序列片段克隆到表达载体pPIC 9r上，重组载体命名pPIC9r-PG63T108Y；将本发明的多聚半乳糖醛酸酶突变体基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将多聚半乳糖醛酸酶基因插入到质粒pPIC9r上的SnaB I和Not I限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pPIC9r-PG63T108Y。
3)将突变体重组载体转化宿主细胞，诱导表达，获得突变株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌(毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞等)、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选将重组表达质粒转化毕赤酵母细胞，得到重组菌株GS115/PG63T108Y。
本发明还提供了一种制备所述突变体的方法，包括以下步骤：
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶表达；
3)回收并纯化所表达的突变酶。
本发明还提供了上述突变体的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高催化效率的、适合于在食品、饲料工业等领域中应用的多聚半乳糖醛酸酶。本发明的突变酶最适pH(pH3.5-4.0)与最适温度(40-50℃)均与原酶保持相当的活性范围，催化效率提高9倍，能很好的满足食品、饲料工业等领域中应用的需求，有着非常广阔的应用前景。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：表达宿主Pichia pastoris GS115，表达质粒载体pPIC9r为本实验室保存。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Promaga公司，多聚半乳糖醛酸购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(1)LB培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，pH 7.0
(2)YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖
(3)MD固体培养基：2％葡萄糖，1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin
(4)MM固体培养基：1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇
(5)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油(V/V)，1.34％YNB，0.00004％Biotin
(6)BMMY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇(V/V)
4、本实施例中未做详细具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1本发明中所述突变体所涉及的具体定点突变方法如下：
对多聚半乳糖醛酸酶PG63(Yuan et al.,2011)进行同源建模，并将突变位点设计为第108位苏氨酸突变为络氨酸。通过over lap PCR的方法引入突变位点，并对其进行测序验证，获得突变基因PG63T108Y。设计所用引物如表1所示：
表1.所述突变体PG63T108Y特异性引物
实施例2所述突变体的制备。
将表达载体pPIC9r进行双酶切(SnaB I+Not I)，同时将编码所述突变体的基因PG63T108Y双酶切(SnaB I+Not I)，切好的编码成熟所述突变体的基因片段(去除信号肽片段)与表达载体pPIC9r连接，获得含有所述突变体基因PG63T108Y的重组质粒pPIC9r-PG63T108Y并转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/PG63T108Y。
取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养基的1L三角瓶中，置于30℃，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，同时取上清用于酶活性检测。
实施例3所述突变体和野生型的活性分析
一、DNS法：具体方法如下：在给定的pH、温度条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下，每分钟分解多聚半乳糖醛酸生成1μmolD-(+)-半乳糖醛酸所需的酶量。
二、所述突变体和野生型的性质测定
1、所述突变体和野生型的最适pH测定方法如下:
将实施例2纯化的突变酶和野生型在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物多聚半乳糖醛酸用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中50℃下进行多聚半乳糖醛酸酶活力测定。结果表明，所述突变体和野生型的最适反应pH相近，为3.5-4.0，且在pH2.5-7.0范围内有相同的作用趋势。
2、所述突变体和野生型的最适温度测定方法如下:
所述突变体和野生型的最适温度的测定为在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果表明,所述突变体与野生型最适温度相近，为40-50℃，且在0-80℃下有相同的作用趋势。
3、重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体和野生型的动力学参数测定方法如下:
参照李宁的方法(李宁,2009)，测定反应的一级反应时间。确定测定Km及Vmax的反应时间为5min。用不同浓度的多聚半乳糖醛酸(1.0，0.5，0.4，0.3，0.2，0.1和0.05％)为底物，在最适条件(温度、pH)下测定酶活性，计算出相应的反应速度，利用GraFit7软件计算Km及Vmax值。
以多聚半乳糖醛酸为底物时，重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体和野生型在40℃、pH4.0下动力学参数为：
改造后突变体PG63T108Y的催化效率(kcat/Km)较野生酶提高9倍，能很好的满足食品、饲料工业等领域中应用的需求。

Claims (7)

1.一种突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63T108Y，所述多聚半乳糖醛酸酶氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
2.多聚半乳糖醛酸酶突变体基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.包含权利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组载体，其特征在于，将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的多聚半乳糖醛酸酶突变体基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，得到重组载体pPIC9r-PG63T108Y。
4.包含权利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组菌株。
5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
6.制备权利要求1所述的突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63T108Y的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
①用包含权利要求2所述的多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组载体转化宿主细胞，制备获得重组菌株；
②培养重组菌株，诱导突变的多聚半乳糖醛酸酶表达；
③将表达后的多聚半乳糖醛酸酶回收并采用亲和层析获得突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63T108Y。
7.权利要求1所述突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63T108Y作为添加剂在食品、动物饲料领域的应用。
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