CN102978182B

CN102978182B - 脂肪酶突变体

Info

Publication number: CN102978182B
Application number: CN201210590020.XA
Authority: CN
Inventors: 黄亦钧; 吴秀秀; 张青; 徐娟; 许丽红; 王华明
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2012-12-29
Filing date: 2012-12-29
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2032-12-29
Also published as: CN102978182A

Abstract

本发明涉及微生物工程技术领域，具体涉及一种脂肪酶突变体。本发明通过氨基酸残基的取代，对黑曲霉的脂肪酶进行改造，得到脂肪酶突变体。黑曲霉的脂肪酶不能耐受胰蛋白酶，但改造后的突变体蛋白对胰蛋白酶的耐受性得到显著增强。此外，本发明还构建了表达上述突变体的里氏木霉工程菌。本发明的脂肪酶突变体可以广泛应用于饲料领域。

Description

脂肪酶突变体

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种脂肪酶突变体。

背景技术

脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构（Schmid 等, 1998）。脂肪酶具有广泛的应用价值，已成为市场上的第三大工业用酶。脂肪酶可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于饲料添加剂、油脂加工、食品、医药、日化等工业。

酶学特性和酶的稳定性是影响其应用的关键因素之一；同时，很多酶学性质较好的蛋白在实际应用条件下，实际使用效果也不好。黑曲霉含有两个脂肪酶的同源基因，其中脂肪酶A研究较多（舒正玉等，2007，生物工程学报；杨江科等，2009，生物工程学报）。黑曲霉脂肪酶A的具有较好的胃酸和胃蛋白的耐受性；但是对胰蛋白酶耐受性较差（见专利申请201210497039.X）。由于动物肠道是消化和吸收脂肪的主要器官，肠道中pH接近中性同时含有大量的胰蛋白酶；因此，肠道的消化特点限制了黑曲脂肪酶A作为饲用酶制剂作用效果。

寻找和克隆合适饲用脂肪酶的途径有2个：一是筛选产新型酶的微生物；二是对酶进行适当的蛋白质工程改造。微生物菌种选育是工业生产和学术研究最常用和最简单的手段之一；但是，其缺点是工作量大，随机性强；因此往往很难筛选到理想菌株。而蛋白质工程是这些年新兴的、借用分子生物学和生物信息学的方法对蛋白进行定向突变和理性改造，而获得理想蛋白或酶方法。其优点是工作量相对较小和概率大；缺点是多数突变体蛋白酶学性质没有改变或者变得更差。因此，获得更好效果的脂肪酶突变体一直是本领域的研究热点。

发明内容

本发明的目的是通过对黑曲霉的脂肪酶进行蛋白质工程改造，获得突变体蛋白,提高其对胰蛋白酶的耐受性，从而有利于脂肪酶在饲料领域的广泛应用。

本发明的一种脂肪酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的脂肪酶的142位氨基酸由Lys变为His。

上述脂肪酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:2的脂肪酶突变体基因的质粒。

为了获得更好效果，对序列为SEQ ID NO:2的脂肪酶突变体进行再次突变，具体就是将氨基酸序列为SEQ ID NO:2的脂肪酶的76位氨基酸由Lys变为Gln。

此突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:5。

本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:4的脂肪酶突变体基因的质粒。

本发明还提供另一个脂肪酶突变体，是对序列为SEQ ID NO:2的脂肪酶突变体再次突变获得的，具体就是是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的脂肪酶的114位氨基酸由Lys变为Gln，135位氨基酸由Lys变为His。

上述脂肪酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:7。

本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:6的脂肪酶突变体基因的质粒。

将上述的质粒转入里氏木霉中，重组表达的突变脂肪酶对胰蛋白酶具有很好的耐受性。

本发明的3个脂肪酶的突变体在里氏木霉中表达后，体外实验结果显示单点突变体、双点突变体和三点突变体对胰蛋白酶的耐受性分别提高了32.7%，110%和152%。三个突变体均没有改变野生型脂肪酶原有的酶学性质, 最适pH为5.0，最适温度为30℃，对胃液和胃蛋白酶的耐受性与野生型脂肪酶相同。本发明提供的脂肪酶突变体可以广泛应用于饲料添加剂领域，用于提高饲料中油脂类物质的利用率。与野生型脂肪酶相比，本发明的脂肪酶突变体能显著提高肉鸡的采食量和日增重，降低料肉比，提高养殖动物的生产性能。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1 脂肪酶突变体基因的合成

申请人为了提高黑曲霉脂肪酶（氨基酸序列为SEQ ID NO: 1）对胰蛋白酶的耐受性，对该酶的胰蛋白酶水解位点进行了大量突变的筛选，结果发现有些突变对胰蛋白酶的耐受性没有影响，有些突变甚至使耐受性更差了，另外还有些突变，虽然能提高对胰蛋白酶的耐受性，但突变后脂肪酶的酶学性质发生了显著的变化，均不符合要求。最终，申请人获得了既能显著提高胰蛋白酶活性，又不会影响脂肪酶原有酶学性质的突变位点及位点的组合：K142H单点突变，K76Q和K142H两点突变，K114Q，K135H和K142H三点突变。

K142H单点突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO: 2，参照该序列合成一个编码核苷酸序列SEQ ID NO: 3（命名为Mut-1）；K76Q和K142H两点突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO: 4，参照该序列合成一个编码核苷酸序列SEQ ID NO: 5（命名为Mut-2）；K114Q，K135H和K142H三点突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO: 6，参照该序列合成一个编码核苷酸序列SEQ ID NO: 7（命名为Mut-3）。3个序列均是依照里氏木霉的密码偏爱性而优化合成，并且在合成序列5’和3’两端分别加上KpnI和XbaI两个酶切位点。上述基因合成工作由上海生工生物工程股份有限公司完成。

实施例2 脂肪酶突变体的表达

2.1 表达载体的构建

将实施例1合成的3个序列分别进行KpnI和XbaI过夜双酶切，然后凝胶回收目的片段Mut-1、Mut-2和Mut-3；同样，对木霉表达载体pTG（含潮霉素hph基因）进行KpnI和XbaI双酶切和回收；将回收基因片段和载体进行16℃过夜连接并转化大肠杆菌DH5a，最后获得了木霉表达质粒，3个表达质粒分别命名为pT-Mut-1，pT-Mut-2和pT-Mut-3。

2.2转化和筛选

（1）原生质体制备

接种里氏木霉菌丝于PDA平板上生长4 天；切取直径约3cm的菌落置于约60ml YEG（0.5%酵母粉、1%葡萄糖）的液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有10-20ml裂解酶液（Sigma L1412）酶解2-3小时；取出酶解液，加入0.7M NaCl溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rpm，离心10 min；弃上清，加10-20 ml STC液（20%蔗糖，50mM Tris-Cl，50mM CaCl2）悬浮，然后3000 rpm，离心10 min；加适量STC悬浮分装（150 μl/管，108个/ml）。

（2）转化与验证

取2μg 表达质粒（pT-Mut-1，pT-Mut-2和pT-Mut-3）分别加入含150μl原生质体管中，接着加入500μl 25%PEG轻轻混匀，室温静置25min；然后分2-3次再加1ml 25%PEG，轻轻混匀，室温静置25min，把原生质体加到50 ml左右熔化后冷却至45-55℃的上层半固体培养基（0.1%MgSO4, 1%KH2PO4, 0.6%(NH4)2SO4, 1%葡萄糖, 18.3%山梨醇, 0.35%琼脂糖），轻轻混匀后倒入含100μg/ml潮霉素下层基础培养基平板（2%葡萄糖，0.5%(NH4)2SO4, 1.5%KH2PO4, 0.06%MgSO4,0.06%CaCl2，1.5%琼脂），28℃黑暗培养数天至转化子长出。

挑取转化子过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS); 然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl 10M NH4AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000 rpm离心10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。

以上述提取转化子基因组DNA为模板，利用引物For-pri和Bac-pri进行PCR扩增目的基因进行验证。

For-pri：ATGTTCTCCGGCCGGTTTGG

Bac-pri：GCAGACACTCTGAAATAGCG

PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 40S；55℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃ 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析，从而获得含目的基因的木霉工程菌；其中，表达质粒pT-Mut-1，pT-Mut-2和pT-Mut-3分别导入里氏木霉宿主菌中，获得了里氏木霉工程菌分别命名为WX-1（Trichoderma reesei WX-1）、WX-2（Trichoderma reesei WX-2）和WX-3（Trichoderma reesei WX-3）。

实施例3 发酵验证和酶学性质测定

将上述三株里氏木霉工程菌（WX-1，WX-2和WX-3）分别接种于MM发酵培养基（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44%(NH₄)₂SO₄，0.09%MgSO₄，2%KH₂PO₄，0.04%CaCl₂，0.018%吐温-80，0.018%微量元素，0.018%聚丙二醇-2000），28℃培养48小时，然后25℃培养48小时，分别取上清样品，测定酶活和分析酶学性质，并与野生型脂肪酶进行比较。野生型脂肪酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，由里氏木霉工程菌ZQ-1(CCTCC NO: M2012483)重组表达。

最适pH分析：用pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的缓冲液进行稀释测定，并在40℃条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果显示：与野生型相比，上述三个突变体最适pH值没有改变，最适pH为5.0。

最适温度分析：分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，pH7.5条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果显示：与野生型相比，上述三个突变体最适温度没有改变，最适温度为30℃。

实施例4 体外酶解的实验

（1）胃液、胃蛋白酶耐受性：

用pH5.5的缓冲液稀释发酵液到适当的酶活，调节pH至2.0后取上述两样品各8 ml分别加入到2ml胃液、胃蛋白酶（5%）中，37℃处理2 h后测残余酶活，以未处理的酶活为100%。结果显示：本发明的脂肪酶突变体对胃液和胃蛋白酶的耐受性与野生型几乎相同，具体结果如下：

A．野生型蛋白在胃液处理后，剩余酶活为50.0%；胃蛋白酶处理后，剩余酶活为67.2%。

B．单点突变体Mut-1在胃液和胃蛋白酶处理后，剩余酶活分别为49.2%和66%。

C．双点突变体Mut-2在胃液和胃蛋白酶处理后，剩余酶活分别为50.2%和67.0%。

D．三点突变体Mut-3在胃液和胃蛋白酶处理后，剩余酶活分别为51.1%和66.4%。

（2）pH6.8、胰蛋白酶耐受性

用pH5.5的缓冲液稀释发酵液到适当的酶活，调节pH6.8后，分别用pH6.8的缓冲液（人工肠液）和胰蛋白酶分别稀释5倍，37℃处理6 h后测残余酶活，以未处理的酶活为100%。结果显示：本发明的脂肪酶突变体对pH6.8缓冲液的耐受性与野生型蛋白几乎相同，但对胰蛋白酶的耐受性明显高于野生型蛋白，其中三点突变体蛋白对胰蛋白酶的耐受性最强，具体结果如下：

A．野生型蛋白分别经pH6.8人工肠液和和胰蛋白酶处理后，剩余酶活分别约为62.6%和9.8%。

B．单点突变体Mut-1 经pH6.8人工肠液和和胰蛋白酶处理后，剩余酶活分别约为61.8%和13%。

C．双点突变体Mut-2经pH6.8人工肠液和和胰蛋白酶处理后，剩余酶活分别约为62%和20.6%。

D．三点突变体Mut-3经pH6.8人工肠液和和胰蛋白酶处理后，剩余酶活分别约为61%和24.7%。

上述实验结果表明，突变后的脂肪酶对胰蛋白酶的耐受性得到显著的提高，尤其是三点突变体（Lys114Gln、Lys135His和Lys142His）对胰蛋白酶的耐受性最强，因此更适合于在饲料领域的应用。

实施例5 脂肪酶突变体对肉鸡生产性能的影响实验

1. 材料与方法

1.1 试验动物与分组

六和种鸡场提供的罗斯肉雏鸡300只，随机分为3个处理，每个处理10个重复，每个重复10只肉鸡。具体分组设计见表1。

表1 试验分组设计

组别	处理说明	样品添加
			正对照组	正常商品料	0
负对照组	-75 Kcal/kg（鸡鸭油）	0
			试验组1	-75 Kcal/kg（鸡鸭油）	250g/t 野生型脂肪酶（20000U/g）
试验组2	-75 Kcal/kg（鸡鸭油）	250g/t 脂肪酶突变体（20000U/g）

1.2 试验样品

本试验选用本发明实施例3制备的脂肪酶突变体Mut-3和野生型脂肪酶。

1.3 测定指标

分别在肉鸡0d、7d、21d、35日龄时，对各栏试验鸡统一进行称重并记录采食量，计算日增重（ADG）、日采食量（ADFI）、料肉比（FCR）和体重（BW）等指标。

1.4 数据处理与分析

试验数据采用SPSS13.0统计软件中ANOVA方法进行分析，所有指标以每个重复为试验单位，用Duncan’s多重比较进行检验。结果用均值及平均标准差表示，P < 0.05为差异显著。

2．结果与分析

本发明的脂肪酶突变体对0-35日龄肉鸡生产性能影响

表2脂肪酶突变体对0-35日龄肉鸡生产性能的影响

注：表中数字右上角字母有相同字母或没有标注者者表示差异不显著（P＞0.05），字母不同表示差异显著（P＜0.05）

由表2肉鸡0-35d试验结果可知，全期来看试验组1肉鸡日增重在正对照组基础上提高了2.72%，在负对照组基础上提高了4.30%，料肉比在负对照组基础上降低了0.02%；而试验组2肉鸡日增重在正对照组基础上提高了3.51%，在负对照组基础上提高了4.30%，料肉比在负对照组基础上降低了0.057%。试验组1和2肉鸡日增重、采食量均高于正对照组和负对照组。在此阶段负对照组即降低油脂组，在采食量、日增重和料肉比等方面均不及其它组。试验组1和2全期增重料肉比均较好，优于其它各组。但总体来看，试验组2比试验组1的优势更为明显。

实验结果表明，本发明的脂肪酶突变体能提高饲料中油脂类物质的利用率，且与野生型脂肪酶相比，脂肪酶突变体能显著提高肉鸡的采食量和日增重，降低料肉比，提高肉鸡的生产性能。

Claims

1.一种脂肪酶突变体，所述的脂肪酶突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的脂肪酶的142位氨基酸由Lys变为His；其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

2.一种脂肪酶突变体，所述的脂肪酶突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的脂肪酶的76位氨基酸由Lys变为Gln；其氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

3.一种脂肪酶突变体，所述的脂肪酶突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的脂肪酶的114位氨基酸由Lys变为Gln，135位氨基酸由Lys变为His；其氨基酸序列为SEQ ID NO:6。

4.一种重组质粒，所述的重组质粒为携带有编码权利要求1-3任一项所述的脂肪酶突变体基因的质粒。